CN100558905C - 一种酶拆分制备(r)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的方法 - Google Patents
一种酶拆分制备(r)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种酶拆分制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的方法，属于生物催化技术领域。本发明利用脂肪酶拆分底物外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯，制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯，首先筛选出立体选择性较好的脂肪酶，然后对酶拆分的一系列转化条件如摇床转速，反应温度，反应pH，底物浓度以及表面活性剂或有机辅溶剂的添加进行优化，产物光学纯度达到93.8%，收率达到46.7%。同时利用6-羟基-8-氯辛酸乙酯和6-羟基-8-氯辛酸在不同pH下的溶解度差异，对产物进行了初步分离，分离后得到的粗品中(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的含量为83.4%，提取收率为92.4%。(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯是制备(R)-硫辛酸的中间体，本发明为(R)-硫辛酸的制备提供一条可行的途径。
Description
技术领域
一种酶拆分制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的方法，即脂肪酶拆分外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯制备(R)-硫辛酸手性中间体(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的方法，属于生物催化技术领域。
背景技术
6-羟基-8-氯辛酸乙酯的主要用途是合成硫辛酸。R-硫辛酸(Lipoic acid)属于维生素B类化合物，是一种具有生物活性的天然产物，在医药、保健品、食品添加剂及化妆品等方面具有广泛应用，其抗氧化性是维生素E的400倍，具有很大的市场潜力。硫辛酸可通过脑血屏障进入大脑，对清除头部各器官自由基毒素格外有效，可以保护大脑、眼睛免受污染毒素和感染的危害，解除大脑、眼睛疲劳，改善各种过敏症、炎症、鼻炎、结膜炎，增强免疫力，目前广泛应用于心脏病、急性及慢性肝炎、肝硬化、肝性昏迷、脂肪肝、糖尿病等病的治疗及预防保健，还广泛用于食品、化妆品和饲料添加剂(Biewenga G P，Haenen G R，Bast A.General Pharmacology，1997，29(3)：315-319)。但市场上的硫辛酸多是混旋产品(由等量R-硫辛酸(右旋)和S-硫辛酸(左旋)构成)，R-硫辛酸是人体内硫辛酸的天然形式，S-硫辛酸在人体内不具有活性。化学合成的硫辛酸是混旋硫辛酸。目前硫辛酸产品正处于在R-硫辛酸取代混旋硫辛酸的过程，手性R-硫辛酸的制备成为热点。
目前有关(R)-硫辛酸的制备研究较多的主要是环己酮法，该方法需要单加氧酶(BVMO)的参与，副反应多，且产物分离纯化较复杂。通过混旋硫辛酸直接制备(R)-硫辛酸的产率及对映体过量值均不理想(Adger B，Bes M T，Gorgar Get al.Bioorganic and medicinal chemistry，1997，5(2)：253-261.)。
常规使用的生产方法是己二酸法。以己二酸单乙酯为原料，通过酰氯化，再经过加成生成6-羰基-8-氯辛酸乙酯，继而还原成dl-6-羟基-8-氯辛酸乙酯，经过一系列化学法合成dl-6，8-二氯辛酸，最后缩合生成硫辛酸。以手性拆分剂可将外消旋硫辛酸或其中间体拆分成R(+)-硫辛酸或相应的手性中间体(蔡怀勋，徐林祥，谢自强.浙江化工，2003，34(5)：20-24)。
