CN105506037B - 一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末及其制造方法，属于生物化工领域。本发明通过改进抗坏血酸葡萄糖苷的转化浓度，利用多级膜分离技术去除转化体系中的杂质和色素，并对抗坏血酸葡萄糖苷和抗坏血酸进行分离，进一步浓缩、回收利用抗坏血酸；通过酸性环境下过滤母液，提高产品透光度，并利用真空微波干燥技术解决了抗坏血酸葡萄糖苷在干燥环节中易被氧化而引起褐变的问题。

Description

一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末及其制造方法
技术领域
本发明涉及生物化学生产领域，具体地说涉及一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末及其制造方法。
背景技术
抗坏血酸葡萄糖苷，又称为抗坏血酸葡糖苷、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷、L-抗坏血酸-2-葡糖甙，以下简称AA-2G。抗坏血酸葡萄糖苷是迄今人们发现的最稳定、性能最佳的L-抗坏血酸替代品，在生物体内酶的作用下，很容易分解为D-葡萄糖和VC，具有极高的安全性，主要作为一种美白添加剂应用于多种高端品牌化妆品中，也可作为稳定剂、品质改良剂、生理活性剂、紫外线吸收剂等用于食品饮料工业中，还可作为化学和医药原料用于医药工业和保健品领域中。
抗坏血酸葡萄糖苷的工业化生产主要包括制备、纯化、结晶三大工艺。目前生物转化法是抗坏血酸葡萄糖苷合成的唯一途径，即利用糖基转移酶的特异性转糖基作用，将葡萄糖基供体上的葡萄糖苷转移到VC的2-位C上。反应过程中，VC的2-位C上可能会连接上长短不一的葡萄糖基，产生混合物AA-2Gn(n＝1，2，3，4，5，6)，这些寡聚糖基VC衍生物可以通过添加糖化酶减少聚合度，进而转变成AA-2G。另外，在糖基转移反应中，易形成AA-5G、AA-6G等AA-2G的结构异构体；且VC和葡萄糖基供体在反应后会有所剩余，因此糖基转移反应结束后，需对反应液进行分离纯化，最后通过结晶的方法，得到高纯度的抗坏血酸葡萄糖苷产品。
现已有相关企业所生产的抗坏血酸葡萄糖苷产品不仅纯度高达99％以上，且产量相当可观，我国对于抗坏血酸葡萄糖苷的工业化生产已初见端倪，但仍存在转化率不高，尤其是底物原料VC的利用率不高、生产成本消耗严重、产物提取收率偏低、排放废水过量、环境污染严重等诸多问题。而抗坏血酸葡萄糖苷本身也存在透光率方面的瑕疵，其浓度大于20w/v％后，水溶液易呈黄色，影响了该产品的商业价值。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种收率高、降低成本的抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制备方法，本发明还有一个目的是提供前述方法生产获得的高纯度、高结晶度、高透光率的抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法依次包括如下步骤：
转化：用过量的L-抗坏血酸或L-抗坏血酸及其盐与β-环糊精作为底物，加入环糊精葡萄糖基转移酶反应；再加入糖化酶水解未转化完全的短链多糖和剩余的β-环糊精；最后加入酵母进行厌氧发酵去除多糖，获得转化液；
纯化：将转化液通过微滤、一级纳滤、阳离子树脂、二级纳滤获得二级纳滤浓液。
结晶：将二级纳滤浓液在真空、低温环境下连续浓缩结晶，离心，获得抗坏血酸葡萄糖苷晶体；
干燥：微波干燥抗坏血酸葡萄糖苷晶体，粉碎后获得抗坏血酸葡萄糖苷粉末。
本发明所使用的环糊精葡萄糖基转移酶可以是经自然界分离后培育的产酶菌种获得，也可以是通过基因工程手段构建的重组菌获得，还可以通过市场购买获得，目前市场销售的环糊精葡萄糖基转移酶已满足本发明生产抗坏血酸葡萄糖苷的要求。本发明所使用的环糊精葡萄糖基转移酶购于安琪酵母公司，酶活规格：90U/mL，产品批号：H201410211。
本发明所使用的糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶，学名为α-1，4-葡萄糖水解酶(α-1，4-glucan glucohydrolace)，购于山东隆科特酶制剂有限公司，产品批号：GA914001306。糖化酶用于配合环糊精葡萄糖基转移酶，水解未转化完全的短链糊精，从而提高产率。
这里需要说明的是，本文对L-抗坏血酸、L-抗坏血酸及其盐统称为“VC”。本发明优选的底物是L-抗坏血酸；底物同样可以采用L-抗坏血酸的钠盐形式，但为了保证反应的酸性环境，以L-抗坏血酸钠作为底物时必须要同时加入L-抗坏血酸。
