CN104818307A

CN104818307A - 全细胞催化制备蔗糖酯的方法

Info

Publication number: CN104818307A
Application number: CN201510183064.4A
Authority: CN
Inventors: 赵光磊; 张奔; 林丹; 李晓凤
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2015-08-05

Abstract

本发明公开了全细胞催化制备蔗糖酯的方法。该方法为：在蒸馏水中加入酵母浸膏、硫酸铵、磷酸氢二钾、结晶硫酸镁和诱导剂为培养基诱导培养施氏假单胞菌，培养后离心分离，并冷冻干燥制成全细胞催化剂；在反应器中配成叔戊醇/二甲基亚砜双溶剂反应介质，加入蔗糖、全细胞催化剂和甲基丙烯酸乙烯酯，常压下反应后，合成了蔗糖酯；所得产物利用薄层层析色谱法分离出高纯度的蔗糖酯。本发明用全细胞催化法合成蔗糖酯，克服了现有技术中化学合成法步骤繁琐、反应效率低、污染环境、选择性低等缺点；也克服了没法合成中所面临的酶的提取这一繁琐步骤，具有反应条件温和、环境友好、反应过程简单可控、产物纯度高、产物易从反应混合体系中分离的优点。

Description

全细胞催化制备蔗糖酯的方法

技术领域

本发明涉及全细胞催化和合成领域，具体涉及全细胞催化制备蔗糖酯的方法。

背景技术

在多元醇型非离子表面活性剂中，糖类脂肪酸酯和烷基葡萄糖苷是应用最广泛的两种表面活性剂。特别是糖类脂肪酸酯以其无毒、对皮肤无刺激作用得到广泛的应用。其更具有去污、乳化、洗涤、分散、湿润、扩散、抗氧、渗透、起泡、粘度调节、杀菌、防止老化、防止晶析和抗静电等很多功能，在日化、食品和医药行业得到了广泛应用。

蔗糖脂肪酸酯是由蔗糖和脂肪酸酯反应生成的一大类有机化合物。其在人体类可分解为葡萄糖和脂肪酸，进而作为营养物质被人体消化吸收。由于蔗糖酯的合成原料蔗糖和脂肪酸酯都是可再生资源，且蔗糖酯以其无毒、无溴、无刺激，良好的表面活性性能而广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、洗涤剂、纺织及农牧业等行业。这种以蔗糖为原料的蔗糖脂肪酸脂因其高度的安全性和非凡的功用，已相继被中国、日本、美国、欧盟、世界粮农及卫生组织批准作为食品添加剂和药用辅料。蔗糖酯的研究也受到了科技界的重视。

蔗糖是多种制品的原料。发酵形成的焦糖可以用作酱油的增色剂。根据资料介绍，以蔗糖为原料和辅料的产品有56类2300多种，其中主要以食品为主。另外，蔗糖还是酒精、酵母、柠檬酸、乳酸、甘油、醇类、药品等的原料。自然界分布最广的非还原性二糖，存在于许多植物中，以甘蔗和甜莱中含量最高，因此得名。纯净的蔗糖是无色晶体易溶于水，比葡萄糖、麦芽糖甜，但不如果糖甜。蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖缩合失去一分子水而成，葡萄糖分子中的醛基和果糖分子中的酮基都被破环，因此没有还原性，属非还原性二糖。蔗糖在酸或蔗糖酶的作用下，水解生成等量的葡萄糖和果糖。因此其水解产物有还原性。蔗糖是各种食品的主要甜味剂，也可用于制葡萄糖和果糖。糖是人类基本的粮食之一，已有几千年的历史。本研究旨在用新方法全细胞催化法对蔗糖进行改性并制成蔗糖酯为今后食品添加剂以及表面活性剂添加新的合成思路。

目前，以糖基作为骨架或者侧链的聚合物被称为“（含）糖聚合物”，其研究非常活跃，特别是对于可控合成以及精确制备的具有不同结构（比如线型、星状、超枝化以及树枝状）的糖聚合物已经成为研究热点，但目前其研究范围主要集中在生物医学和生物材料领域。尽管如此，由于合成的难度和性能的复杂，导致了对新颖的生物降解性聚合物/糖聚合物杂化材料的合成与性能研究仍然不足。目前，化学法合成含糖高分子聚合物的过程中单体的合成路径往往较复杂，试剂多，副产物多。不仅如此，化学法合成还有诸如反应条件苛刻、环境不友好等不足。这在一定程度上限制了含糖高分子聚合物的发展。

