CN1876824A - 酶催化制备阿糖胞苷酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶催化制备阿糖胞苷酯的方法,是以羧酸烯醇酯或者酸酐为酰基供体,利用酶催化阿糖胞苷进行酰化反应,合成阿糖胞苷酯。本发明具有反应条件温和、环境友好、反应具有高度区域选择性和反应过程简单可控、产物易分离的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物催化与生物合成、生物医药以及材料领域,涉及一种酶催化制备阿糖胞苷酯的方法。是CN200410077504X的选择性发明。
背景技术
阿糖胞苷是一类非天然核苷,属于脱氧胞嘧啶核苷类似物,具有很高的抗白血病活性,是临床上用于治疗急性骨髓性白血病最有效的化疗药物之一。阿糖胞苷酯类衍生物是阿糖胞苷的前药之一,其通过酰化阿糖胞苷糖基部分的羟基而得。药理学试验结果表明,阿糖胞苷羧酸酯类衍生物比阿糖胞苷本身更适合于系统或者局部恶性肿瘤治疗,尤其对于网状内皮系统和中枢神经系统中的恶性肿瘤,疗效更显著。此外阿糖胞苷羧酸酯类衍生物在治疗实体肿瘤中也表现出良好的活性,因此,其作为新型抗肿瘤药物已引起了人们的广泛关注。
目前阿糖胞苷羧酸酯类衍生物均采用化学法合成。其主要问题是:糖环上羟基众多,且反应活性相似,采用一般化学方法直接酯化时,区域选择性很低,易产生大量的副产物,产物分离困难;为合成确定位置的酰化产物,需要对糖环特定羟基进行保护和去保护等操作,反应步骤多、工艺复杂;采用碱性催化剂,易产生含碱废液,对环境造成严重污染。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术工艺存在的问题,提供一种酶催化制备阿糖胞苷酯的方法,其区域选择性高,产率达到95%以上,产物结构易控,可得到阿糖胞苷5’-单酯或者3’-单酯,且产物纯度高,反应副产物少,从而克服了传统化学方法的选择性低导致底物利用率低,产物纯度低,易生成副产物二酯等缺点;
本发明的酶催化制备阿糖胞苷酯的方法,是以羧酸烯醇酯或者酸酐为酰基供体,利用酶催化阿糖胞苷进行酰化反应,合成得到阿糖胞苷单酯;包括:在反应器中加入阿糖胞苷、反应介质、羧酸烯醇酯,按酶与阿糖胞苷的用量之比为50,000~800,000U/g的比例加入脂肪酶,在温度为30~60℃、振荡速度为150~250rpm、常压下反应3~12小时后,分离得到阿糖胞苷酯;
所述脂肪酶来源于Candida antarctica、Thermomyces lanuginosus、Rhizomucor miehei;Burkholderia acepacia、Pseudomonas cp.,蛋白酶来源于Bacillus cp.。
所述羧酸烯醇酯或者酸酐中酰基的碳原子数为C4~C24,含0~6个双键;
所加入的羧酸烯醇酯或者酸酐与阿糖胞苷的摩尔比为9∶1~1000∶1;
所述反应介质是有机溶剂和/或离子液;其用量是0.2~1L/g阿糖胞苷。
优选方案如下:所述有机溶剂是饱和脂肪烃、不饱和脂肪烃、芳烃类、酯类、脂肪族醚、芳醚、醇类、含氮化合物溶剂中的一种或者一种以上。
所述有机溶剂中,疏水性有机溶剂占10~35%体积。
离子液的阴离子为四氟硼酸根离子或者六氟磷酸根离子,阳离子为1-烷基-3-甲基咪唑离子。
分离阿糖胞苷酯可以采用现有技术通用的方法,也可以采用本发明人发明的如下方法:反应混合物经过滤除酶后,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得阿糖胞苷酯。第(2)步中,反应混合物经过滤除酶后,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重结晶或者经硅胶柱色谱分离纯化,即得阿糖胞苷酯。
本发明与现有的技术相比具有如下的优点:
1.采用高效的生物催化剂酶来催化阿糖胞苷酯合成,酶催化反应具有高度选择性,底物转化率高、产物结构易控,可以根据需要得到阿糖胞苷5’-单酯或者3’-单酯,反应区域选择性高、产率高,副产物少,纯度高,由于克服了传统化学方法的选择性低导致底物利用率低,易生成二酯副产物、单酯产物纯度低、产率低的缺点;
2.无须基团保护和去保护,反应过程简单易控,产物易分离;
3.反应条件温和、环境友好。
具体实施方式
实施例1
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、2.10g(1.84×10-2mol)丁酸乙烯酯、0.1L 10%(v/v)异丙醚-吡啶混合溶剂的反应液加入到具塞三角瓶中,接着加入25,000U来源于Candida antarctica的脂肪酶(10,000U/g),常压下置于30℃、150rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应3h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷5’-丁酸酯0.628g,得率为97.5%,反应区域选择性为99.9%(产物阿糖胞苷5’-丁酸酯浓度高于99%)。
实施例2
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、45.9g(2.05×10-1mol)月桂酸乙烯酯、0.5L 35%(v/v)庚烷-二甲基甲酰胺混合溶剂的反应液加入到具塞三角瓶中,接着加入100,000U来源于Candida antarctica的脂肪酶(10,000U/g),常压下置于40℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应12h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷5’-月桂酸酯0.831g,得率为96.0%,反应区域选择性为99.9%(产物阿糖胞苷5’-月桂酸酯浓度度达99%以上)。
实施例3
