CN104789620A - 一种葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺。本发明使用淀粉糖基及L-抗坏血酸或其盐为原料，在外加能量场的条件下制备葡萄糖苷抗坏血酸，能够显著缩短反应时间，提高葡萄糖苷抗坏血酸的转化率，通过微生物发酵法除去未反应的糖，使用该方法除糖既节能减排又经济高效，然后再通过离子交换色谱分离提取纯度大于95％的产物，通过浓缩及降温结晶制备出含量99.5％以上的葡萄糖苷抗坏血酸晶体。

Description

一种葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺

技术领域

本发明涉及一种葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺，更具体的，涉及以淀粉糖基及L-抗坏血酸或其盐为原料，在有外加能量场的条件下制备葡萄糖苷抗坏血酸，通过微生物发酵法除去未反应的糖，再通过阴阳离子交换色谱分离提取纯度＞95％的产物，通过浓缩结晶制备出葡萄糖苷抗坏血酸晶体。

背景技术

维生素c，学名L-抗坏血酸(ascorbic acid，AA)因其特有的化学结构和生理活性使其可以作为酸味剂、还原剂、抗氧化剂、漂白剂和稳定剂广泛应用于化妆品、食品和医药等领域。然而维生素c也存在着一系列固有弊端：其在水溶液中极不稳定；易被空气中的氧和其他氧化剂氧化；暴露于中性pH、热、光和重金属下会快速降解等，从而限制了它在某些领域中的应用。因此，开发高附加值的维生素c衍生物成为近年来国内外学者研究的热点。

葡萄糖苷抗坏血酸(ascorbyl glucoside，缩写AA-2G)是维生素c的一种衍生物，其分子式为C12H18O11，相对分子质量为338.27，熔点为158.5～159.5℃。该化合物于1990年由日本林原生物化学研究所与日本冈山大学药学系共同研究发现。AA-2G是维生素c和吡喃型葡萄糖苷通过糖基转移酶作用生成的缩合物，其中维生素c分子上2位C上的羟基被吡喃型葡萄糖苷所取代，后者以α-1，4-糖苷键连接。由于2位C上有葡萄糖基掩蔽，因此AA-2G具有显著的非还原活性。AA-2G的结构特征决定了它具有如下几个主要特点与功能：1)AA-2G具有非还原活性，不易发生氧化反应，在水溶液中特别稳定。2)AA-2G具有较好的耐光性和耐热性，其在100℃，30min的加热条件下也不分解。3)进入细胞的AA-2G，经α-葡萄糖苷酶水解生成维生素c和葡萄糖，且具有同原始维生素c一样的还原性和抗氧化性。并且由于AA-2G的持续分解，可为体内不断的提供维生素c，促进胶原蛋白的形成，具有防止皮肤衰老的功能。4)AA-2G是卫生署公布认可的6种美白添加剂之一。它可以直接排出表皮层中已经形成的黑色素，即将已形成的黑色素加速逆向还原至最初形态，美白效果比其他添加剂更加明显和快速，因此在多种高端美白化妆品中都有着广泛的应用。

目前，已知的AA-2G的合成方法是以淀粉及L-抗坏血酸为原料，利用糖基转移酶催化而成，反应温度为60-65℃，反应时间为30-48h，葡萄糖苷抗坏血酸的转化率为35-40％，上述AA-2G的合成方法，反应温度高、反应时间长，葡萄糖苷抗坏血酸的转化率偏低，而且后提取纯化工艺时间较长，效率较低。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺，能够有效缩短反应时间，降低反应温度，同时提高葡萄糖苷抗坏血酸的转化率。

本发明葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺，其步骤包括，使用淀粉糖基及L-抗坏血酸或其盐为原料，在外加能量场的条件下制备葡萄糖苷抗坏血酸，反应结束后，得的葡萄糖、糊精、葡萄糖苷抗坏血酸及L-抗坏血酸的混合物，之后通过添加一定量的微生物以去除反应溶液中的葡萄糖和糊精，再通过离子交换色谱去除L-抗坏血酸，分离提取纯度＞95％的产物，最后通过浓缩结晶即可制备出葡萄糖苷抗坏血酸晶体。

