CN102250785B - 催化阿糖胞苷酯合成反应的细菌细胞催化剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种催化阿糖胞苷酯合成反应的细菌细胞催化剂的制备方法。该方法是细菌种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，接种量为0.2%~18%v/v，培养条件为15℃~60℃，培养时间为6~192h；离心后收集菌体，蒸馏水或缓冲液洗涤两次，经真空冷冻干燥12h以上收获菌体干粉，得到可高选择性催化核苷类似物酯合成反应的全细胞催化剂。本发明将细菌全细胞催化剂运用到阿糖胞苷酯合成反应中，省去了繁琐的酶纯化、固定化过程，减少了酶活损失，克服了现有技术中所用离体酶催化剂在有机溶剂中容易失活、成本高的缺点；且细菌细胞易培养，区域选择性高，使该方法具有成本低、易制备、催化区域选择性高等优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物培养、生物催化及生物医药制备领域，涉及一种催化阿糖胞苷酯合成反应的细菌细胞催化剂的制备方法。
背景技术
核苷类似物为天然核苷的结构类似物，多具有抗微生物，抗癌等生理活性，其中阿糖胞苷具有很高的抗白血病活性，是临床上用于治疗急性骨髓性白血病最有效的化疗药物之一。但其在临床存在口服利用度低，半衰期短，毒副作用大等缺点。药理学试验结果表明，阿糖胞苷酯类衍生物比阿糖胞苷本身更适合于系统或者局部恶性肿瘤治疗，尤其对于网状内皮系统和中枢神经系统中的恶性肿瘤，疗效更显著。此外阿糖胞苷羧酸酯类衍生物在治疗实体肿瘤中也表现出良好的活性，因此，其作为新型抗肿瘤药物已引起了人们的广泛关注。
目前阿糖胞苷酯类衍生物的合成均采用化学催化剂或者离体酶催化剂。由于糖环上羟基众多，且反应活性相似，采用化学催化剂时存在的主要问题是反应区域选择性很低，易产生大量的副产物及含碱废液，对环境造成严重污染。酶催化剂较之化学催化剂更为绿色，且区域选择性高，反应条件温和，但是由于酶的分离纯化过程复杂且在此过程中酶活性有部分损失，在立体环境中不稳定，易失活等缺点，且酶的价格昂贵，造成酶法反应成本较高，这些方面均严重制约了其在工业化的应用。因此，研究开发新型绿色催化剂用于阿糖胞苷酯的制备具有重大的现实意义。此外，胞苷类似物不同羟基上的酰化产物，如5′-阿糖胞苷酯和3′-阿糖胞苷酯在治疗不同种类的肿瘤时具有不同的疗效。因此如何制备核苷类似物的不同位点酰化产物，也成为核苷类抗癌新药研发的热点之一。
发明内容
本发明针对现有用于核苷类似物酯合成的催化剂的不足，目的在于提供一种新型的具有催化阿糖胞苷酯合成反应的细菌催化剂的制备方法。其制备方法简单易操作，原材料价廉易购买，不涉及酶的分离纯化。用本法制备的可催化阿糖胞苷酯合成反应的细胞催化剂其区域选择性达到80%以上，克服了传统化学方法的选择性低导致底物利用率低，产物纯度低，易生成副产物等缺点。同为绿色，反应条件温和的生物催化剂，细胞催化剂较之离体酶催化剂具有稳定性高，价廉、易获取的优点。
本发明是一种可催化阿糖胞苷酯合成反应的细菌细胞催化剂的制备方法，其制备方法简单易操作，原材料价廉易购买，不涉及酶的分离纯化。所制备的细菌细胞催化剂可选择性催化合成阿糖胞苷的5′-单酯，区域选择性高于80%，从而克服了传统化学方法的选择性低导致底物利用率低，产物纯度低，易生成副产物等缺点。同为绿色, 反应条件温和的生物催化剂，细胞催化剂较之离体酶催化剂具有稳定性高，价廉、易获取的优点。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种催化阿糖胞苷酯合成反应的细菌细胞催化剂的制备方法，包括以下步骤：
1）细菌种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，接种量为0.2%~18% v/v，培养条件为15℃~60℃，培养时间为6~192h；
2）离心后收集菌体，蒸馏水或缓冲液洗涤两次，经真空冷冻干燥12h以上收获菌体干粉，即为细菌细胞催化剂。
所述细菌包括无色短杆菌（Achromobacter xylosoxidans subsp）、产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）、芽孢杆菌（Bacillus cereus）、节杆菌（Arthrobacter simplex）、假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）或乳杆菌（Lactobacillus brevis）。
本发明所用细菌公众可以从菌种中心购买或自己筛选得到。
所述液体培养基成分为：0.1~100 g/L产酶诱导剂，0.1~50 g/L有机氮源，0.1~10 g/L MgSO4·7H2O，5 g/L (NH4)2SO4，1 g/L K2HPO4，pH为6.8~7.5。
