CN102242068B - 催化阿糖胞苷酯合成反应的霉菌细胞催化剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种催化阿糖胞苷酯合成反应的霉菌细胞催化剂的制备方法。该方法是将霉菌孢子接种至含0.5g/L~50g/L产酶诱导剂的液体基础培养基中，接种量为1×103~1×1012个/L，培养条件为10℃~45℃，培养时间为10h~200h；收集菌体，蒸馏水或缓冲液洗涤后再用丙酮洗涤1~3次，抽滤菌体，得到催化阿糖胞苷酯合成反应的霉菌细胞催化剂；或者可采用冷冻干燥的方法去除水分，得到催化阿糖胞苷酯合成反应的霉菌细胞催化剂。本发明的霉菌细胞催化剂具有成本低、易制备、环境友好、催化剂活性高的优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物培养、生物催化及生物医药制备领域，涉及一种催化阿糖胞苷酯合成反应的霉菌细胞催化剂的制备方法。
背景技术
阿糖胞苷是一类非天然核苷，属于脱氧胞嘧啶核苷类似物，具有很高的抗白血病活性，是临床上用于治疗急性骨髓性白血病最有效的化疗药物之一。但其在临床存在口服利用度低，半衰期短，毒副作用大等缺点。阿糖胞苷酯是阿糖胞苷的前药之一，其通过酰化阿糖胞苷糖基部分的羟基而得。药理学试验结果表明，阿糖胞苷酯类衍生物比阿糖胞苷本身更适合于系统或者局部恶性肿瘤治疗,尤其对于网状内皮系统和中枢神经系统中的恶性肿瘤，疗效更显著。此外阿糖胞苷羧酸酯类衍生物在治疗实体肿瘤中也表现出良好的活性，因此，其作为新型抗肿瘤药物已引起了人们的广泛关注。
目前阿糖胞苷酯的合成均采用化学催化剂或者离体酶催化剂。由于糖环上羟基众多，且反应活性相似，采用化学催化剂时存在的主要问题是反应区域选择性很低,易产生大量的副产物及含碱废液，对环境造成严重污染。酶催化剂较之化学催化剂更为绿色，且区域选择性高，反应条件温和，但是由于酶的分离纯化过程复杂且在此过程中酶活性有部分损失，在立体环境中不稳定，易失活等缺点，且酶的价格昂贵，造成酶法反应成本较高，这些方面均严重制约了其的工业化应用。因此，研究开发新型绿色催化剂用于阿糖胞苷酯的制备具有重大的现实意义。
发明内容
本发明针对现有用于阿糖胞苷酯合成的催化剂之不足，目的在于提供一种的具有催化阿糖胞苷酯合成活性的霉菌细胞催化剂的制备方法。其制备方法简单易操作，原材料价廉易购买，不涉及酶的分离纯化。所制备的可催化阿糖胞苷酯合成反应的细胞催化剂其区域选择性可达50%-90%。从而克服了传统化学方法的选择性低导致底物利用率低，产物纯度低，易生成副产物等缺点。同为绿色，反应条件温和的生物催化剂，细胞催化剂较之离体酶催化剂具有稳定性高，价廉、易获取的优点。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种催化阿糖胞苷酯合成反应的霉菌细胞催化剂的制备方法，包括以下步骤：
1）将霉菌孢子接种至含0.5g/L~50g/L产酶诱导剂的液体基础培养基中，接种量为1×103~1×1012个/L，培养条件为10℃~45℃，培养时间为10h~200h；
2）收集菌体，洗涤，抽滤或冷冻干燥菌体，得到催化阿糖胞苷酯合成反应的霉菌细胞催化剂。
所述的液体基础培养基的成分为：1g/L 酵母浸膏, 5g/L (NH4)2SO4，1g/L K2HPO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0. 5g/L~50g/L产酶诱导剂。
所述产酶诱导剂包括糖类化合物、饱和植物油脂、不饱和植物油脂、脂肪酸、Tween系列或Span系列中的一种或两种。
所述霉菌包括米曲霉（Aspergillus oryzae）、米根霉（Rhizopus oryzae）、华根霉（Rhizopus chinensis）、白地霉（Geotrichum candidum）、总状毛霉（Mucor racemosus）或米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）。
所述洗涤为用蒸馏水或pH7.0的缓冲液洗涤后再用丙酮洗涤1~3次。
所述的缓冲液是pH7.0，0.1mol/L的K2HPO4/KH2PO4缓冲液。
步骤（3）采用抽滤或冷冻干燥去除水分，得到具有催化活性的细胞催化剂。