化学方法拆分外消旋体，往往效果不佳，产量低，操作过程复杂，有些化学拆分剂甚至含有毒性(例如冠醚)，不利于安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备(R)-硫辛酸的中间体(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的方法。利用筛选得到的具有高对映体选择性的脂肪酶，拆分外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯，并对其反应条件及产品提取进行了研究，最终制备得到高光学纯度的(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯，为(R)-硫辛酸的制备提供一条可行的途径。
本发明的技术方案：以具有立体选择性的脂肪酶为催化剂，在单一水相或水/有机溶剂两相体系中，对外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯进行拆分，制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯，步骤如下：
(1)酶源：选用脂肪酶CRL、脂肪酶L-3124、脂肪酶L-3126、脂肪酶LipaseIM、脂肪酶Lipase MY、脂肪酶Lipase PS-D、碱性脂肪酶或青霉脂肪酶；
(2)配制反应体系：以外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯为底物，用pH6.0～7.0的磷酸盐缓冲液配制成反应体系，底物浓度为20～180mmol/L；
(3)转化反应：在反应体系中加入脂肪酶启动反应，加酶浓度为5～20g/L，酶反应温度为30～60℃，摇床转速为150～210r/min，反应时间为0.5～2小时，反应结束，离心去除脂肪酶，得到上清液；
(4)萃取处理：上清液调pH至9.0～10.0，用乙酸乙酯萃取分离，得到含有(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的有机相，用适量无水MgSO4(加入1～5％(w/v)的无水硫酸镁)干燥过夜，过滤后进行气相色谱测定含量和对映体过量值；
(5)回收副产物：将萃取分离有机相后的剩余水相调pH至2.0～3.0，用乙酸乙酯萃取，分离有机相得到(S)-6-羟基-8-氯辛酸；
(6)产物提取：将含有(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的有机相进行旋转蒸发，得到粗产品，进行气相色谱分析、称重、测旋光。
本发明方法所用优选的脂肪酶为Lipase PS-D、Lipase MY或CRL。
本发明方法优选的反应体系为单一水相，或水/正辛烷，或水/正己烷两相体系，两相体积比1∶1。
本发明方法优选的转化反应条件为：底物浓度为45～90mmol/L，加酶浓度为10～20g/L，酶反应温度为30℃，摇床转速为170r/min，反应时间为0.5-1h。
本发明方法在转化反应体系中，可以再添加表面活性剂OP，添加量为反应体系质量的0.1％。
本发明方法选用在水/有机溶剂两相反应体系中，催化剂固定化脂肪酶反复使用次数达到10次。
产物浓度测定采用VARIAN CP WAX 52CB极性色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，分析条件为气化室温度250℃，检测器温度250℃，柱温140℃保留2min，以10℃/min升温至240℃维持10min，载气为氢气，流量为2.0mL/min，分流比1∶20，尾吹N2流速：25mL/min，燃烧气H2流速：30mL/min，空气流速：300mL/min。
对映体过量值的测定采用手性色谱柱CP-Chirasil Dex CB(0.25mm×25mm×0.25μm)分析，分析条件为气化室温度270℃，检测器温度270℃，柱温140℃保留2min，以4℃/min升温至200℃维持5min，载气为氢气，流速为2.0mL/min，分流比1∶50，尾吹N2流速：25mL/min，燃烧气H2流速：30mL/min，空气流速：300mL/min。
产物的光学纯度通过对映过量值(％e.e.)来评价。
％e.e.＝[(SR-SS)/(SR+SS)]×100％
Residual(％)＝[(SR+SS)/S0]×100％
产率yield(％)＝Residual×[1-(100-％e.e.)/200].