本发明所述的制造方法具体来说，包括：所述转化步骤中，投放L-抗坏血酸或L-抗坏血酸及其盐、β-环糊精后，调节pH至4.5～5.5，在适宜温度下通入氮气搅拌反应，直到抗坏血酸葡萄糖苷浓度为120g/L～140g/L时停止转化；然后在适宜温度下加入糖化酶并搅拌；然后在适宜温度下调节pH至5.0～6.0，加入酵母后，通入空气搅拌活化，再停止通入空气继续搅拌；然后加热灭菌灭酶，放罐获得转化液。
本发明的底物中，L-抗坏血酸或L-抗坏血酸及其盐与β-环糊精的投放质量比为10∶12～16。其中一种实施方式是按照L-抗坏血酸与β-环糊精按照质量比9∶14进行投料；另一种实施方式是将L-抗坏血酸、L-抗坏血酸钠和β-环糊精按照质量比2.5∶15∶28进行投料。
其中，所述转化步骤中，L-抗坏血酸或L-抗坏血酸及其盐和β-环糊精的搅拌温度为 35℃～45℃，通入氮气的纯度≥99％，连续搅拌20～26小时。加入糖化酶时搅拌温度上升到42～50℃，连续搅拌3～4小时。加入酵母时的温度控制在30～40℃，停止通入空气连续搅拌时间为8～15小时；然后加热至60℃灭菌灭酶。
作为本发明的进一步优化，投入L-抗坏血酸和β-环糊精后，还投入底物质量2％～10％的抗氧化剂，所述抗氧化剂包括但不限于NaHSO3、Na2SO3、Na2S2O5中任意一种或多种的组合。
本发明通过加入酵母进行厌氧发酵，以去除残留还原糖。具体的操作是：向反应体系中按10g/L加入干酵母140kg，通入空气以好氧形式继续搅拌以活化酵母。30分钟后关闭空气，30～35℃，pH 5.0～6.0，继续搅拌8～15h或过夜。必要时可检测还原糖含量，待含量不再下降时即可放罐。经过糖化酶酶解后的还原糖含量约为120～150g/L，经酵母消耗后，其中的还原糖含量可以下降至10g/L左右，实际上此时的还原糖含量已经降至1g/L以下，因为VC在检测葡萄糖的过程中会变色导致还原糖的含量在10g/L左右。经过酵母厌氧发酵后，大大减轻后处理的负担。
本发明的核心在于纯化步骤，利用多级膜分离技术去除转化体系中的大分子杂蛋白、小分子多肽、盐类和因VC氧化破坏所产生的色素等，更值得注意的是，通过对膜体系的改善，能将未完全利用的VC进行回收和重利用，并可明显减少分离过程中产生的废水排放。发明人发现葡萄糖基受体VC转化率不高是消耗生产原料成本的主要因素，VC在反应过程中需要过量才能得到高产率的抗坏血酸葡萄糖苷。因此本发明的膜体系除了要实现基本的纯化要求外，还要控制每个滤除步骤中抗坏血酸葡萄糖苷和VC的回收率，并实现VC的再生产，为此：
所述纯化步骤中，依次通过微滤、一级纳滤去除杂质、阳离子树脂，并通过二级纳滤截留抗坏血酸葡萄糖苷获得纳滤浓液。
作为本发明的进一步优化，微滤后，向微滤清液中加入酸调节pH至3.0～3.5，静置后滤除不溶物，再经一级纳滤处理，用于后续的阳离子树脂处理、浓缩和结晶步骤；所述酸包括磷酸、硫酸、盐酸、草酸、柠檬酸的任意一种。在膜分离过程中加酸，目的是有效去除转化过程中产生的副产物，以提高产品的透光度。调酸后所产生的不溶物是转化过程中产生的副产物，若不能及时去除副产物，将最终影响产品的透光度，进而影响成品的品质。
透过二级纳滤的溶液进一步通过反渗透获得至少2.5倍浓度的L-抗坏血酸浓液，并用于后续生产中转化步骤的原料。所述L-抗坏血酸浓液包括L-抗坏血酸或其钠盐。
所述纯化步骤中，抗坏血酸葡萄糖苷经微滤后回收率为97.0％～99.9％，通过一级纳滤后回收率为95.5％～99.0％，通过二级纳滤后回收率为95.5％～99.0％；L-抗坏血酸依次经过微滤、一级纳滤、二级纳滤、反渗透的总回收率不少于75.0％。
所述微滤采用的滤膜孔径大小为20～200nm，可截留相对分子质量范围为20万～100万道尔顿的物质，膜材质包括但不限于陶瓷、聚丙烯、聚砜、聚偏二氟乙烯、醋酸纤维素薄膜的任意一种。微滤主要用于去除细菌、杂蛋白、颗粒、黏土等杂质。
所述一级纳滤采用的滤膜可截留相对分子质量范围为200～800道尔顿的物质，所述二级纳滤采用的滤膜可截留相对分子质量范围为150～200道尔顿的物质，纳滤的膜材质为聚酰胺、醋酸纤维素的任意一种。一级纳滤是用于去除分子量较大的多肽、蛋白、色素等杂质，主要在此步骤去除部分色素和无机盐。而二级纳滤则将抗坏血酸葡萄糖苷和VC进行分离。
最后通过反渗透将VC浓缩再利用。所述反渗透采用的滤膜孔径大小为1～2nm，可截留相对分子质量小于200道尔顿的物质，反渗透膜材质为聚酰胺、醋酸纤维素的任意一种。
微滤膜的组件类型包括但不限于管式、中空纤维、卷式中的任意一种；纳滤和反渗透膜的组件类型包括但不限于管式、中空纤维、卷式、板框式中的任意一种。微滤膜的操作压力小于0.2MPa，纳滤膜操作压力为0.5～3.5MPa，反渗透膜操作压力为1.5～15MPa；操作时膜温度一般在20℃～50℃之间。
作为本发明的进一步优化，所述母液经精密过滤器过滤，目的是有效去除转化过程中产生的副产物，以提高产品的透光度：在浓缩结晶过程中采用连续浓缩结晶方式，不仅提高了产品的品质，同时提高了产品的收率，提高了工作效率。特别在结晶过程中，母液回收浓缩操作时，母液经过精密过滤器过滤，使得浑浊的杂质不断被分离，保证了浓缩料液的澄清度；与传统的先浓缩后降温结晶方式相比，连续浓缩结晶过程中杂质不断被分离，提高了料液的纯度。精密过滤器的滤芯可以选用包括但不限于聚四氟乙烯膜(PTFE)滤芯、聚硐膜(HE)滤芯、聚丙烯膜(PP)滤芯、醋酸纤维膜(CN-CA)滤芯中的任意一种，优选聚四氟乙烯膜滤芯，过滤精度0.02～50μm。
