CN104726375A - 催化秦皮甲素酯交换反应的细菌细胞催化剂的制备方法 - Google Patents

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李晓凤
赖学能
赵光磊
吴晖
余以刚
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    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin

Abstract

本发明公开了催化秦皮甲素酯交换反应的细菌细胞催化剂的制备方法。该方法是将细菌种子液按照接种量为0.5%~25%（v/v）接种至液体培养基中，在25℃~60℃下培养12 h~96 h；菌体经蒸馏水洗涤后真空冷冻干燥收获菌体干粉，即为细菌细胞催化剂。该催化剂用于高选择性催化秦皮甲素与酰基试剂发生转酯反应。本发明所获得的细菌全细胞催化剂，与酶制剂相比，避免了昂贵与冗繁的酶分离纯化过程；易于制备与回收的特点更加有利于规模化生产；在有机溶剂中更加稳定。

Description

催化秦皮甲素酯交换反应的细菌细胞催化剂的制备方法
技术领域
本发明属于微生物培养、生物催化及生物医药制备领域，涉及催化秦皮甲素酯交换反应的细菌细胞催化剂的制备方法。
背景技术
黄酮类化合物是两个苯环通过三个碳原子相互连接而形成的一系列重要的多酚类化合物，广泛存在于几乎所有的植物,尤其是蔬菜和水果；在医药、食品和化妆品上有很大的应用价值。黄酮有多种生物活性包括抗氧化活性,抗炎,抗癌的,抗菌,抗过敏,和抗病毒等，然而,由于其多羟基结构的特点，大部分黄酮生物活性受限于其低脂溶性或水溶性。位于苯环或配糖体骨架上的羟基对黄酮的生物和化学活性有重要的影响。黄酮的酯化被认为一种很有前景的方法用于提高黄酮的溶解度,从而使黄酮展示出更多的生理活性。已有研究表明,有选择地修饰黄酮类化合物结构不仅可以提高物理化学属性,例如,热稳定性和光阻系数;而且增强其生物活性,如抗氧化活性;抗菌活性;细胞渗透能力;减肥和降血脂功能等。秦皮甲素具有抗炎、抗菌、抗血凝、镇痛等活性。
目前黄酮酯类衍生物的合成均采用化学催化剂或者离体酶催化剂。由于黄酮的苯环或糖环上羟基众多，且反应活性相似，采用化学催化剂时存在的主要问题是反应区域选择性很低，易产生大量的副产物及含碱废液，对环境造成严重污染。酶催化剂较之化学催化剂更为绿色，且区域选择性高，反应条件温和，但是由于酶的分离纯化过程复杂且在此过程中酶活性有部分损失，在立体环境中不稳定，易失活等缺点，且酶的价格昂贵，造成酶法反应成本较高，这些方面均严重制约了其在工业化的应用。因此，研究开发新型绿色催化剂用于黄酮酯的制备具有重大的现实意义。
发明内容
本发明针对现有用于秦皮甲素酯合成的催化剂的不足，目的在于提供一种新型的具有催化秦皮甲素酯合成反应的细菌催化剂的制备方法。
本发明的一种可催化秦皮甲素酯合成反应的细菌细胞催化剂的制备方法，其制备方法简单易操作，原材料价廉易购买，不涉及酶的分离纯化。所制备的细菌细胞催化剂可选择性催化合成秦皮甲素6′-单酯，区域选择性高于90%，从而克服了传统化学方法的选择性低导致底物利用率低，产物纯度低，易生成副产物等缺点。同为绿色, 反应条件温和的生物催化剂，细胞催化剂较之离体酶催化剂具有稳定性高，价廉、易获取的优点。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种催化秦皮甲素酯合成反应的细菌细胞催化剂的制备方法，包括以下步骤：
1）将细菌种子液按照接种量为0.5%~25%（v/v）接种至液体培养基中，在25℃~60℃下培养12 h~96 h；
2）菌体经蒸馏水洗涤后真空冷冻干燥收获菌体干粉，即为细菌细胞催化剂。
上述方法中，细菌包括施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri 或铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 。
上述方法中，所述液体培养基成分为：0.1~100 g/L产酶诱导剂，0.1~50 g/L有机氮源，0.1 ~10 g/L MgSO4·7H2O， 5 g/L (NH4)2SO4和1 g/L K2HPO4。
上述方法中，所述产酶诱导剂包括饱和植物油脂、不饱和植物油脂、Tween系列或Span系列中的一种以上；所述Tween系列包括Tween80或Tween60；所述Span系列为Span 60或Span 40。
上述方法中，所述有机氮源包括牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨、干酪素、酸水解酪蛋白胨或无氨基酵母膏中的一种以上。
本发明所用细菌公众可以从菌种中心购买或自己筛选得到。
本发明与现有的技术相比具有如下的优点：
1.细菌细胞催化剂为生物催化剂，较之化学催化剂反应条件温和、环境友好，区域选择性高，选择性合成秦皮甲素的6’’-单酯，其区域选择性在95%以上，从而克服了传统化学方法产物纯度低，易生成副产物等缺点。
2. 细菌细胞催化剂营养要求很低，容易培养，培养基配方简单，制备易操作，制备成本低。
具体实施方式   
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，需要说明的是，这些实施例并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为25℃，液体培养基成分为：10 g/L大豆油， 1 g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4·7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为7.0。培养60h后离心收集湿菌体，用蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于秦皮甲素与丙酸乙烯酯的转酯化反应中，6’’-秦皮甲素丙酯为95.3%。
本发明方法得到的催化剂的区域选择性以秦皮甲素半水化合物与丙酸乙烯酯区域选择性酰化反应进行测定，反应条件为在2mL的秦皮甲素酯化反应体系中添加40mg的菌体干粉作为催化剂，以131.6μL丙酸乙烯酯作为酰基供体，秦皮甲素用量为20.9mg，反应体系为50% ( v/v）吡啶-异辛烷，反应温度为40℃，振荡速度180rpm，常压下反应。反应区域选择性表征为：6’’-秦皮甲素丙酯的产量/黄酮酯的总产量。
实施例2
将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为60℃，液体培养基成分为：10 g/L Tween 80， 1 g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4·7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为7.0。培养60h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于秦皮甲素半水化合物与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-秦皮甲素丙酯区域选择性为95.4%。