SR：反应后(R)-对映体的峰面积；SS：反应后(S)-对映体的峰面积；
S0：反应前(S)-和(R)-对映体的峰面积之和。
本发明的有益效果：本发明筛选获得了高对映体选择性的脂肪酶LipasePS-D，在单一水相体系中拆分外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯生成的(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的对映体过量值达到93.1％，收率达到46.7％，对映体选择率为28。并初步分离得到(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯产物，粗品中(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯含量为83.4％，产品提取收率为92.4％。
本发明酶拆分外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯相对于环己酮法和其它化学方法具有以下优点：①生成的(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯对映体过量值高，在收率为46.7％时，％ee值达到93.1％；②副反应少，只需一步酯水解即可完成反应；③底物产物易分离；④反应条件温和，对环境友好。
本发明用生物催化拆分方法对“己二酸法”合成硫辛酸的关键手性中间体6-羟基-8-氯辛酸乙酯(Ethyl 6-hydroxy-8-chlorocaprylate)进行拆分，通过脂肪酶拆分，可得到高光学纯度的(R)-硫辛酸中间体(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯，该反应具有副反应少，底物产物易分离，合成路线短，产品安全等诸多优点。本发明为R(+)-硫辛酸制备提供一种可行途径。
具体实施方式
实施例1外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯拆分用酶的筛选
对下列脂肪酶进行筛选：脂肪酶Novozym 435(来源于Candida antarctica)购自诺维信公司；脂肪酶CRL(来源于Candida rugosa)、脂肪酶L-3124和L-3126(来源于Porcine pancreas)、Lipase IM(来源于Mucor miehei)、LipaseF-AP(来源于Rhizopus oryzae)购自Sigma公司；Lipase MY(来源于Pseudomonassp.)购于日本Meito Sangyo公司；Lipase PS-D(来源于Pseudomonas sp.)购自日本Amano公司；碱性脂肪酶(来源于Penicillium expansum)、青霉脂肪酶(来源于Peniciline sp.)购自深圳绿微康生物工程有限公司。外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯购自常熟万兴化工有限公司；其它试剂均为市售分析纯。
以45mmol/L浓度添加底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯，采用pH 7.0磷酸盐缓冲液体系，加入10g/L脂肪酶启动反应，于30℃，摇床转速130r/min，反应1h，待反应结束，离心除去脂肪酶，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取得有机相，用适量无水MgSO4干燥过夜，过滤后进行气相色谱分析(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表1。
表1外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯拆分用酶的筛选
由表1可知Novozym 435、Lipase F-AP由于被水解物构型不适合外，其余所选脂肪酶均可适用，尤以Lipase PS-D、Lipase MY或CRL为佳。
实施例2摇床转速对Lipase PS-D拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的影响
以45mmol/L浓度添加底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯，采用pH 7.0磷酸盐缓冲液体系，加入10g/L脂肪酶Lipase PS-D启动反应，分别在不同转速下，于30℃水浴摇床反应1h，待反应结束，离心除去脂肪酶，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，取有机相用适量无水MgSO4干燥过夜，过滤后进行气相色谱分析(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯含量与对映体过量值，计算出酶反应初速度，结果如表2。
表2摇床转速对Lipase PS-D拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯反应初速度的影响
| 摇床转速(r/min) | 110 | 130 | 150 | 170 | 190 | 210 | 230 |
| 酶反应初速度(g/(L·h)) | 11.2 | 14.3 | 16.3 | 17 | 17.1 | 16.9 | 14.8 |
从表2可以看出，酶反应初速度首先随摇床转速的增加而增加，随后随转速的增加而降低，为达到最大反应速率并从节省能耗的角度考虑，较适宜的摇床转速为150～210r/min，优选摇床转速为170r/min。
实施例3反应温度对Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的影响
按照实施例2配制反应体系，分别在不同温度下，于170r/min水浴摇床反应1h，待反应结束，离心除去脂肪酶，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，取有机相用适量无水MgSO4干燥过夜，过滤后进行气相色谱分析(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表3。
表3不同温度对Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯反应的影响
从表3可以看出，反应初速率和底物转化率均随反应温度升高而增大。但酶催化水解反应的对映体选择性却随着反应温度的升高而下降，为得到对映体纯度较高的产物，反应温度以30℃左右为宜。
实施例4pH对Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的影响
