CN114982822B - 一种壳寡糖肉桂酸酯及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳寡糖肉桂酸酯及其制备方法与应用；本发明壳寡糖肉桂酸酯由壳寡糖和肉桂酸酯化反应得到，结构式为本发明通过将壳寡糖和肉桂酸加入到有机溶剂中，再加入脂肪酶得反应液，振荡反应，分离纯化得到壳寡糖肉桂酸酯。本发明的壳寡糖肉桂酸酯是一种多酚氧化酶抑制剂，能有效抑制多酚氧化酶的活性从而抑制果蔬褐变的发生，同时还具有抗氧化活性和抑菌活性，可作为果蔬保鲜剂用于果蔬的防腐、保鲜及护色。
Description
技术领域
本发明属于食品保鲜技术领域；具体涉及一种壳寡糖肉桂酸酯及其制备方法与应用。
背景技术
随着人类现代城市生活节奏步伐的逐步加快，人们开始更加注意追求简便、快捷、干净、营养的餐饮产品，这也使得快餐类行业发展如日中天。鲜切水果的即食性特点为消费者的食用过程带来了便利性，故受到了广大消费者的喜爱，在经济飞速发展的今天拥有着越来越广阔的市场空间。然而鲜切水果在放置一段时间后会发生一系列表面和质地的变化，包括发生褐变现象、微生物大量滋生、果肉变软等等。其中在短时间内最明显的就是颜色的变化，这些现象是由酶促褐变和非酶促褐变引起的，非酶促褐变一般不涉及酶的参与，主要是果蔬成分中的单一化合物或多种成分的化学反应产生棕色物质，而果蔬的酶促褐变主要是由于果蔬在经过削皮、切分或是贮藏过程中温度发生严重的变化引起果蔬的物理组织损伤，水果中的多酚氧化酶会在氧气的存在下催化内源性多酚类物质发生一系列反应，进而生成褐色物质。此外，水果经切分后会破坏果肉细胞的细胞膜和细胞壁，改变了内容物的流动性。在正常情况下水果中原先活性较低的酶在水果切分后酶活性被激活，其中就包括水果内存在的果胶酶和蛋白质水解酶，在酶的作用下果胶会与纤维素发生剥离，进而生成果胶酸引发果实变软。目前商业上的最常用的鲜切水果保鲜方法是低温冷藏保鲜和保鲜膜封装保鲜，研究性工作中探讨了很多新型的保鲜技术，来延长鲜切果蔬的货架期，其中包括添加保鲜剂、采用气调包装、涂膜保鲜对果蔬进行保鲜。但是目前还没有发现涉及本发明的壳寡糖肉桂酸酯作为鲜切水果的保鲜剂，本发明的壳寡糖肉桂酸酯具有抑制多酚氧化酶活性及抑制鲜切水果褐变、失重、可溶性固形物含量降低和软化的功效。
壳寡糖是由甲壳素经脱乙酰得到壳聚糖后在经壳聚糖进一步降解得到的低聚合度多糖。壳寡糖具有良好的抗氧化性、抗菌性、调节肠道菌群、抗肿瘤以及抗炎等活性，使其在医药、美容、纺织等领域具有广阔的应用前景。但由于壳寡糖的某些理化活性较差，如壳寡糖的抗氧化活性低于现有的一些化学合成抗氧化剂，只能作为辅助型抗氧化剂，应用受到限制。已有研究表明，通过对壳寡糖进行甲基化、烷基化、氧化、酰化等各类改性可明显提高壳寡糖的抗氧化活性及抗菌活性。
目前，通过对壳寡糖改性以提高其抗氧化和抗菌活性的方法包括化学法和生物法。有研究者利用化学法将2，4-二氯苯氧乙酸、富马酸单甲酯和肉桂醇接入壳寡糖的羟基上(袁晓娴.基于壳寡糖羟基改性的衍生物的制备及其性质的研究[D].江南大学,2019.)该方法通常需要经过多个反应步骤，包括对壳寡糖的氨基进行选择性保护、活化反应物的羧基、氨基脱保护反应及产物的分离纯化等等，反应繁琐。此外，也有通过生物催化法对壳寡糖进行一系列的改性，最常用的便是利用漆酶催化酚类物质接枝壳寡糖上(余成华.漆酶催化氧化促进壳聚糖—酚类物质接枝的研究[D].天津科技大学,2014.)，专利CN108676108B通过漆酶催化酚酸类物质与壳寡糖接枝共聚得到高抗菌性及抗氧化性的酚酸接枝类壳寡糖。漆酶催化氧化反应过程中会造成所引入的功能性组分活性基团的丧失，从而不利于壳聚糖生物活性的发挥。因此，探讨新型生物催化方法绿色、高效地合成新型壳寡糖衍生物极具研究意义。也有研究者利用脂肪酶将长链脂肪酸接枝壳寡糖上以改善壳寡糖的脂溶性(稂雄妃.离子液体中酶促棕榈酸壳聚(寡)糖酯的合成及其在纤维素复合材料中应用的研究[D].华南理工大学,2017.)但尚未对该壳寡糖改性产物进行多酚氧化酶活性研究。此外，目前也有许多针对鲜切水果保鲜提出的新方法，专利CN113767974A将乙烯菌核利、壳聚糖、纳他霉素、坑坏血酸、甘油、碳酸氢钠、肉桂酸、甲醇钠溶液、海藻寡糖以及迷迭香通过物理混合后制备了一种水果保鲜剂，对水果表皮有显著的保鲜效果。