本发明微波干燥是将微波功率逐步增加到7～8kW，于40℃干燥10～30min。作为本发明的优选方案，是在真空度-0.099～-0.096Mpa的环境中进行。真空微波干燥解决了抗坏血酸葡萄糖苷在后分离过程中尤其是干燥时易被氧化而引起的产品色泽褐变。微波穿透的机理使热传递在抗坏血酸葡萄糖苷物料中分布更均匀，提高了产品干燥后的水分 均一性。真空微波干燥抗坏血酸葡萄糖苷结合微波加热和真空干燥两项技术特点，在真空条件下利用微波能进行物料抗坏血酸葡萄糖苷的干燥，真空环境保证了物料抗坏血酸葡萄糖苷的干燥可以在低温下进行，避免抗坏血酸葡萄糖苷经高温氧化破坏或分解后引起的产品外观褐变；同时，还可以减少因受传统干燥的鼓热风、翻料等外力作用而造成的产品损耗。
对上述方法制造生产获得的抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末为白色粉末晶体，粉末颗粒经30目～50目(颗粒粒径大小：270μm～550μm)过筛比例约占87％。该结晶粉末其抗坏血酸葡萄糖苷纯度超过99.5％，抗坏血酸葡萄糖苷结晶度超过96.5％。25℃室温下，浓度为20w/v％的抗坏血酸葡萄糖苷溶液透光率≥98％。pH 2.3～2.4，干燥失重≤1.0％，灼烧残渣≤0.2％，砷≤2ppm，重金属≤20ppm，比旋+186.0～+188.0，熔点158～163℃，游离维生素C≤0.1％，游离葡萄糖≤0.1％，含量≥98％。
本发明的有益效果如下：
1.由于本发明在抗坏血酸葡萄糖苷的转化工艺中采用提高底物β-环糊精和VC的投料浓度，并利用过量的VC投入，使得转化后的抗坏血酸葡萄糖苷生成浓度更高；
2.本发明利用多级膜分离技术，有效去除了转化体系中的大分子杂蛋白、小分子多肽、盐类和因VC氧化破坏所产生的色素等，经过微滤、两级纳滤、反渗透四次膜处理后保证VC的总回收率达75％以上；更值得注意的是：对未完全利用的VC进行回收，从而使VC的利用率提高到95％以上，直接提高了抗坏血酸葡萄糖苷在膜分离的总收率；并且VC回收液直接用于转化，可明显减少废水排放；膜分离过程中加酸可明显改善产品溶液的透光率；
3.本发明分别采取在膜分离过程加酸和母液经聚四氟折叠滤芯过滤两项措施去除分离过程中较难去除的杂质，大大提高了产品溶于水后的透光度，尤其是在室温下，浓度为20w/v％的抗坏血酸葡萄糖苷溶液的透光率仍可以达到98％以上，确保了产品的优良品质；
4.干燥工艺采用真空微波干燥技术，减少受传统干燥的鼓热风、翻料等外力作用而造成的产品损耗，避免抗坏血酸葡萄糖苷经高温氧化破坏或分解后引起的产品外观褐变，提高产品干燥后的水分均一性。
说明书附图
图1为抗坏血酸葡萄糖苷对照品的HPLC图谱；
图2为L-抗坏血酸对照品的HPLC图谱；
图3为本发明实施例2中加入糖化酶前的转化液HPLC图谱；
图4为本发明实施例2中加糖化酶酶解2.5小时后的转化液HPLC图谱；
图5为本发明实施例2中酵母除糖后的转化液HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，包括如下步骤：
一、转化
投料：投放过量的L-抗坏血酸或L-抗坏血酸及其盐、β-环糊精，L-抗坏血酸或L-抗坏血酸及其盐与β-环糊精的投放质量比为10∶12～16。然后投入底物质量2％～10％的抗氧化剂(NaHSO3、Na2SO3、Na2S2O5任意一种)，调节pH至4.5～5.5，在35℃～45℃下通入纯度≥99％的氮气，加入环糊精葡萄糖基转移酶，搅拌反应20～26小时，直到抗坏血酸葡萄糖苷浓度为120g/L～140g/L时停止转化。
水解：然后将温度上升到42～50℃，加入糖化酶并搅拌3～4小时。
去除残留还原糖：然后在30～40℃温度下调节pH至5.0～6.0，加入酵母后，通入空气搅拌活化，再停止通入空气继续搅拌8～15小时。
加热灭菌灭酶；加热至60℃保温半小时。放罐获得转化液。
二、纯化
纯化步骤中，依次通过微滤、加酸调节pH至3.0～3.5并静置滤除不溶物，然后通过一级纳滤去除杂质、阳离子树脂除盐，并通过二级纳滤截留抗坏血酸葡萄糖苷获得纳滤浓液。透过二级纳滤的溶液进一步通过反渗透得至少2.5倍浓度的L-抗坏血酸浓液，并用于后续生产中转化步骤的原料。加酸调节所用到的酸包括磷酸、硫酸、盐酸、草酸、柠檬酸的任意一种。
抗坏血酸葡萄糖苷经微滤后回收率为97.0％～99.9％，通过一级纳滤后回收率为95.5％～99.0％，通过二级纳滤后回收率为95.5％～99.0％；L-抗坏血酸依次经过微滤、一级纳滤、二级纳滤、反渗透的总回收率不少于75.0％。
微滤：采用的滤膜孔径大小为20～200nm，可截留相对分子质量范围为20万～100万道尔顿的物质，膜材质为陶瓷、聚丙烯、聚砜、聚偏二氟乙烯、醋酸纤维素薄膜的任意一种；