以45mmol/L浓度添加底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯，采用不同磷酸盐缓冲液体系，加入10g/L脂肪酶Lipase PS-D启动反应，在170r/min转速下，于30℃水浴摇床反应1h，待反应结束，离心除去脂肪酶，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，取有机相用适量无水MgSO4干燥过夜，过滤后进行气相色谱分析(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表4。
表4不同pH对Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的影响
表4列出了不同pH对反应的影响，可以看出，脂肪酶Lipase PS-D拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的最适pH为pH6～7。在酸性条件下，转化率和对映选择性随pH的增大而增大。在碱性条件下，转化率随着pH的增大而增大，对映体选择性随pH的增大而下降。
实施例5底物浓度对Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的影响
以不同浓度添加底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯，采用pH 7.0的磷酸盐缓冲液体系，加入10g/L脂肪酶Lipase PS-D启动反应，在170r/min转速下，于30℃水浴摇床反应1h，待反应结束，离心除去脂肪酶，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，取有机相用适量无水MgSO4干燥过夜，过滤后进行气相色谱分析(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表5。
表5不同底物浓度对Lipase PS-D催化拆分的影响
由表5可知，酶反应初速度随着底物浓度的增大而增大。而底物转化率，对映体过量值，对映选择性先是随底物浓度的增加而增大，当底物浓度进一步增大时，底物转化率，对映体过量值，对映选择性却开始下降。另一方面，当底物浓度介于22.5mmol/L～90mmol/L时，％ee值维持在一个相对较高的水平。综合考虑各因素，确定底物外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯的适宜浓度为45mmol/L。
实施例6酶浓度对Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的影响
以45mmol/L的浓度添加底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯，采用pH 7.0的磷酸盐缓冲液体系，加入不同浓度的脂肪酶Lipase PS-D启动反应，在170r/min转速下，于30℃水浴摇床反应1h，待反应结束，离心除去脂肪酶，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，取有机相用适量无水MgSO4干燥过夜，过滤后进行气相色谱分析(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表6。
表6酶浓度对Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的影响
由表6可知，综合考虑转化率和对映体过量值两因素，确定脂肪酶的适宜浓度为10～20g/L。
实施例7表面活性剂或有机辅溶剂对Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的影响
以45mmol/L浓度添加底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯，采用pH 7.0的磷酸盐缓冲液体系，分别添加反应体系质量的0.1％表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，Tween-80，乳化剂OP及有机辅溶剂四氢呋喃(THF)或二甲亚砜(DMSO)，并以未添加表面活性剂或有机辅溶剂的反应体系作对照，加入10g/L脂肪酶Lipase PS-D启动反应，在170r/min转速下，于30℃水浴摇床反应1h，待反应结束，离心除去脂肪酶，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，取有机相用适量无水MgSO4干燥过夜，过滤后进行气相色谱分析(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表7。
表7表面活性剂或有机辅溶剂的影响
从表7可以看出，所考查的5种表面活性剂及有机辅溶剂当中，乳化剂OP使得产物的％ee值有所提高，其它添加剂如四氢呋喃(THF)、二甲亚砜(DMSO)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和Tween-80对％ee值基本上都有不利作用。
实施例8水/有机溶剂两相反应体系中有机溶剂对Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的影响
添加底物浓度6-羟基-8-氯辛酸乙酯45mmol/L，考查水/有机溶剂两相体系中不同有机溶剂对反应的影响以选择适宜的有机溶剂，以水/有机溶剂体积比为1/1的比例作为反应体系，分别对六种有机溶剂(邻苯二甲酸二丁酯、正己烷、正辛烷、1-辛醇、1-癸醇、乙酸丁酯)进行了试验，加入20g/L脂肪酶Lipase PS-D后，在170r/min，30℃水浴摇床中反应0.5h，取有机相中样品，用无水MgSO4干燥过滤后，进行气相色谱分析(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表8。
表8有机溶剂对Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的影响
从表8可以看出，水/正辛烷或水/正己烷两相体系中Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯可获得较高％ee值的产物。
实施例9水/正辛烷两相体系中Lipase PS-D催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的反应进程