也有研究者直接利用壳寡糖和壳聚糖对鲜切水果进行保鲜，发现壳寡糖和壳聚糖涂膜处理后能延长鲜切菠萝的寿命(张慧欣,张红,汪梦,车雨晴.壳聚糖、壳寡糖涂膜保鲜对鲜切菠萝品质的影响[J].中国果菜,2021,41(12):1-6.)。目前还并没有关于壳寡糖肉桂酸酯在鲜切水果保鲜上的研究，针对现有研发状况，本发明利用脂肪酶催化合成壳寡糖肉桂酸酯，并研究了该衍生物的理化活性及在鲜切水果中的应用效果。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种脂肪酶催化合成壳寡糖肉桂酸酯的方法，该方法具有反应效率高，条件温和，专一性强，对环境污染少等特点。同时本发明提供一种有效抑制多酚氧化酶活性，应用于鲜切水果，用于鲜切水果防腐保鲜及护色的新涂料。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种壳寡糖肉桂酸酯，由壳寡糖和肉桂酸酯化反应得到，结构式如下：
其中，R表示-OH或-CO-CH＝CH-C6H5，-OH：-CO-CH＝CH-C6H5＝41：9～ 27:73；壳寡糖的分子量≤2000，脱乙酰度≥90％。
本发明中壳寡糖肉桂酸酯是3’-O-壳寡糖肉桂酸酯酯，3’6’-O-壳寡糖肉桂酸酯，6’-O-壳寡糖肉桂酸酯。
优选的，对DPPH自由基清除率>64.0％；对大肠杆菌抑制率>56.7％；对金黄色葡萄球菌抑制率>61.2％；对黑色素抑制率>81.9％。
上述的壳寡糖肉桂酸酯的制备方法，反应路线如下所示：
包括以下步骤：
将壳寡糖和肉桂酸加入到有机溶剂中，再加入脂肪酶得反应液，振荡反应，分离纯化得到壳寡糖肉桂酸酯。
优选的，所述壳寡糖和肉桂酸的质量比为489:222～489:2220；所反应的肉桂酸浓度为8.88mg/mL～88.8mg/mL。
进一步优选的，所述反应液中壳寡糖浓度为19.56mg/mL，肉桂酸浓度为 53.28mg/mL。
优选的，所述脂肪酶包括Novozym435(来源于Candida antarctica，type B)、Lipozyme TLIM(来源于Thermomyces lanuginosus)、Lipozyme 40086(来源于Rhizomucormiehei)、Lipozyme PS IM(来源于Pseudomonas cepacia)、Lipozyme AY 30(来源于Candida rugosa)、Amano Lipase A(来源于Aspergillus niger Porcine)、Lipolase100T、Porcine pancreatic lipase(来源于猪胰腺)中的至少一种；
优选的，所述反应液中脂肪酶的质量浓度为5mg/mL～30mg/mL。
优选的，所述有机溶剂为二甲基亚砜和叔戊醇，二甲基亚砜和叔戊醇的体积比为1:1～3:1。
优选的，所述振荡反应的温度为35℃～65℃，时间为6～36h。
上述的壳寡糖肉桂酸酯在制备抗氧化剂或抑菌剂中的应用。
上述的壳寡糖肉桂酸酯在制备黑色素抑制剂中的应用。
上述的壳寡糖肉桂酸酯在鲜切水果保鲜中的应用。
本发明中所述的壳寡糖肉桂酸酯具有很强的DPPH自由基清除率，总还原力水平，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制率，能抑制多酚氧化酶活性，具有抑制褐变的发生。
根据本发明的实验例，本发明的壳寡糖肉桂酸酯比作为辅助型抗氧化剂的壳寡糖具有更强的DPPH自由基清除率，总还原力水平，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制率，多酚氧化酶抑制效果。这一结果表明，本发明的壳寡糖肉桂酸酯可作为有效的鲜切水果保鲜剂。
本发明中提及的先切水果的变质是由一系列因素导致的，其中包括水果表面颜色发生褐变，内容物流失引起的失重，水果的质地变软，微生物的侵染等。