本发明所用的霉菌包括米曲霉（Aspergillus oryzae），米根霉（Rhizopus oryzae），华根霉（Rhizopus chinensis），白地霉（Geotrichum candidum），总状毛霉（Mucor racemosus），米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）为Aspergillusoryzae，所得到的霉菌细胞催化剂是在有机介质中催化阿糖胞苷酯化反应的霉菌全细胞催化剂。
本发明所用霉菌公众可以从菌种中心购买或自己筛选得到。
本发明与现有的技术相比具有如下的优点：
1. 霉菌细胞催化剂为生物催化剂，较之化学催化剂反应条件温和、环境友好；区域选择性高较之酶催化剂成本更为低廉。
2.霉菌细胞催化剂营养要求低，易培养，制备简单易操作，成本低，免去了利用离体酶催化剂需要分离纯化及固定化等步骤，细胞体相当于酶的天然保护层，可有效避免酶在反应体系中失活；
3.本发明制备方法简单易操作，原材料价廉易购买，不涉及酶的分离纯化。所制备的细胞催化剂的区域选择性可达50%-90%。从而克服了传统化学方法的选择性低导致底物利用率低，产物纯度低，易生成副产物等缺点。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
实施例1
将米曲霉（Aspergillus oryzae GIM3.30）孢子接种至将孢子接种至液体基础培养基中，接种量为1×103个/L，培养条件为20℃，培养基成分为：0.1g/L 酵母浸膏, 0.5g/L (NH4)2SO4，0.1g/L K2HPO4，0.02g/L MgSO4·7H2O，0.05g/L的蓖麻油。培养基制备方法为准确称量各组分，倒入锥形瓶后，然后加入蒸馏水，加热至各成分溶解，将瓶密封灭菌备用。培养60h后，冷冻干燥后。使用前将干菌丝于30℃真空干燥10min。该细胞催化剂用于阿糖胞苷与乙酸乙烯酯的酰化反应中，在1mL的阿糖胞苷酯化反应体系中添加0.05g的干菌丝作为催化剂，阿糖胞苷用量为5mg，反应体系为75% ( v/v）吡啶-正己烷,反应温度为30℃，振荡速度180rpm，常压下反应24h。产物区域选择性方法：3’-阿糖胞苷乙酯的产量/阿糖胞苷酯的总产量。此时，区域选择性为80%。
本发明方法得到的催化剂的区域选择性是以阿糖胞苷与乙酸乙烯酯区域选择性酰化反应进行测定，反应条件为在1mL的阿糖胞苷酯化反应体系中添加0.05g的干菌丝作为催化剂，阿糖胞苷用量为5mg，反应体系为75% ( v/v）吡啶-正己烷,反应温度为30℃，振荡速度180rpm，常压下反应24h。反应区域选择性表征为：3’-阿糖胞苷乙酯的产量/阿糖胞苷酯的总产量。
实施例2
将米根霉（Rhizopus oryzae 3.4826）孢子接种至培养瓶，接种量为1×105个/L，培养条件为10℃，培养基成分为： 0.1g/L 酵母浸膏, 0.5g/L (NH4)2SO4，0.1g/L K2HPO4，0.02g/L MgSO4·7H2O，1g/L的橄榄油。培养10h后，冷冻干燥后。使用前将干菌丝于30℃真空干燥10min。 该细胞催化剂用于阿糖胞苷乙酰化反应中，区域选择性为70%。
实施例3
将华根霉（Rhizopus chinensis GIM3.114）孢子接种至培养瓶，接种量为1×1012个/L，培养条件为45℃，培养基成分为：0.1g/L 酵母浸膏, 0.5g/L (NH4)2SO4，0.1g/L K2HPO4，0.02g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L的Span60。培养100h后，冷冻干燥后。使用前将干菌丝于30℃真空干燥10min。 该细胞催化剂用于阿糖胞苷乙酰化反应中，催化活性为66%。
实施例4
将白地霉（Geotrichum candidum GIM2.12）孢子接种至培养瓶，接种量为1×108个/L，培养条件为30℃，培养基成分为：0.1g/L 酵母浸膏, 0.5g/L (NH4)2SO4，0.1g/L K2HPO4，0.02g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L的Tween 60。培养200h后，冷冻干燥后。使用前将干菌丝于30℃真空干燥10min。 该细胞催化剂用于阿糖胞苷乙酰化反应中，区域选择性为84%。