纳滤：采用的滤膜可截留相对分子质量范围为200～800道尔顿的物质，二级纳滤采用的滤膜可截留相对分子质量范围为150～200道尔顿的物质，纳滤的膜材质为聚酰胺、醋酸纤维素的任意一种；
反渗透：采用的滤膜孔径大小为1～2nm，可截留相对分子质量小于200道尔顿的物质，反渗透膜材质为聚酰胺、醋酸纤维素的任意一种。
三、结晶
将二级纳滤浓液在真空、低温环境下连续浓缩结晶，获得抗坏血酸葡萄糖苷晶体。连续浓缩结晶过程中，母液回收时优选通过聚四氟乙烯膜折叠滤芯进行进一步浓缩。
四、干燥
微波干燥抗坏血酸葡萄糖苷晶体，功率逐步增加到7～8kW，于40℃干燥10～30min，并在真空度-0.099～-0.096Mpa的环境中进行。粉碎后获得抗坏血酸葡萄糖苷粉末。
上述方法制造生产获得的抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末为白色粉末晶体，粉末颗粒经30目～50目(颗粒粒径大小：270μm～550μm)过筛比例约占87％。该结晶粉末其抗坏血酸葡萄糖苷纯度超过99.5％，抗坏血酸葡萄糖苷结晶度超过96.5％。25℃室温下，浓度为40w/v％的抗坏血酸葡萄糖苷溶液透光率≥98％。pH 2.3～2.4，干燥失重≤1.0％，灼烧残渣≤0.2％，砷≤2ppm，重金属≤20ppm，比旋+186.0～+188.0，熔点158～163℃，游离维生素C≤0.1％，游离葡萄糖≤0.1％，含量≥98％。
本发明所使用的环糊精葡萄糖基转移酶购于安琪酵母公司，酶活规格：90U/mL，品批号：H201410211。
本发明所使用的糖化酶(葡萄糖淀粉酶)购于山东隆科特酶制剂有限公司，酶活规格：200000U/mL，产品批号：GA914001306。
本发明所选用的底物β-环糊精购于曲阜市天利药用辅料有限公司，批号141009；L-抗坏血酸购于江苏江山制药有限公司，产品批号：B201411103；L-抗坏血酸钠购于江苏江山制药有限公司，产品批号：N201405811。
实施例2
一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其步骤与实施例1基本相同，但转化步骤具体如下：
1.投料
1)先后开启空压机、制氮机及其进出口阀门。确保N2纯度≥99.95％，制氮机出气口N2流量控制在1.2～1.4N·m3/h。将氮气管导入转化罐内。
2)向转化罐中注水10M3。开启搅拌，将水升温至40℃。
3)投入1800kg VC。用水冲洗粘在罐壁上的VC残料。用30～40w/v％NaOH将pH调至4.8左右；若以VCNa为底物，可按等摩尔投入，投料时还需用少量的L-抗坏血酸与L-抗坏血酸钠混合(质量比约为1∶6)，使转化体系的pH在4.8左右。
4)投入β-环糊精2800kg。
5)加入36kg的NaHSO3，以减少VC在转化过程中的损失。
6)用稀NaOH溶液将反应物的pH调至4.8左右，保持温度在38～42℃。
7)用输料泵向转化罐中打入环糊精葡萄糖基转移酶浓缩液约1500L～2000L。加入少量水冲洗粘在反应器上的物料及酶液，使反应体系在13～14t。
8)避光，通入N2低压保护VC，搅拌，38～42℃，转化开始。
9)每三小时取样监测。
10)转化22～24h，抗坏血酸葡萄糖苷浓度为130g/L左右，当抗坏血酸葡萄糖苷浓度不增加时，转化结束。
2.水解
保持pH 4.5～6.5，42～50℃，按照1～1.2mL/L的投入量加入糖化酶(葡萄糖淀粉酶)5～17L，酶水解短链多糖及剩余的β-环糊精，继续搅拌3～4h。注：一般情况下，糖化酶水解后抗坏血酸葡萄糖苷浓度可升至150～175g/L。
3.去除残留还原糖
将温度降至35℃，用稀NaOH溶液调节pH至5.5左右。按10g/L加入安琪高活性干酵母140kg，通入空气以好氧形式继续搅拌，以活化酵母。30min后关闭空气，30～35℃，pH 5.0～6.0，继续搅拌8～15h或过夜。必要时可检测还原糖含量，待含量不再下降时即可放罐。经过糖化酶酶解后的还原糖含量约为120～150g/L，经酵母消耗后，其中的还原糖含量可以下降至1g/L左右，大大减轻后处理的负担。
4.加热灭菌灭酶
放罐前，加热至60℃并保温半小时，然后放罐获得转化液。
从图1～图5的比较可以看出，加入糖化酶后，可有效分解抗坏血酸葡萄糖苷的其他衍生物，进而提高了目标产物抗坏血酸葡萄糖苷的含量，然后加入酵母降解体系中的还原糖，即保证了反应体系中抗坏血酸葡萄糖苷和L-抗坏血酸的产量又可减少后分离的负担。
实施例3 7m3转化液的纯化工艺
一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其步骤与实施例1基本相同，但纯化步骤具体如下：