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、313g(8.2×10-1mol)二十四碳酸甲酯、0.5L 35%(v/v)四氢呋喃-吡啶混合溶剂的反应液加入到具塞三角瓶中,接着加入400,000U来源于Candida antarctica的脂肪酶(10,000U/g),常压下置于60℃、250rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应8h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷5’-二十四碳酸酯1.16g,得率为96.0%;反应区域选择性为99.9%(产物阿糖胞苷5’-二十四碳酸酯浓度达99%以上)。
实施例4
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、57.8g(2.05×10-1mol)棕榈酸乙烯酯、0.1L 35%(v/v)离子液C4MIm·BF4和四氢呋喃混合溶剂的反应液加入具塞三角瓶中,接着加入25,000U来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶(50,000U/g),常压下置于50℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应6h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷5’-棕榈酸酯0.940g,得率为96.0%;反应区域选择性为99.0%(产物阿糖胞苷5’-棕榈酸酯浓度达99%以上)。
实施例5
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、14020g(2.05mol)4,7,10,,13,16,19-二十二烯酸乙烯酯、0.50L 50%(v/v)离子液C8MIm·BF4和叔丁醇混合溶剂的反应液加入具塞三角瓶中,接着加入400,000U来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶(50,000U/g),常压下置于60℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应7h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷5’-二十二烯酸酯1.07g,得率为95.5%;反应区域选择性为99.0%(产物阿糖胞苷5’-二十二烯酸酯浓度达98%以上)。
实施例6
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、148.3g(1.025mol)苯甲酸乙烯酯、0.10L离子液C4MIm·PF6的反应液加入具塞三角瓶中,接着加入150,000U来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶(20,000U/g),常压下置于60℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应4h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷5’-苯甲酸酯浓度0.677g,得率为95.8%;反应区域选择性为99.0%(产物阿糖胞苷5’-苯甲酸酯浓度达99%以上)。
实施例7
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、240g(1.23mol)苯甲酸乙烯酯、0.15L 20%(v/v)离子液C2MIm·BF4和吡啶混合溶剂的反应液加入具塞三角瓶中,接着加入250,000U来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶(20,000U/g),常压下置于30℃、250rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应6h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷5’-苯甲酸酯0.679g,得率为97.8%;反应区域选择性为99.5%(产物阿糖胞苷5’-苯甲酸酯浓度达99%以上)。
实施例8
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、636g(3.75×10-2mol)硬脂酸乙烯酯、0.5L 80%(v/v)离子液C4MIm·PF6和吡啶混合溶剂的加入到具塞三角瓶中,接着加入50,000U来源于Candida antarctica的脂肪酶(10,000U/g),常压下置于60℃、250rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应4h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷5’-硬脂酸酯1.02g,得率为97.0%;反应区域选择性为99.9%(产物阿糖胞苷5’-硬脂酸酯浓度达99%以上)。
实施例9
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、14.78g(3.75×10-2mol)二十四碳酸乙烯酯、0.5L 30%(v/v)苯甲醚和二甲基甲酰胺混合溶剂的加入到具塞三角瓶中,接着加入50,000U来源于Pseudomonas cp.的脂肪酶(30,000U/g),常压下置于60℃、250rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应4h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷3’-二十四碳酸酯1.18g,得率为97.0%;反应区域选择性为99.9%(产物阿糖胞苷3’-二十四碳酸酯浓度达99%以上)。
实施例10