根据本发明的实验例本发明所提供的壳寡糖肉桂酸酯，比壳寡糖及常用的抗氧化剂VC具有更好的鲜切水果保鲜效果，特别是高取代度的壳寡糖肉桂酸酯，对鲜切水果的保鲜效果最为卓越。通过所述结果可知，本发明的壳寡糖肉桂酸酯可以用于鲜切水果的保鲜防腐及护色。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明利用脂肪酶Novozym 435高效合成了不同取代度的壳寡糖肉桂酸酯。本发明的壳寡糖肉桂酸酯可作为鲜切水果的表面涂料用于水果的保鲜防腐及护色，应用于鲜切水果上时比壳寡糖原样及市面上常用的抗氧化剂(VC)具有更好的保鲜效果，特别是高取代度的壳寡糖肉桂酸酯，对鲜切水果的保鲜效果最为卓越。同时，对DPPH自由基清除率>64.0％；对大肠杆菌抑制率>56.7％；对金黄色葡萄球菌抑制率>61.2％；对多酚氧化酶活性抑制率>81.9％。
附图说明
图1为肉桂酸、壳寡糖和实施例1的壳寡糖肉桂酸酯的紫外-可见吸收光谱。
图2为肉桂酸、壳寡糖和实施例1的壳寡糖肉桂酸酯的傅里叶变换红外光谱。
图3为实施例1的壳寡糖肉桂酸酯(a)、壳寡糖(b)、肉桂酸(c)的1H核磁共振图谱。
图4为壳寡糖及实施例1-3的三种不同取代度的壳寡糖肉桂酸酯的DPPH 清除率曲线图。
图5为不同浓度的VC、壳寡糖、实施例1的低取代度壳寡糖肉桂酸酯和实施例3的高取代度壳寡糖肉桂酸酯对多酚氧化酶的抑制效果柱状图。
图6为实施例1的低取代度壳寡糖肉桂酸酯(a)和实施例3的高取代度壳寡糖肉桂酸酯(b)对多酚氧化酶的抑制类型图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，需说明的是，本发明的实施方式不限于此，这些实施例不构成对本发明保护范围的限制。
以下实施例中所用的壳寡糖的分子量≤2000(购买自麦克林试剂公司，C875644)；
实施例1
利用脂肪酶Novozym 435催化合成壳寡糖肉桂酸酯
将489mg壳寡糖、222mg肉桂酸、Novozym 435脂肪酶(30mg/mL)、25 mL二甲基亚砜/叔戊醇(3:1，v/v)混合有机溶剂加入100mL锥形瓶中，在50℃、 180r/min条件下反应24h收集反应液，加入于体积3倍的无水乙醇，静置24小时后吸取上层液体，离心后收集产物(取代度DS＝0.36)。
实施例2
利用脂肪酶Novozym 435催化合成壳寡糖肉桂酸酯
将489mg壳寡糖、1332mg肉桂酸、Novozym 435脂肪酶(30mg/mL)、25 mL二甲基亚砜/叔戊醇(3:1，v/v)混合有机溶剂加入100mL锥形瓶中，在35℃、 180r/min条件下反应24h收集反应液，加入于体积3倍的无水乙醇，静置24小时后吸取上层液体，离心后收集产物(取代度DS＝0.89)。
实施例3
脂肪酶Novozym 435催化合成壳寡糖肉桂酸酯
将489mg壳寡糖、1332mg肉桂酸、Novozym 435脂肪酶(30mg/mL)、25 mL二甲基亚砜/叔戊醇(3:1，v/v)混合有机溶剂加入100mL锥形瓶中，在50℃、 180r/min条件下反应24h收集反应液，加入于体积3倍的无水乙醇，静置24小时后吸取上层液体，离心后收集产物(取代度DS＝1.46)。
实施例4
利用脂肪酶Lipozyme TLIM催化合成壳寡糖肉桂酸酯
将489mg壳寡糖、1332mg肉桂酸、Lipozyme TLIM脂肪酶(30mg/mL)、 25mL二甲基亚砜/叔戊醇(3:1，v/v)混合有机溶剂加入100mL锥形瓶中，在 50℃、180r/min条件下反应24h收集反应液，加入于体积4倍的无水乙醇，静置24小时后吸取上层液体，离心收集产物(取代度DS＝1.31)。
实施例5
利用脂肪酶Lipozyme AY 30催化合成壳寡糖肉桂酸酯
将489mg壳寡糖、1332mg肉桂酸、Lipozyme AY 30(30mg/mL)、25mL 二甲基亚砜/叔戊醇(3:1，v/v)混合有机溶剂加入100mL锥形瓶中，在50℃、 180r/min条件下反应24h收集反应液，加入于体积3倍的无水乙醇，静置24小时后吸取上层液体，离心收集产物(取代度DS＝1.06)。