非水相溶剂体系中脂肪酶催化反应除了具有高度的区域选择性和立体选择性，不需要基团保护等传统水解酶的优点外，还可以催化酯交换、酯化、氨解等合成反应，可进行水不溶性物质的催化转化，大大拓展了酶的作用底物范围，不仅如此，它还有利于酶的回收和重复利用、降低分离过程的能耗，提高了酶的热稳定性以及减少和防止水引起的副反应和微生物污染，可以通过控制不同的反应条件，可以在糖的特定羟基上进行反应，制备结构确定的含糖的不饱和单体。自Klibanov首次报道非水相中的酶催化性能以来，非水酶学在最近20多年里取得了长足的发展。就目前而言，国际上对非水相条件下糖酯单体合成的研究较少，研究领域也仅限于生物医药，Dordick等在非水相条件下利用酶催化丙烯酸乙烯酯与甲基半乳糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷以及蔗糖等进行酯交换反应，制备了结构确定的含糖的不饱和单体。并且利用所得单体制备了生物相容水凝胶等聚合物。国内仅有魏远安和刘荣莉等报道了采用脂肪酶在非水相条件下合成了蔗糖基聚合物用于水果保鲜剂的研究。并且糖类化合物在有机溶剂中的溶解性很差，这在一定程度上阻碍了非水相中酶促催化糖酯单体合成的发展。

全细胞催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行化学转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化。该法是介于发酵法和提取酶催化法之间的一种生物催化技术。细胞内完整的多酶体系可以实现酶的级联反应，从而弥补酶法催化中级联催化过程不易实现的不足，提高了催化效率，同时，又省去了繁琐的酶纯化过程，制备更加简单，生产成本更低。相比发酵法，全细胞催化克服了发酵法生长周期长、代谢产物复杂、底物转化率低、产物分离提取困难以及能耗高等缺点。相比提取酶催化反应，全细胞中的酶系保持原有生活细胞所处的状态和特定位置，酶稳定性更好，半衰期更长，适应性更强，更易实现能量和辅酶的原位再生。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术存在的不足，提供一种环境友好、生产成本低、反应过程简单可控、产物易分离的叔戊醇/二甲基亚砜双溶剂体系中生物催化制备蔗糖脂肪酸酯的新方法，一种在叔戊醇/二甲基亚砜双溶剂体系中用施氏假单胞菌催化合成蔗糖酯的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

全细胞催化合成蔗糖脂肪酸酯的方法，包括以下步骤：

（1）在蒸馏水中加入2~20g/L的酵母浸膏，2~20g/L的硫酸铵，0.5~5g/L的磷酸氢二钾，0.1~1g/L的结晶硫酸镁以及2~20g/L的诱导剂为培养基诱导培养施氏假单胞菌，培养48~72 h后离心分离收集，并冷冻干燥制成全细胞催化剂；

（2）在反应器中按叔戊醇与二甲基亚砜的体积比为2:1～10:1的比例配成叔戊醇/二甲基亚砜双溶剂反应介质，按蔗糖的用量为5～60 mg/ml加入蔗糖，按生物催化剂与蔗糖的重量比为0.5:1～10:1的比例加入全细胞催化剂，按酰基供体与蔗糖的摩尔比为1:1～50:1加入甲基丙烯酸乙烯酯，在温度为30～60 ℃、振荡速度为150～250 rpm、常压下反应24～72 h后，合成了蔗糖酯；

（3）利用薄层色谱对产物进行分析和分离，以不加催化剂的反应体系做空白对照对比，用氯仿:甲醇:水为4:1:1~8:1:1作为展开剂，洗脱之后的硅胶板喷洒10%的硫酸乙醇溶液，然后在105 ℃烘箱中烘烤5 min显色，确定糖与糖脂的分离情况。