实施例3
将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为25%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：10 g/L Tween 80， 10 g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4·7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养12h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于秦皮甲素半水化合物与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-秦皮甲素丙酯区域选择性为98.1%。
实施例4
将包括铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.46种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为25%（v/v），培养条件为40℃，液体培养基成分为：10 g/L Tween 80， 10 g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4·7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养96h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于秦皮甲素半水化合物与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-秦皮甲素丙酯区域选择性为98.8%。
实施例5
将包括施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri GIM1.273种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：100 g/L Tween 80， 10 g/L 牛肉膏，0.2 g/L MgSO4·7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养60h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于秦皮甲素半水化合物与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-秦皮甲素丙酯区域选择性为98.5%。
实施例6
将包括施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri GIM1.273种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：100 g/L大豆油， 1 g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4·7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养60h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于秦皮甲素半水化合物与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-秦皮甲素丙酯区域选择性为96.4%。
实施例7
将施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri GIM1.273种子液转接至液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：0.1  g/L 葡萄糖，30 g/L酵母膏，50 g/L牛肉膏， 0.5 g/L MgSO4·7H2O ， 5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4 ，pH为7.3。培养12h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于秦皮甲素半水化合物与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-秦皮甲素丙酯区域选择性为97.5%。
实施例8
将包括施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri GIM1.273种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.5%（v/v），培养条件为40℃，液体培养基成分为：0.1 g/L span 60， 10 g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4·7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养48h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于秦皮甲素半水化合物与丙酸乙烯酯的酰化反应中，6’’-秦皮甲素丙酯区域选择性为97.9%。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种催化秦皮甲素酯交换反应的细菌细胞催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将细菌种子液按照接种量为0.5%~25%（v/v）接种至液体培养基中，在25℃~60℃下培养12 h~96 h；
2）菌体经蒸馏水洗涤后真空冷冻干燥收获菌体干粉，即为细菌细胞催化剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，细菌包括施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri 或铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述液体培养基成分为：0.1~100 g/L产酶诱导剂，0.1~50 g/L有机氮源，0.1 ~10 g/L MgSO4·7H2O， 5 g/L (NH4)2SO4和1 g/L K2HPO4。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述产酶诱导剂包括饱和植物油脂、不饱和植物油脂、Tween系列或Span系列中的一种以上。
5.根据权利要求3中所述的制备方法，其特征在于，所述有机氮源包括牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨、干酪素、酸水解酪蛋白胨或无氨基酵母膏中的一种以上。
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