7m3转化体系用于转化的底物投量为：β-环糊精1400kg，VC900kg。转化后得抗坏血酸葡萄糖苷165.2g/L，剩余VC 34.8g/L，根据抗坏血酸葡萄糖苷的生成量计算VC在转化中的理论利用总量为601kg，因此，VC的理论利用率为67％。实际剩余VC总量为243.6kg。
1.微滤系统
微滤膜型号：PL-M-132，厂家：安徽普朗膜技术有限公司。
微滤系统用于除去菌体、杂蛋白等杂质，微滤过程加水约12m3，截留液体积约3m3，得透过清液15m3，抗坏血酸葡萄糖苷的浓度为74.8g/L，VC的浓度为15.6g/L。故微滤过程得抗坏血酸葡萄糖苷的回收率为97.14％；VC的回收率为95.51％。向微滤清液中加入盐酸调节pH至3.2，静置2h后滤除不溶物。
2.一级纳滤系统
一级纳滤膜型号：PL-N-450，厂家：安徽普朗膜技术有限公司。
将除杂后的微滤清液经纳滤系统去除分子量较大的蛋白、多肽、色素等杂质，在此过程中除去部分色素和无机盐。一级纳滤前物料总体积15m3，抗坏血酸葡萄糖苷浓度为74.8g/L，VC的浓度为15.6g/L。一级纳滤过程加水3m3，截留1.0m3，清液的总体积为17m3，抗坏血酸葡萄糖苷的浓度为63.1g/L，VC的浓度为12.89g/L。故一级纳滤过程抗坏血酸葡萄糖苷的回收率为95.62％；VC的回收率为93.7％。
3.二级纳滤系统
二级纳滤膜型号：PL-N-600，厂家：安徽普朗膜技术有限公司。
一级纳滤清液经阳离子树脂除盐后再经二级纳滤系统对抗坏血酸葡萄糖苷和VC进行分离，并借此过程进一步浓缩和澄清物料，除去部分色素和无机盐。二级纳滤前物料总体积17m3，抗坏血酸葡萄糖苷的浓度为63.1g/L，VC的浓度为12.89g/L。二级纳滤过程加水3m3截留7m3，透过清液的总体积为13m3，故截留抗坏血酸葡萄糖苷的浓度为146.39g/L，透过VC的浓度为15.87g/L。故二级纳滤过程抗坏血酸葡萄糖苷的回收率为95.53％；VC的回收率为94.2％。
4.反渗透系统
膜型号：PL-R-450，厂家：安徽普朗膜技术有限公司。
最后利用反渗透系统将VC浓缩再利用，VC清液总体积为13m3，反渗透后，浓液的总体积为5.5m3，VC平均的浓度为34.64g/L，清液的总体积7.5m3，VC的浓度为0.55g/L，故VC的回收率为92.3％。
膜处理过程可实现抗坏血酸葡萄糖苷总收率达到88.4％。在转化中残留的243.6kg VC经膜处理后回收总量为190.3kg，VC在膜处理过程中的总收率可达75.1％；反渗透回收的VC清液将会作为后续转化的起始原料，连续生产时VC的实际利用率高达95％，既提高了VC的利用率，又避免了污水的排放。
实施例4 9m3转化液的纯化工艺
一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其步骤与实施例1基本相同，但纯化步骤具体如下：
9m3转化体系用于转化的底物投量为：β-环糊精1900kg，VC1175kg。转化后得抗坏血酸葡萄糖苷165.2g/L，剩余VC 34.8g/L，根据抗坏血酸葡萄糖苷的生成量计算VC在转化中的理论利用总量为773.6kg，因此，VC的理论利用率为65.8％。实际剩余VC总量为313.2kg。
1.微滤系统
微滤膜型号：PL-M-132，厂家：安徽普朗膜技术有限公司。
先经过微滤系统除去菌体、杂蛋白等杂质，微滤过程加水约12m3，截留液体积约3m3，得透过清液19m3，抗坏血酸葡萄糖苷的浓度为76.2g/L，VC的浓度为15.88g/L。故微滤过程得抗坏血酸葡萄糖苷的回收率为97.5％；VC的回收率为95.8％。向微滤清液中加入硫酸调节pH至3.0，静置2h后滤除不溶物。
2.一级纳滤系统
膜型号：PL-N-450，厂家：安徽普朗膜技术有限公司。
将除杂后的微滤清液经纳滤系统去除分子量较大的蛋白、多肽、色素等杂质，在此过程中除去部分色素和无机盐。一级纳滤前物料总体积19m3，抗坏血酸葡萄糖苷浓度为76.2g/L，VC的浓度为15.88g/L。一级纳滤过程加水3m3，截留1m3，清液的总体积为21m3，抗坏血酸葡萄糖苷的浓度为65.77g/L，VC的浓度为14.37g/L。故一级纳滤过程抗坏血酸葡萄糖苷的回收率为95.4％；VC的回收率为93.83％。
3.二级纳滤系统
膜型号：PL-N-600，厂家：安徽普朗膜技术有限公司。
一级纳滤清液经阳离子树脂除盐后再经二级纳滤对抗坏血酸葡萄糖苷和VC进行分离，并借此过程进一步浓缩和澄清物料，除去部分色素和无机盐。二级纳滤前物料总体积21m3，抗坏血酸葡萄糖苷的浓度为65.77g/L，VC的浓度为14.37g/L。二级纳滤过程加水3m3，截留8.5m3，透过清液的总体积为15.5m3，故截留抗坏血酸葡萄糖苷的浓度为155.1g/L，透过VC的浓度为18.22g/L。故二级纳滤过程抗坏血酸葡萄糖苷的回收率为95.45％；VC的回收率为93.6％。
4.反渗透系统
膜型号：PL-R-450，厂家：安徽普朗膜技术有限公司。
最后利用反渗透系统将VC浓缩再利用，VC清液总体积为15.5m3，反渗透后，浓液的总体积为6m3，VC平均的浓度为41.44g/L，清液的总体积9.5m3，VC的浓度为0.61g/L，故VC的回收率为88.3％。