更具体的本发明葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺，其步骤包括，将淀粉类物质作为糖基原料加热溶解后，在还原态条件下加入L-抗坏血酸或L-抗坏血酸盐或两者的混合物，调节反应溶液的PH为5-5.5，再加入糖基转移酶，加入外加能量场，在40-60℃下，反应3-5h；加入糖化酶，水解1-1.5h后，超滤膜过滤得到超滤流出液；超滤流出液中加入活性炭脱色后过滤得到滤液；向滤液中加入已活化的酵母菌，发酵16-24h，离心除去菌体，得到上清液；上清液经过柱层析分离提纯后得到纯度90-95％以上的葡萄糖苷抗坏血酸溶液；葡萄糖苷抗坏血酸溶液在压力-0.1MPa，40℃浓缩至浓度76-80％以上，加入1-2％的晶种，逐步降温至10-25℃结晶制得葡萄糖苷抗坏血酸纯品；

其中，以每克淀粉类物质计，淀粉类物质与L-抗坏血酸或L-抗坏血酸盐的比例为10∶1～1∶10，优选4∶1～1∶4。淀粉类物质比例高于上述范围可以提高L-抗坏血酸的转化率，但目标产物产量低，L-抗坏血酸比例高于上述优选范围可以提高产量，但会有大量未反应L-抗坏血酸，增加后提取成本，因而优选上述范围。

具体的，所述淀粉类物质选自直链淀粉、支链淀粉、糊精、环糊精或低聚麦芽糊精；优选低聚麦芽糊精、DE值6-60。此时，反应产生的葡萄糖苷抗坏血酸产量较高，2-O-α-D-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-D-麦芽三糖基-L-抗坏血酸等副产物产量较低低，因而节省用于水解除去副产物的糖化酶用量。

具体的，所述L-抗坏血酸盐选自L-抗坏血酸钠、L-抗坏血酸钙、L-抗坏血酸钾中的一种，或者是它们的混合物；优选L-抗坏血酸钙，因为钙盐对酶活力的稳定性有促进作用。

具体的，所述糖基转移酶本发明不作特别限定，可以采用已知的能使糖基与L-抗坏血酸反应生成葡萄糖苷抗坏血酸的酶，选自α淀粉酶、α葡萄糖苷转移酶、环糊精葡萄糖基转移酶、异麦芽葡萄糖基生成酶，优选异麦芽葡萄糖基生成酶，使用异麦芽葡萄糖基生成酶的优势在于生成5-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸、6-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸、3-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸等异构副产物的产量低。

所述超声波的使用频率为20KHz-60KHz；所述微波的使用功率为600W-1200W。具体的，所述超声波的频率为30KHz-50KHz。其中，超声波在反应溶液中疏密相间的向前辐射，使液体流动而产生数以万计的微小气泡，存在于液体中的微小气泡(空化核)在声场的作用下振动，当声压达到一定值时，气泡迅速增长，然后突然闭合，在气泡闭合时产生冲击波，在其周围产生上千个大气压力，微粒间这种剧烈的相互作用，会使液体的温度骤然升高，起到了很好的搅拌作用，且加速溶质的溶解，加速反应。微波等其他外加能量场的原理各不相同，但均可加快反应速率，显著减少反应时间，提高底物转化率。超声波反应器较易实现大规模生产，因此外加能量场优选超声波。

与现有技术相比，本发明使用外加能量场提高了淀粉类物质以及L-抗坏血酸或L-抗坏血酸盐的分子活化能、加速了分子的相互碰撞，因此有效提高了分子间的反应速度，缩短了整体的反应时间，降低了分子间反应时对于温度的要求，同时提高葡萄糖苷抗坏血酸的转化率；与传统的柱层析分离除糖法相比，在进行柱层析分离前，使用微生物酵母菌发酵除去反应中残余的糖，酵母菌代谢途径清晰，发酵过程容易控制，产物多为醇类，在后续柱层析时易于除去，能够大大减少纯水使用量、再生树脂的酸碱使用量，既节能减排，又降低了成本。