所述产酶诱导剂包括糖类化合物、饱和植物油脂、不饱和植物油脂、脂肪酸、Tween系列或Span系列中的一种或两种。
所述有机氮源包括牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨、干酪素、酸水解酪蛋白胨或无氨基酵母膏中的一种或两种。
所述缓冲液为pH 5.0~9.0的缓冲液。优选pH 5.0~9.0，1/15 mol/L的Na2HPO4/KH2PO4缓冲液。
本发明与现有的技术相比具有如下的优点：
1.细菌细胞催化剂为生物催化剂，较之化学催化剂反应条件温和、环境友好，区域选择性高，选择性合成阿糖胞苷的5′-单酯，其区域选择性在80%以上，从而克服了传统化学方法产物纯度低，易生成副产物等缺点。
2. 细菌细胞催化剂营养要求很低，容易培养，培养基配方简单，制备易操作，制备成本低。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，需要说明的是，这些实施例并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
将包括无色短杆菌（Achromobacter xylosoxidanssubsp. Denitrificans CGMCC1.768）种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为1%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：100 g/L麦芽糖， 1 g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4·7H2O ，5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.8。培养60h后离心收集湿菌体，pH5.0缓冲液洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于阿糖胞苷与乙酸乙烯酯的酰化反应中，5’-区域选择性为95%。
本发明方法得到的催化剂的区域选择性以阿糖胞苷与乙酸乙烯酯区域选择性酰化反应进行测定，反应条件为在2mL的阿糖胞苷酯化反应体系中添加100mg的菌体干粉作为催化剂，以55μl乙酸乙烯酯作为酰基供体，阿糖胞苷用量为10mg，蒸馏水为30μl，反应体系为75% ( v/v）吡啶-正己烷，反应温度为30℃，振荡速度140rpm，常压下反应。反应区域选择性表征为：5’-阿糖胞苷乙酯的产量/阿糖胞苷酯的总产量。
实施例2
将产碱杆菌（Alcaligenes faecalis CGMCC1.1799）种子液转接至含液体培养基中培养，接种量为0.2%（v/v），培养条件为40℃，液体培养基成分为（w/v）：0.1 g/L棕榈油，50 g/L 牛肉膏， 1 g/L MgSO4·7H2O ， 5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.9。培养6h后离心收集湿菌体，蒸馏水洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于阿糖胞苷与乙酸乙烯酯的酰化反应中，5’-区域选择性为94%。
实施例3
将芽孢杆菌（Bacillus cereus AS1.126）种子液转接至液体培养基中，接种量为10%（v/v），培养条件为15℃，液体培养基成分为：10 g/L玉米油，0.1g/L胰蛋白胨，0.2g/L MgSO4·7H2O ， 5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4 ，pH为7.4。培养84h后离心收集湿菌体，pH 9.0缓冲液洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于阿糖胞苷与乙酸乙烯酯的酰化反应中，5’-区域选择性为96%。
实施例4
将节杆菌（Arthrobacter simplex AS1.94）种子液转接至液体培养基中培养，接种量为18%（v/v），培养条件为20℃，液体培养基成分为：70 g/L麦芽糖，30 g/L玉米油，0. 5 g/L 无氨基酵母膏，20 g/L干酪素， 1 g/L MgSO4·7H2O ， 5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4 ，pH为7.5。培养36h后离心收集湿菌体，pH 5.5缓冲液两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于阿糖胞苷与乙酸乙烯酯的酰化反应中，5’-区域选择性为96%。
实施例5