对实施例1-5合成产物产物利用紫外可见吸收光谱、红外光谱及核磁共振氢谱对反应产物进行了结构表征，确定了产物酯结构。紫外可见光谱中在272nm、 221nm、204nm处有肉桂酸的特征吸收峰且在192nm处有壳寡糖的特征吸收峰；红外光谱中在1730cm-1左右处出现了酯键的羰基(C＝O)吸收峰，1436cm-1左右处出现了苯环上碳碳双键(C＝C)吸收峰，且在1706cm-1范围处未出现氨酰化的羰基吸收峰；1H核磁共振图谱中在δ＝6.55～7.69ppm左右处出现的特征峰与肉桂酸在δ＝6.55～7.71ppm处肉桂酸芳香环上氢的特征峰相对应，并且在δ＝12.36ppm处未出现肉桂酸羧基氢的特征峰；综上结果表明，在非水相混合有机溶剂中脂肪酶能催化壳寡糖酯化反应位点为C3和C6位羟基，生成了壳寡糖肉桂酸酯衍生物(如图1-3所示)。
实施例6
壳寡糖肉桂酸酯对DPPH自由基清除效果
通过测定517nm下的吸光值来评价DPPH自由基清除活性。分别将100μL 浓度为2.5mg/mL的壳寡糖、低取代度壳寡糖肉桂酸酯(实施例1，DS＝0.36)、中取代度壳寡糖肉桂酸酯(实施例2，DS＝0.89)高取代度壳寡糖肉桂酸酯(实施例3，DS＝1.46)加入到96孔板中，然后加入100μL 1×104mol/L DPPH无水乙醇溶液，在室温下避光保存10分钟。用酶标仪测定517nm下的吸光值，设置三组平行，最终取平均值。用去离子水代替样品溶液以获得吸光度A0。使用以下公式计算自由基清除率：
DPPH清除率(％)＝(A0-As)÷A0×100％ (3-1)
A0是加入DPPH无水乙醇溶液中的添加去离子水的吸光度；
AS为无水乙醇溶液中添加壳寡糖及壳寡糖衍生物溶液的吸光度；
计算所得低取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝0.36)的DPPH自由基抑制率为 64.0％，中取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝0.89)的DPPH自由基抑制率为72.0％，高取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝1.46)的DPPH自由基抑制率为79.0％，高于壳寡糖的DPPH自由基清除率(53.0％)，结果见图4。
实施例7
壳寡糖肉桂酸酯的抑菌活性
抑菌活性测定，通过平板计数法测定抑菌效果，分别取1.0mL浓度为 2mg/mL的抑菌样品和300μL 103CFU/mL的菌液于无菌培养皿中，以蒸馏水作为空白对照，然后倒入一定量的液体培养基，混合均匀，在超净工作台放置一段时间至冷却凝固后转移到37℃恒温培养箱中培养12h，观察记录平板中菌的生长情况，设置三组平行，最终取平均值。抑菌率计算公式如下：
抑菌率(％)＝(TCK－T)÷TCK100％ (3-2)
TCK为空白组中的菌落总数；
T为抑菌样品中的菌落总数。
计算所得低取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝0.36)对大肠杆菌的抑制率为 56.71％，对金黄色葡萄球菌抑制率为61.19％。高取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝1.46) 对大肠杆菌的抑制率为79.8％，对金黄色葡萄球菌的抑制率为87.2％。均高于壳寡糖对大肠杆菌的抑制率(11.9％)和对金黄色葡萄球菌的抑制率(19.6％)。
实施例8
壳寡糖肉桂酸酯的黑色素抑制率
分别配制pH＝6.8的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，1mg/mL的L-多巴溶液，200 u/mL的多酚氧化酶溶液，同时配制浓度为4mg/mL的壳寡糖、低取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝0.36)、高取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝1.46)、VC溶液待用。按以下分组进行加样：
试管1：1mL PBS+0mL样品+1mL酶液+1mL L-多巴；
试管2：2mL PBS+0mL样品+0mL酶液+1mL L-多巴；
试管3：0mL PBS+1mL样品+1mL酶液+1mL L-多巴；