膜处理过程可实现抗坏血酸葡萄糖苷总收率达到92.9％。更有优势的是，在转化中残留的313.2kgVC经膜处理后回收总量为：248.6kg，VC在膜处理过程中的总收率可达79.4％；反渗透回收的VC清液将会作为后续转化的起始原料，连续生产时VC的实际利用率高达95％，既提高了VC的利用率，又避免了污水的排放。
实施例5纳滤浓液的结晶和干燥1
一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其步骤与实施例1基本相同，但结晶和干燥的步骤具体如下：
二级纳滤浓缩液中的抗坏血酸葡萄糖苷浓度为21wt％，料液体积3m3，进行低温浓缩结晶操作，控制料液温度38℃～42℃，真空度≤-0.93Mpa。当物料中抗坏血酸葡萄糖苷浓度达到60wt％时，加入少量抗坏血酸葡萄糖苷的粉末晶体作为晶种。继续浓缩至大量晶体析出时，开启离心机，收集抗坏血酸葡萄糖苷晶体。然后利用精密过滤器对母液进行过滤，用物料泵将滤液输送至连续浓缩结晶罐中继续浓缩结晶。精密过滤器所采用滤芯为四氟乙烯膜折叠滤芯。
离心时，用冰水喷雾淋洗物料，离心机出口开始出现透明液体，并直至无液体流出时结束离心。经过离心，一次收集的晶体湿重为536kg。
利用真空微波干燥设备对离心后的晶体物料进行干燥，干燥物料厚度6±0.3cm，干燥温度40℃，微波功率逐渐增加至7～8kW，真空度-0.099～-0.096Mpa，干燥时长 15～20min。烘干后经粉粹得成品472.5kg，产品全检合格。
检测指标结果为：性状为白色粉末晶体，粉末颗粒经30目～50目(颗粒粒径大小：270μm～550μm)过筛比例约占87％，晶体X射线衍射分析法测得抗坏血酸葡萄糖苷结晶度≥96.5％，pH 2.33，干燥失重0.11％，灼烧残渣0.14％，砷≤2ppm，重金属≤20ppm，比旋+186.5°，熔点158.5～161.4℃，游离VC＜0.1wt％，游离葡萄糖＜0.1wt％，含量99.74wt％。
实施例6纳滤浓液的结晶和干燥2
一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其步骤与实施例1基本相同，但结晶和干燥的步骤具体如下：
二级纳滤浓缩液中的抗坏血酸葡萄糖苷浓度为20wt％，料液体积5.8m3，进行低温浓缩结晶操作，控制料液温度38～42℃，真空度≤-0.93Mpa。当物料中抗坏血酸葡萄糖苷浓度达到58wt％时，加入少量抗坏血酸葡萄糖苷的粉末晶体作为晶种。继续浓缩至大量晶体析出时，开启离心机，收集抗坏血酸葡萄糖苷晶体。精密过滤器对母液进行过滤后，用物料泵将滤液输送至连续浓缩结晶罐中继续浓缩结晶。精密过滤器所采用滤芯为聚丙烯膜滤芯。
离心时，用冰水喷雾淋洗物料，离心机出口开始出现透明液体，并直至无液体流出时结束离心。经过离心，一次收集的晶体湿重为955kg。
利用真空微波干燥设备对离心后的晶体物料进行干燥，干燥物料厚度6±0.3cm，干燥温度40℃，微波功率逐渐增加至7～8kW，真空度-0.099～-0.096Mpa，干燥时长15～20min。烘干后经粉粹得成品811kg，产品全检合格。
检测指标结果分别为：性状为白色粉末晶体，粉末颗粒经30目～50目(颗粒粒径大小：270μm～550μm)过筛比例约占87％，晶体X射线衍射分析法测得抗坏血酸葡萄糖苷结晶度≥95.4％，pH 2.37，干燥失重0.13％，灼烧残渣0.12％，砷≤2ppm，重金属≤20ppm，比旋+186.7°，熔点158.4～161.1℃，游离VC＜0.1wt％，游离葡萄糖＜0.1wt％，含量99.27wt％。
实施例7纳滤浓液的结晶和干燥3
一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其步骤与实施例1基本相同，但结晶和干燥的步骤具体如下：
二级纳滤浓缩液中的抗坏血酸葡萄糖苷浓度为23wt％，料液体积5.2m3，进行低温浓缩结晶操作，控制料液温度38～42℃，真空度≤-0.93Mpa。当物料中抗坏血酸葡萄糖苷浓度达到62wt％时，加入少量抗坏血酸葡萄糖苷的粉末晶体作为晶种。精密过滤器所采用滤芯为醋酸纤维膜滤芯滤芯。
继续浓缩至大量晶体析出时，开启离心机，收集抗坏血酸葡萄糖苷晶体。精密过滤器对母液进行过滤后，用物料泵将滤液输送至连续浓缩结晶罐中继续浓缩结晶。
离心时，用冰水喷雾淋洗物料，离心机出口开始出现透明液体，并直至无液体流出时结束离心。经过离心，一次收集的晶体湿重为1010kg。
利用真空微波干燥设备对离心后的晶体物料进行干燥，干燥物料厚度6±0.3cm，干燥温度40℃，微波功率逐渐增加至7～8kW，真空度-0.099～-0.096Mpa，干燥时长15～20min。烘干后经粉粹得成品858.5kg，产品全检合格。