上述方法中，所述全细胞的培养与应用，其中包括全细胞种类的选取以及其培养方法的优化，并最终运用于催化合成蔗糖酯。

上述方法中，所生成的蔗糖酯与溶剂的分离与其结构的鉴定。

上述方法中，上述的甲基丙烯酸乙烯酯也可替换为其他饱和、非饱和的、直链、支链、长链或短链的脂肪酸酯。

上述方法中，所述全细胞催化剂为假单胞菌类、霉菌类或者芽孢杆菌类。

上述方法中，所述诱导剂为无水葡萄糖、吐温80或大豆油。

本发明的原理：采用叔戊醇/二甲基亚砜双溶剂体系，以全细胞作为催化剂，催化蔗糖和甲基丙烯酸乙烯酯进行酯化反应，得到蔗糖脂肪酸酯。

与现有的技术相比，本发明具有如下的优点：

（1）采用高效、高稳定性的全细胞催化剂来催化蔗糖合成蔗糖酯，克服了现有技术中酶容易失活，反应效率低的缺点；利用全细胞催化合成的区域选择性生成单一产物，反应过程简单可控、产物易分离；

（2）反应终止采用过滤除菌体的方法，简便迅速，克服了现有技术中高温灭酶能耗大、酶蛋白易残留等缺点；且全细胞催化剂可反复使用，操作稳定性高，降低生产成本；

（3）利用了非水相酶催化的新技术，采用叔戊醇/二甲基亚砜双溶剂作为反应介质，未反应的甲基丙烯酸乙烯酯可用有机溶剂萃取，旋转蒸发除去，然后再利用薄层层析色谱进行分离纯化，简化了产物分离步骤，得到的产品杂质少；经蒸发除去的有机溶剂可以回收重复利用，降低了生产成本；且有利于对环境的保护；

（4）反应条件温和，既节约能源，又无含碱废液排放，对环境友好；

（5）反应所需的全细胞催化剂生产简单，便宜。省略了以往酶法催化中酶的提取步骤，大大降低了生产成本，提高了生产效率。

附图说明

图1为蔗糖与甲基丙烯酸乙烯酯反应前的液相色谱图，图中2.8min出现的是蔗糖峰。

图2为蔗糖与甲基丙烯酸乙烯酯反应后的液相色谱图，图中2.8min出现的是蔗糖峰，4.3min出现的是蔗糖酯峰。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例 1

在1L蒸馏水中加入5g/L的酵母浸膏，5g/L的硫酸铵，1g/L的磷酸氢二钾，0.2g/L的结晶硫酸镁以及5g/L的无水葡萄糖为培养基诱导培养施氏假单胞菌（购于广东微生物研究所，货号：GIM1.446），培养48 h后离心收集，并冷冻干燥制的全细胞催化剂；把60 mg蔗糖、0.06 g（蔗糖比全细胞催化剂的质量比为1:1）施氏假单胞菌全细胞催化剂、20 mmoL（蔗糖与酰基供体的摩尔比为1:50）甲基丙烯酸乙烯酯和2 ml叔戊醇/二甲基亚砜（体积比为5:1）双溶剂介质放入具塞三角瓶中，置于30 ℃、200 rpm的气浴恒温振荡器内振荡，反应48 h后，其反应转化率为37.5%。

实施例2

在1L蒸馏水中加入5g/L的酵母浸膏，5g/L的硫酸铵，1g/L的磷酸氢二钾，0.2g/L的结晶硫酸镁以及5g/L的无水葡萄糖为培养基诱导培养施氏假单胞菌，培养48 h后离心收集，并冷冻干燥制的全细胞催化剂；把60mg蔗糖、0.06 g（蔗糖比全细胞催化剂的质量比为1:1）施氏假单胞菌全细胞催化剂、20 mmoL（蔗糖与酰基供体的摩尔比为1:50）甲基丙烯酸乙烯酯和2 ml叔戊醇/二甲基亚砜（体积比为5:1）双溶剂介质放入具塞三角瓶中，置于40 ℃、200 rpm的气浴恒温振荡器内振荡，反应48 h后，其反应转化率为48.4%。