试管4：1mL PBS+1mL样品+0mL酶液+1mL L-多巴；
将各测试样摇匀在在室温下放置15min后，分别吸取一定量不同试管中的溶液于酶标版中，然后在475nm处测吸光度(A)，设置三组平行，并按下面公式计算样品对黑色素抑制率：
I＝[(A1-A2)-(A3-A4)]/(A1-A2)×100％ (4-1)
式中：A1～A4为试管1～4在波长475nm处的吸光度。
计算所得壳寡糖对黑色素生成抑制率为68.10％，低取代度壳寡糖肉桂酸酯 (DS＝0.36)、高取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝1.46)和VC对黑色素生成抑制率分别为82.8％、90.5％和86.8％，结果见图5。
实施例9
壳寡糖肉桂酸酯对多酚氧化酶的抑制类型
在酶标板中分别加入一定体积浓度为0.5、1、2、3、4mg/mL的壳寡糖、低取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝0.36)、高取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝1.46)溶液，然后分别加入一定体积一定浓度的多酚氧化酶溶液和一定体积不同浓度的L-多巴溶液，始终保证试管中混合溶液容量为3mL，在总体系中，保持酶的浓度不变，改变底物L-多巴的浓度，以不加抑制剂溶液作为空白对照，同样在酶标板中测量混合溶液在波长475nm处10min内的吸光度值变化，分别测定低取代度壳寡糖肉桂酸酯和高取代度壳寡糖肉桂酸酯在5种不同浓度条件下对酶活力的影响，设置三组平行，最终结果取平均值，以L-多巴浓度的倒数为横坐标，反应速率倒数为纵坐标做Lineweaver-Burk双倒数图，依照最大反应速度(Vmax) 和米氏常数(Km)来判断抑制剂对酶的抑制类型。
研究表明若得到一组相交于Y轴上的直线，该抑制剂表现为竞争型抑制；若得到一组相交于X轴上的直线，该抑制剂表现为非竞争型抑制；若得到一组相交于第二或第四象限内的直线，该抑制剂为混合型抑制；得到一组互相平行的直线，则该抑制剂为反竞争型抑制。
结果表明所添加的低取代度壳寡糖肉桂酸酯不改变酶促反应的最大反应速度(Vmax)，只影响米氏常数(Km)，其抑制类型为竞争型可逆抑制；即Km值随着反应体系中壳寡糖肉桂酸酯浓度的增加而增加，体系中底物表现出与酶的亲和力不断下降，表明低取代度壳寡糖肉桂酸酯阻碍了酶与底物的结合。而高取代度壳寡糖肉桂酸酯对多酚氧化酶的抑制为混合型抑制；其双倒数曲线图的斜率与高取代度壳寡糖肉桂酸酯浓度呈现线性关系，表明高取代度壳寡糖肉桂酸酯可以是通过与酶的活性位点结合从而阻止酶与底物的结合，也可以先与底物结合从而使酶的催化活性降低，或是通过与酶和底物形成的复合物结合抑制反应的进行，结果见图6。
实施例10
壳寡糖肉桂酸酯在鲜切水果上的应用
分别使用蒸馏水、壳寡糖、低取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝0.36)、高取代度壳寡糖肉桂酸酯(DS＝1.46)和VC溶液处理鲜切苹果和芒果，如表1所述，本发明所提供的壳寡糖肉桂酸酯，比壳寡糖及常用的抗氧化剂VC具有更好的鲜切水果保鲜效果，特别是高取代度的壳寡糖肉桂酸酯，对鲜切水果的保鲜效果最为卓越。
表1
鲜切苹果和鲜切芒果在第8天的色泽(L*value)、失重率(％)、可溶性固形物含量(％)和硬度值(kg·cm-2)
以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种壳寡糖肉桂酸酯在制备抗氧化剂中的应用，其特征在于，所述壳寡糖肉桂酸酯由壳寡糖和肉桂酸酯化反应得到，结构式如下：
其中，R表示-OH或-CO-CH=CH-C6H5，-OH：-CO-CH=CH-C6H5 =27:73；壳寡糖的分子量≤2000，脱乙酰度≥90%。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述壳寡糖肉桂酸酯对DPPH自由基清除率>64.0%。
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