将假单胞菌（Pseudomonas fluorescens AS 1.823）种子液转接至液体培养基中，接种量为2%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为（w/v）：10 g/L Span80， 5 g/L 蛋白胨， 0. 1 g/L MgSO4·7H2O ， 5 g/L (NH4)2SO4，1 g/L K2HPO4 ，pH为6.8。培养192h后离心收集湿菌体，pH 6.5缓冲液洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于阿糖胞苷与乙酸乙烯酯的酰化反应中，5’-区域选择性为93%。
实施例6
将乳杆菌（Lactobacillus brevis GIM1.288）种子液转接至液体培养基中，接种量为5%（v/v），培养条件为40℃，液体培养基成分为：30 g/L可溶性淀粉，10 g/L 酸水解酪蛋白冻， 0.8 g/L MgSO4·7H2O ， 5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为6.9。培养60h后离心收集湿菌体，pH 7.0缓冲液洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于阿糖胞苷与乙酸乙烯酯的酰化反应中，5’-区域选择性为95%。
实施例7
将节杆菌（Arthrobacter simplex AS1.94）种子液转接至液体培养基中培养，接种量为2%（v/v），培养条件为30℃，液体培养基成分为：10 g/L油酸，30 g/L酵母膏，50 g/L牛肉膏， 0.5 g/L MgSO4·7H2O ， 5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4 ，pH为7.3。培养12h后离心收集湿菌体，pH 8.0缓冲液洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于阿糖胞苷与乙酸乙烯酯的酰化反应中，5’-区域选择性为93%。
实施例8
将假单胞菌（Pseudomonas fluorescens ATCC49642）种子液转接至液体培养基中培养，接种量为5%（v/v），培养条件为60℃，液体培养基成分为：10 g/L麦芽糖，50 g/L橄榄油，20 g/L酵母膏， 0.2 g/L MgSO4·7H2O ， 5 g/L (NH4)2SO4， 1 g/L K2HPO4，pH为7.2。培养60h后离心收集湿菌体，pH 6.0缓冲液洗涤两次，真空冷冻干燥后得细胞催化剂。该细胞催化剂用于阿糖胞苷与乙酸乙烯酯的酰化反应中，5’-区域选择性为96%。
Claims (5)
1.一种催化阿糖胞苷酯合成反应的细菌细胞催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）细菌种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，接种量为0.2%~18% v/v，培养条件为15℃~60℃，培养时间为6~192h；
2）离心后收集菌体，蒸馏水或缓冲液洗涤两次，经真空冷冻干燥12h以上收获菌体干粉，即为细菌细胞催化剂；
所述细菌包括木糖氧化产碱菌反硝化亚种（Achromobacter xylosoxidans subsp. Denitrificans）CGMCC1.768、粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）CGMCC1.1799或荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens） ATCC49642；
所述产酶诱导剂包括麦芽糖、橄榄油或棕榈油中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述液体培养基成分为：0. 1~100 g/L产酶诱导剂，0.1~50 g/L有机氮源，0.1~10 g/L MgSO4·7H2O，5 g/L (NH4)2SO4，1 g/L K2HPO4，pH为6.8~7.5。
3.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于，所述有机氮源包括牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨、干酪素、酸水解酪蛋白胨或无氨基酵母膏中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为pH 5.0~9.0的缓冲液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为pH 5.0~9.0，1/15mol/L的Na2HPO4/KH2PO4缓冲液。
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