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、8.48g(3.75×10-2mol)苯甲酸酐、0.5L 35%(v/v)甲苯和二噁烷混合溶剂的加入到具塞三角瓶中,接着加入400,000U来源于Pseudomonas cp.的脂肪酶(30,000U/g),常压下置于30℃、250rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应6h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷3’-苯甲酸酯0.69g,得率为97.0%;反应区域选择性为99.9%(产物阿糖胞苷3’-苯甲酸酯浓度达99%以上)。
实施例11
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、564g(2.05mol)油酸乙烯酯、0.1L 20%(v/v)乙腈和二噁烷混合溶剂的加入到具塞三角瓶中,接着加入25,000U来源于Candida antarctica的脂肪酶(10,000U/g),常压下置于30℃、250rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应6h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷5’-油酸酯1.01g,得率为97.0%;反应区域选择性为99.9%(产物阿糖胞苷5’-油酸酯浓度达99%以上)。
实施例12
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、101.3g(2.05×10-1mol)月桂酸酐、0.5L 35%(v/v)庚烷-二甲基甲酰胺混合溶剂的反应液加入到具塞三角瓶中,接着加入100,000U来源于Burkholderia acepacia的脂肪酶(30,000U/g),常压下置于40℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应12h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷3’-月桂酸酯0.831g,得率为96.0%,反应区域选择性为99.5%(产物阿糖胞苷3’-月桂酸酯浓度达99%以上)。
实施例13
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、111.9g(2.05×10-1mol)油酸酐、0.5L 35%(v/v)辛醇-二甲基甲酰胺混合溶剂的反应液加入到具塞三角瓶中,接着加入100,000U来源于Bacillus cp.的蛋白酶(2,400U/g),常压下置于40℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应12h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷5’-油酸酯0.938g,得率为96.0%,反应区域选择性为99.5%(产物阿糖胞苷5’-油酸酯浓度达99%以上)。
实施例14
将含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、32.4g(2.05×10-1mol)丁酸酐、0.5L 35%(v/v)乙酸乙酯-二甲基甲酰胺混合溶剂的反应液加入到具塞三角瓶中,接着加入100,000U来源于Bacillus cp.的蛋白酶(2,400U/g),常压下置于40℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡,反应12h后,反应混合物经过滤除酶,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,即得产物阿糖胞苷5’-丁酸酯0.618g,得率为96.0%,反应区域选择性为99.5%(产物阿糖胞苷5’-丁酸酯浓度达99%以上)。
Claims (5)
1.一种酶催化制备阿糖胞苷酯的方法,其特征在于以羧酸烯醇酯为酰基供体,利用酶催化阿糖胞苷进行酰化反应,合成得到阿糖胞苷酯;包括:在反应器中加入阿糖胞苷、反应介质、羧酸烯醇酯或者酸酐,按酶与阿糖胞苷的用量之比为50,000~800,000U/g的比例加入脂肪酶,在温度为30~60℃、振荡速度为150~250rpm、常压下反应3~12小时后,分离得到阿糖胞苷酯;
所述脂肪酶来源于Candida antarctica、Thermomyces lanuginosus、Rhizomucor miehei、Burkholderia acepacia、Pseudomonas cp.,蛋白酶来源于Bacillus cp.;
所述羧酸烯醇酯或者酸酐中酰基的碳原子数为C4~C24,含0~6个双键;
所加入的羧酸烯醇酯或者酸酐与阿糖胞苷的摩尔比为9∶1~1000∶1;
所述反应介质是有机溶剂和/或离子液;其用量是0.2~1L/g阿糖胞苷。
2、根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述有机溶剂是饱和脂肪烃、不饱和脂肪烃、芳烃类、酯类、脂肪族醚、芳醚、醇类、含氮化合物溶剂中的一种或一种以上。
3、根据权利要求2所述的方法,其特征在于所述有机溶剂中,疏水性有机溶剂占10~35%体积。
4、根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于离子液的阴离子为四氟硼酸根离子或者六氟磷酸根离子,阳离子为1-烷基-3-甲基咪唑离子。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于分离得到阿糖胞苷酯的方法包括:反应混合物经过滤除酶后,真空蒸发浓缩,浓缩液真空干燥后以甲醇或者乙醇或者乙酸乙酯重结晶或者经过硅胶柱色谱分离纯化,得阿糖胞苷酯。
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