检测指标结果分别为：性状为白色粉末晶体，粉末颗粒经30目～50目(颗粒粒径大小：270μm～550μm)过筛比例约占82％，晶体X射线衍射分析法测得抗坏血酸葡萄糖苷结晶度≥97％，pH 2.30，干燥失重0.09％，灼烧残渣0.16％，砷≤2ppm，重金属≤20ppm，比旋+187.1°，熔点159.2～162.1℃，游离VC≤0.1wt％，游离葡萄糖＜0.1wt％，含量99.31wt％。
试验例1成品透光率比较
在25℃室温环境下，将实施例5～7的三个成品稀释成不同浓度溶液，利用分光光度计于430nm波长下，测量其透光率，结果如下：
表1 25℃下抗坏血酸葡萄糖苷成品的透光率
从表1可以看出，本实施例5～7的生产方法所获得的抗坏血酸葡萄糖苷浓度达到20w/v％时仍然保证透光率大于98％，其溶液透明清亮，肉眼难以看出溶液颜色，显著高于现有产品的质量。
试验例2膜处理对抗坏血酸葡萄糖苷收率的影响
本试验基于实施例1转化步骤获得的转化液500L，先经过微滤系统除去菌体、杂蛋白等大分子杂质，再将微滤清液经一级纳滤系统去除分子量较大的蛋白、多肽、色素等杂质，此过程中除去部分色素和无机盐，再将一级纳滤的清液经二级纳滤系统实现抗坏血酸葡萄糖苷和VC的分离，进一步澄清物料，除去部分色素和无机盐；最后利用反渗透系统将VC浓缩达到回收再利用，以提高VC的利用率。
微滤后的清液能否进一步有效去除微滤清液中的其他杂质，能否有效分离抗坏血酸葡萄糖苷与VC，对纳滤组件中的膜孔径大小的选择极为关键。本试验中所有的滤膜均购于安徽普朗膜技术有限公司，A组微滤膜型号为PL-G-1000，一级纳滤膜型号为4040M7-29/PL-D3-4，二级纳滤膜型号为4040M7-5/PL-D3-4，反渗透膜型号为4040/RO/PL-D3-4；B组微滤膜型号为PL-G-1000，一级纳滤膜型号为4040M7-29/PL-D3-4，二级纳滤膜型号为4040M90/PL-D3-4，反渗透膜型号为4040/RO/PL-D3-4；C组微滤膜型号为PL-G-1000，一级纳滤膜型号为4040M7-5/PL-D3-4，二级纳滤膜型号为4040M90/PL-D3-4，反渗透膜型号为4040/RO/PL-D3-4。上述滤膜的参数如表2所示。
表2 滤膜型号及其参数和用途
A、B、C三组进膜溶液总体积500L，经测量含有抗坏血酸葡萄糖苷151.4g/L，VC26.7g/L，电导率15000μS/cm2。进膜温度为25℃～45℃，微滤的进膜压力为3.2bar，过程加水800L，出膜压力3.2bar；纳滤的进膜压力为25bar，一级纳滤和二级纳滤中各加水200L，出膜压力为25bar，通过测量和计算各个过滤步骤中抗坏血酸葡萄糖苷(表格中为“AA-2G”)和VC浓度，计算两者的收率。统计结果如表3所示：
表3 三组试验的抗坏血酸葡萄糖苷和VC收率计算统计
从上述试验结果可以看出，膜处理过程可实现AA-2G总收率达到85％～95％；实现VC总收率70％～80％。纳滤膜的选择对抗坏血酸葡萄糖苷收率的提高显得尤为重要，且同时影响到VC收率和回收率。试验表明，一级纳滤膜选用4040M7-5/PL-D3-4，二级纳滤膜选用4040M90/PL-D3-4所获得的收率更高。
试验例3真空微波干燥对抗坏血酸葡糖糖苷性能影响
利用实施例1获得的抗坏血酸葡萄糖苷晶体作为干燥物料，恒定物料总面积2.3m2，物料厚度6+0.3cm，设置微波干燥总时间：30min，输出功率依次由1KW提高至10KW，真空度：-0.099～-0.096Mpa。将干燥物料分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃五个梯度的温度下进行干燥，结果如下：
表4 25℃下干燥物料的测定
表5 30℃下干燥物料的测定
表6 35℃下干燥物料的测定
表7 40℃下干燥物料的测定
表8 45℃下干燥物料的测定
通过上述5张表格可看出，微波输出功率和温度对微波真空干燥抗坏血酸葡萄糖苷效果有较大影响。输出微波功率越大，干燥速度越快；设定温度越高，干燥速度也越快；但物料本身只吸收微量微波，当物料水分≤0.2％时，基本不消耗微波能量，所以干燥过程微波功率不宜过大。而微波过量或温度过高，不仅耗电，也会造成物料出现性状异常。因此，设定干燥物料面积2.3m2，干燥物料厚度6+0.3cm，干燥温度40℃，微波功率逐渐增加至7～8KW，真空度：-0.099～-0.096Mpa，干燥时长15～20min，即可达到产品水分≤0.2％的要求。

Claims (13)

1.一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其特征在于依次包括如下步骤：
转化：用过量的L-抗坏血酸或L-抗坏血酸及其盐与β-环糊精作为底物，加入环糊精葡萄糖基转移酶反应，直到抗坏血酸葡萄糖苷浓度为120g/L~140g/L时停止转化；再加入糖化酶水解未转化完全的短链多糖和剩余的β-环糊精；最后加入酵母进行厌氧发酵去除多糖，获得转化液；所述L-抗坏血酸或L-抗坏血酸及其盐与β-环糊精的投放质量比为10:12~16；