添加底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯浓度45mmol/L，在水/正辛烷(V水/V有机相＝1∶1)两相体系中，加入20g/L脂肪酶Lipase PS-D，在170r/min，30℃水浴摇床中反应，定时取样，MgSO4干燥过滤后，气相色谱分析有机相中(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯含量与对映体过量值。反应进程如表9。
表9水/正辛烷两相体系中Lipase PS-D拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯的反应进程
从表9看出，在两相体系中的酶拆分反应在30min转化率为52.4％时，产物(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯％ee值达到97.7％，收率为47.6％。
实施例10水/正辛烷两相体系中固定化脂肪酶反复分批催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯
按常规方法用吸附法将酶吸附于硅藻土上，按实施例9的方法，在水/正辛烷两相体系中催化拆分6-羟基-8-氯辛酸乙酯，每批反应完时，分离有机相，剩余水相继续下一批催化反应，固定化脂肪酶反复利用10次。结果如表10。
表10水/正辛烷两相体系中固定化脂肪酶的反复利用
实施例11产物(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的分离
按实施例6的方法，在200mL的反应体系中，以45mmol/L浓度添加底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯，采用pH7.0的磷酸盐缓冲液体系，加入10g/L脂肪酶LipasePS-D进行催化反应，在170r/min转速下，于30℃水浴摇床反应1h，将反应结束后的转化液离心除酶，取样0.5mL，GC测定(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯含量为4.62g/L。调节转化液pH至10.0，等体积的乙酸乙酯萃取，向其中加入1～5％(w/v)的无水硫酸镁干燥，过滤除去固体颗粒，所得有机相旋转蒸发蒸干溶剂，最后得产物粗品(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯1.12g。称取一定量的自制品配成1.021g/100mL氯仿溶液，于20℃测定产品旋光度α＝+0.152，比旋光度[α]20＝+14.8，GC分析为一单峰，产品提取收率为92.4％。
Claims (6)
1.一种酶拆分制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的方法，其特征是以具有立体选择性的脂肪酶为催化剂，在单一水相或水/有机溶剂两相体系中，对外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯进行拆分，制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯，步骤如下：
(1)酶源：选用脂肪酶CRL、脂肪酶L-3124、脂肪酶L-3126、脂肪酶LipaseIM、脂肪酶Lipase MY、脂肪酶Lipase PS-D、碱性脂肪酶或青霉脂肪酶；
(2)配制反应体系：以外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯为底物，用pH6.0～7.0的磷酸盐缓冲液配制成反应体系，底物浓度为20～180mmol/L；
(3)转化反应：在反应体系中加入脂肪酶启动反应，加酶浓度为5～20g/L，酶反应温度为30～60℃，摇床转速为150～210r/min，反应时间为0.5～2h，反应结束，离心去除脂肪酶，得到上清液；
(4)萃取处理：上清液调pH至9.0～10.0，用乙酸乙酯萃取分离，得到含有(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的有机相，用适量无水MgSO4干燥过夜，过滤后进行气相色谱测定含量和对映体过量值；
(5)回收副产物：将萃取分离有机相后的剩余水相调pH至2.0～3.0，用乙酸乙酯萃取，分离有机相得到(S)-6-羟基-8-氯辛酸；
(6)产物提取：将含有(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的有机相进行旋转蒸发，得到粗产品，进行气相色谱分析、称重、测旋光。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用脂肪酶为Lipase PS-D、LipaseMY或CRL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是反应体系为单一水相，或水/正辛烷，或水/正己烷两相体系，两相体积比1∶1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是转化反应条件为：底物浓度为45～90mmol/L，加酶浓度为10～20g/L，酶反应温度为30℃，摇床转速为170r/min，反应时间为0.5-1h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是在转化反应体系中，再添加表面活性剂OP，添加量为反应体系质量的0.1％。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的脂肪酶是固定化脂肪酶，其特征是固定化脂肪酶使用次数达到10次。
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| 有机相酶催化氨解反应拆分制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯. 金勇等.有机化学，第26卷第10期. 2006 |
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| 水解酶在有机催化中的作用. 王忠仁等.大连轻工业学院学报，第11卷第3-4期. 1992 |
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| 脂肪酶在表面活性剂介质中的催化反应动力学研究. 周晓云等.浙江工业大学学报，第28卷第1期. 2000 |
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| 脂酶催化及其在光学活性有机化合物合成中的应用. 王秋安等.合成化学，第5卷第1期. 1997 |
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