实施例3

在1L蒸馏水中加入5g/L的酵母浸膏，5g/L的硫酸铵，1g/L的磷酸氢二钾，0.2g/L的结晶硫酸镁以及5g/L的无水葡萄糖为培养基诱导培养施氏假单胞菌，培养48 h后离心收集，并冷冻干燥制的全细胞催化剂；把60 mg蔗糖、0.06 g（蔗糖比全细胞催化剂的质量比为1:1）施氏假单胞菌全细胞催化剂、20 mmoL（蔗糖与酰基供体的摩尔比为1:50）甲基丙烯酸乙烯酯和2 ml叔戊醇/二甲基亚砜（体积比为5:1）双溶剂介质放入具塞三角瓶中，置于50 ℃、200 rpm的气浴恒温振荡器内振荡，反应48 h后，其反应转化率为24.9%。

实施例4

在1L蒸馏水中加入10g/L的酵母浸膏，10g/L的硫酸铵，2g/L的磷酸氢二钾，0.4g/L的结晶硫酸镁以及10g/L的无水葡萄糖为培养基诱导培养施氏假单胞菌，培养48 h后离心收集，并冷冻干燥制的全细胞催化剂；把60mg蔗糖、0.06 g（蔗糖比全细胞催化剂的质量比为1:1）施氏假单胞菌全细胞催化剂、20 mmoL（蔗糖与酰基供体的摩尔比为1:50）甲基丙烯酸乙烯酯和2 ml叔戊醇/二甲基亚砜（体积比为5:1）双溶剂介质放入具塞三角瓶中，置于40 ℃、200 rpm的气浴恒温振荡器内振荡，反应48 h后，其反应转化率为14.2%。

实施例5

在1L蒸馏水中加入5g/L的酵母浸膏，5g/L的硫酸铵，1g/L的磷酸氢二钾，0.2g/L的结晶硫酸镁以及5g/L的无水葡萄糖为培养基诱导培养施氏假单胞菌，培养48 h后离心收集，并冷冻干燥制的全细胞催化剂；把60 mg蔗糖、0.12 g（蔗糖比全细胞催化剂的质量比为1:2）施氏假单胞菌全细胞催化剂、20mmoL（蔗糖与酰基供体的摩尔比为1:50）甲基丙烯酸乙烯酯和2 ml叔戊醇/二甲基亚砜（体积比为4:1）双溶剂介质放入具塞三角瓶中，置于40 ℃、200 rpm的气浴恒温振荡器内振荡，反应48 h后，其反应转化率为69.2%。

实施例 6

在1L蒸馏水中加入5g/L的酵母浸膏，5g/L的硫酸铵，1g/L的磷酸氢二钾，0.2g/L的结晶硫酸镁以及10g/L的无水葡萄糖为培养基诱导培养施氏假单胞菌，培养48 h后离心收集，并冷冻干燥制的全细胞催化剂；把60 mg蔗糖、0.12 g（蔗糖比全细胞催化剂的质量比为1:2）施氏假单胞菌全细胞催化剂、4 mmoL（蔗糖与酰基供体的摩尔比为1:10）甲基丙烯酸乙烯酯和2 ml叔戊醇/二甲基亚砜（体积比为4:1）双溶剂介质放入具塞三角瓶中，置于40 ℃、200 rpm的气浴恒温振荡器内振荡，反应48 h后，其反应转化率为71.2%。

实施例7

在1L蒸馏水中加入5g/L的酵母浸膏，5g/L的硫酸铵，1g/L的磷酸氢二钾，0.2g/L的结晶硫酸镁以及10g/L的吐温80为培养基诱导培养施氏假单胞菌，培养48 h后离心收集，并冷冻干燥制的全细胞催化剂；把60 mg蔗糖、0.12 g（蔗糖比全细胞催化剂的质量比为1:2）施氏假单胞菌全细胞催化剂、4 mmoL（蔗糖与酰基供体的摩尔比为1:10）甲基丙烯酸乙烯酯和2 ml叔戊醇/二甲基亚砜（体积比为10:1）双溶剂介质放入具塞三角瓶中，置于40 ℃、200 rpm的气浴恒温振荡器内振荡，反应48 h后，其反应转化率为21.7%。