纯化：将转化液通过微滤、一级纳滤、阳离子树脂、二级纳滤获得二级纳滤浓液；
结晶：将二级纳滤浓液在真空、低温环境下连续浓缩结晶，离心，获得抗坏血酸葡萄糖苷晶体；
干燥：微波干燥抗坏血酸葡萄糖苷晶体，粉碎后获得抗坏血酸葡萄糖苷粉末。
2.根据权利要求1所述的一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其特征在于：所述转化步骤中，投放L-抗坏血酸或L-抗坏血酸及其盐、β-环糊精后，调节pH至4.5~5.5，加入在适宜温度下通入氮气搅拌反应；然后在适宜温度下加入糖化酶并搅拌；然后在适宜温度下调节pH至5.0~6.0，加入酵母后，通入空气搅拌活化，再停止通入空气继续搅拌；然后加热灭菌灭酶，放罐获得转化液。
3.根据权利要求2所述的一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其特征在于：所述转化步骤中，L-抗坏血酸或L-抗坏血酸及其盐和β-环糊精的搅拌温度为35℃~45℃，通入氮气的纯度≥99%，连续搅拌20~26小时；加入糖化酶时搅拌温度上升到42~50℃，连续搅拌3~4小时；加入酵母时的温度控制在30℃~40℃，停止通入空气连续搅拌时间为8~15小时；然后加热至60℃灭菌灭酶。
4.根据权利要求2或3所述的一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其特征在于：投入L-抗坏血酸和β-环糊精后，还投入底物质量2%~10%的抗氧化剂，所述抗氧化剂包括NaHSO3、Na2SO3、Na2S2O5中任意一种或多种的组合。
5.根据权利要求1至3中任意一项所述的一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其特征在于：所述纯化步骤中，依次通过微滤、一级纳滤去除杂质、阳离子树脂，并通过二级纳滤截留抗坏血酸葡萄糖苷获得纳滤浓液。
6.根据权利要求5所述的一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其特征在于：微滤后，向微滤清液中加入酸调节pH至3.0~3.5，静置后滤除不溶物，再经一级纳滤处理，所述酸包括磷酸、硫酸、盐酸、草酸、柠檬酸的任意一种。
7.根据权利要求6所述的一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其特征在于：所述纯化步骤中，透过二级纳滤的溶液进一步通过反渗透获得至少2.5倍浓度的L-抗坏血酸浓液，并用于后续生产中转化步骤的原料。
8.根据权利要求7所述的一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其特征在于：所述纯化步骤中，抗坏血酸葡萄糖苷经微滤后回收率为97.0%~99.9%，通过一级纳滤后回收率为95.5%~99.0%，通过二级纳滤后回收率为95.5%~99.0%；L-抗坏血酸依次经过微滤、一级纳滤、阳离子树脂、二级纳滤、反渗透的总回收率不少于75.0%。
9.根据权利要求8所述的一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其特征在于：所述微滤采用的滤膜孔径大小为20~200nm，可截留相对分子质量范围为20万~100万道尔顿的物质，膜材质为陶瓷、聚丙烯、聚砜、聚偏二氟乙烯、醋酸纤维素薄膜的任意一种；所述一级纳滤采用的滤膜可截留相对分子质量范围为200~800道尔顿的物质，所述二级纳滤采用的滤膜可截留相对分子质量范围为150~200道尔顿的物质，纳滤的膜材质为聚酰胺、醋酸纤维素的任意一种；所述反渗透采用的滤膜孔径大小为1~2nm，可截留相对分子质量小于200道尔顿的物质，反渗透膜材质为聚酰胺、醋酸纤维素的任意一种。
10.根据权利要求1所述的一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其特征在于：所述连续浓缩结晶过程中，母液回收时通过聚四氟乙烯膜折叠滤芯进行进一步浓缩。
11.根据权利要求1所述的一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末的制造方法，其特征在于：微波干燥的功率逐步增加到7~8kW，于40℃干燥10~30min，并在真空度-0.099~-0.096 Mpa的环境中进行。
12.如权利要求1所述的制造方法生产获得的抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末，其特征在于：抗坏血酸葡萄糖苷纯度超过99.5%，抗坏血酸葡萄糖苷结晶度超过96.5%。
13.根据权利要求12所述的结晶粉末，其特征在于：25℃室温下，浓度为20 w/v%的抗坏血酸葡萄糖苷溶液透光率≥98%。
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