实施例5
将总状毛霉（Mucor racemosus）孢子接种至培养瓶，接种量为1×108个/L，培养条件为30℃，培养基成分为：0.1g/L 酵母浸膏, 0.5g/L (NH4)2SO4，0.1g/L K2HPO4，0.02g/L MgSO4·7H2O， 5g/L的Tween 20。培养200h后，用水洗涤后，丙酮洗涤1次。 该细胞催化剂用于阿糖胞苷乙酰化反应中，区域选择性为70%。
实施例6
将米黑根毛霉（Rhizomucor miehei GIM3.86）孢子接种至培养瓶，接种量为1×108个/L，培养条件为40℃，培养基成分为：0.1g/L 酵母浸膏, 0.5g/L (NH4)2SO4，0.1g/L K2HPO4，0.02g/L MgSO4·7H2O， 2g/L的麦芽糖。培养200h后，用K2HPO4/KH2PO4缓冲液洗涤后，丙酮洗涤3次。 该细胞催化剂用于阿糖胞苷乙酰化反应中，催化活性为58%。
实施例7
将米曲霉（Aspergillus oryzae 3.5232）孢子接种至培养瓶，接种量为1×108个/L，培养条件为30℃，培养基成分为：0.1g/L 酵母浸膏, 0.5g/L (NH4)2SO4，0.1g/L K2HPO4，0.02g/L MgSO4·7H2O， 5g/L的Tween 60 和橄榄油混合物。培养200h后，用水洗涤后，丙酮洗涤1次。 该细胞催化剂用于阿糖胞苷乙酰化反应中，区域选择性为90%。
Claims (3)
1.一种催化阿糖胞苷酯合成反应的霉菌细胞催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将霉菌孢子接种至含0.5g/L~50g/L产酶诱导剂的液体基础培养基中，接种量为1×103~1×1012个/L，培养条件为10℃~45℃，培养时间为10h~200h；所述霉菌及其相应的产酶诱导剂组合为：米曲霉（Aspergillus oryzae GIM3.30）及其产酶诱导剂蓖麻油；或者米曲霉（Aspergillus oryzae CGMCC3.5232）及其产酶诱导剂Tween 60 /橄榄油混合物；或者白地霉（Geotrichum candidum GIM2.12）及其产酶诱导剂Tween 60；所述的液体基础培养基的成分为：1g/L 酵母浸膏, 5g/L (NH4)2SO4，1g/L K2HPO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0. 5g/L~50g/L产酶诱导剂；
2）收集菌体，洗涤，抽滤或冷冻干燥菌体，得到催化阿糖胞苷酯合成反应的霉菌细胞催化剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述洗涤为用蒸馏水或pH7.0的缓冲液洗涤后再用丙酮洗涤1~3次。
3.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于：所述的缓冲液是pH7.0，0.1mol/L的K2HPO4/KH2PO4缓冲液。
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| 固液态发酵中橄榄油对Rhizopus chinensis全细胞脂肪酶的影响;孙舒扬等;《微生物学通报》;20061231;第33卷(第4期);第11页第12-36行和图2 * |
| 孙舒扬等.固液态发酵中橄榄油对Rhizopus chinensis全细胞脂肪酶的影响.《微生物学通报》.2006,第33卷(第4期),第11页第12-36行和图2. |
| 王栋.华根霉（Rhizopus chinensis）非水相合成活性脂肪酶及其酶学特性的研究.《江南大学博士学位论文》.2009,第4.2.5和4.4节. * |
| 王雅娟等.阿糖胞苷衍生物的可控选择性酶促合成与表征.《化学世界》.2010,(第8期),第486-490页. |
| 阿糖胞苷衍生物的可控选择性酶促合成与表征;王雅娟等;《化学世界》;20101231(第8期);第486-490页 * |
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