实施例8

在1L蒸馏水中加入5g/L的酵母浸膏，5g/L的硫酸铵，1g/L的磷酸氢二钾，0.2g/L的结晶硫酸镁以及5g/L的大豆油为培养基诱导培养施氏假单胞菌，培养48 h后离心收集，并冷冻干燥制的全细胞催化剂；把60 mg蔗糖、0.12 g（蔗糖比全细胞催化剂的质量比为1:2）施氏假单胞菌全细胞催化剂、4 mmoL（蔗糖与酰基供体的摩尔比为1:10）甲基丙烯酸乙烯酯和2 ml叔戊醇/二甲基亚砜（体积比为4:1）双溶剂介质放入具塞三角瓶中，置于40 ℃、150 rpm的气浴恒温振荡器内振荡，反应48 h后，其反应转化率为44.2%。

实施例9

在1L蒸馏水中加入5g/L的酵母浸膏，5g/L的硫酸铵，1g/L的磷酸氢二钾，0.2g/L的结晶硫酸镁以及10g/L的无水葡萄糖为培养基诱导培养施氏假单胞菌，培养60 h后离心收集，并冷冻干燥制的全细胞催化剂；把60 mg蔗糖、0.12 g（蔗糖比全细胞催化剂的质量比为1:2）施氏假单胞菌全细胞催化剂、4 mmoL（蔗糖与酰基供体的摩尔比为1:10）甲基丙烯酸乙烯酯和2 ml叔戊醇/二甲基亚砜（体积比为4:1）双溶剂介质放入具塞三角瓶中，置于40 ℃、200 rpm的气浴恒温振荡器内振荡，反应48 h后，其反应转化率为61.4%。

实施例10

在1L蒸馏水中加入5g/L的酵母浸膏，5g/L的硫酸铵，1g/L的磷酸氢二钾，0.2g/L的结晶硫酸镁以及10g/L的无水葡萄糖为培养基诱导培养施氏假单胞菌，培养48 h后离心收集，并冷冻干燥制的全细胞催化剂；把60 mg蔗糖、0.12 g（蔗糖比全细胞催化剂的质量比为1:2）施氏假单胞菌全细胞催化剂、4 mmoL（蔗糖与酰基供体的摩尔比为1:10）甲基丙烯酸乙烯酯和2 ml叔戊醇/二甲基亚砜（体积比为4:1）双溶剂介质放入具塞三角瓶中，置于40 ℃、250 rpm的气浴恒温振荡器内振荡，反应48 h后，其反应转化率为55.8%。如附图所示，图一中2.8min出现的是蔗糖峰，图二相比较图一而言，在4.3min处出现一个新的峰，为蔗糖酯峰。

实施例11

将实施例9所得产品利用薄层色谱对产物进行分析和分离，以不加催化剂的反应体系做空白对照对比，用氯仿:甲醇:水为4:1:1（体积比）作为展开剂，洗脱之后的硅胶板喷洒10%（质量比）的硫酸乙醇溶液，然后在105 ℃烘箱中烘烤5 min显色，阿拉伯糖酯的R_?=0.77，而阿拉伯糖的R_?=0.13，阿拉伯糖酯和阿拉伯糖能够完全分开。

实施例 12

将实施例9所得产品利用薄层色谱对产物进行分析和分离，以不加催化剂的反应体系做空白对照对比，用氯仿:甲醇:水为6:1:1（体积比）作为展开剂，洗脱之后的硅胶板喷洒10%（质量比）的硫酸乙醇溶液，然后在105 ℃烘箱中烘烤5 min显色，阿拉伯糖酯的R_?=0.46，而阿拉伯糖的R_?=0.11，阿拉伯糖酯和阿拉伯糖分离不完全。

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.全细胞催化制备蔗糖酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的全细胞催化制备蔗糖酯的合成过程中，其特征在于，上述的甲基丙烯酸乙烯酯还包括其他饱和、非饱和的、直链、支链、长链或短链的脂肪酸酯。

3.根据权利要求1所述的全细胞催化制备蔗糖酯的合成过程中，其特征在于，所述全细胞催化剂为假单胞菌类、霉菌类或者芽孢杆菌类。

4.根据权利要求1所述全细胞催化制备蔗糖酯的方法，其特征在于，所述诱导剂为无水葡萄糖、吐温80或大豆油。