具体实施方式

下面结合实施例对是为了更好的说明本发明，而不是对本发明进行限制。

测试方法：

L-抗坏血酸的转化率：采用HPLC测定。

实施例1：

40％低聚麦芽糊精(DE值6)加热溶解，在还原态条件向溶液中加入10％L-抗坏血酸钙，调节反应液pH至5.5，按照糊精质量加入200U/g的异麦芽葡萄糖基生成酶，在超声波反应釜中55℃反应3h，超声波频率30KHz，反应结束后加入糖化酶1000U/g，水解1h，对反应液进行HPLC分析发现，69％的L-抗坏血酸转化为葡萄糖苷抗坏血酸。将反应液通过超滤膜以去除溶液中的酶及其他大分子物质，将超滤流出液加入活性炭脱色后过滤，滤液中含有葡萄糖、糊精、葡萄糖苷抗坏血酸及L-抗坏血酸，向溶液中添加一定量活化后的酵母菌，发酵24h后，检测葡萄糖和糊精均被酵母菌吸收利用，离心去除菌体，上清液进行柱层析分离提纯葡萄糖苷抗坏血酸。首先进入强酸型阳离子交换树脂脱盐，再通过强酸型阳离子树脂分离L-坏血酸及葡萄糖苷抗坏血酸，得到纯度为95％以上的葡萄糖苷抗坏血酸溶液，将该溶液减压40℃浓缩至浓度75％以上，加入2％的晶种，逐渐降温至25℃结晶制得含量99.5％以上葡萄糖苷抗坏血酸纯品。

实施例2：

5％低聚麦芽糊精(DE值60)加热溶解，在还原态条件向溶液中加入20％L-抗坏血酸钙及L-抗坏血酸混合物，调节反应液pH至5.0，按照糊精质量加入100U/g的异麦芽葡萄糖基生成酶，在超声反应釜中60℃反应5h，超声波频率50KHz，反应结束后加入糖化酶1000u/g，水解1.5h，对反应液进行HPLC分析发现，68％的L-抗坏血酸转化为葡萄糖苷抗坏血酸。将反应液通过超滤膜以去除溶液中的酶及其他大分子物质，将超滤流出液超滤加入活性炭脱色后过滤，将滤液低温抽真空浓缩，浓缩滤液中含有葡萄糖、糊精、葡萄糖苷抗坏血酸及L-抗坏血酸，向溶液中添加一定量活化后的酵母菌，发酵16h后，检测葡萄糖和糊精均被酵母菌吸收利用，离心去除菌体，上清液进行离子交换树脂分离提纯葡萄糖苷抗坏血酸，通过强酸型阳离子树脂分离L-坏血酸及葡萄糖苷抗坏血酸，得到纯度为90％以上的葡萄糖苷抗坏血酸溶液，将该溶液减压40℃浓缩至浓度76％以上，加入2％的晶种，逐渐降温至25℃结晶制的含量99.5％以上葡萄糖苷抗坏血酸纯品。

实施例3：

15％低聚麦芽糊精(DE值15)或者支链淀粉加热溶解，在还原态条件向溶液中加入15％L-抗坏血酸钠或L-抗坏血酸钾，调节反应液pH至5.2，按照糊精质量加入200U/g的异麦芽葡萄糖基生成酶，在微波反应器中40℃反应4h，反应结束后加入糖化酶1000u/g，水解1.5h。对反应液进行HPLC分析发现，66％的L-抗坏血酸转化为葡萄糖苷抗坏血酸。将反应液通过超滤膜以去除溶液中的酶及其他大分子物质，将超滤流出液超滤加入活性炭脱色后过滤，滤液中含有葡萄糖、糊精、葡萄糖苷抗坏血酸及L-抗坏血酸，向溶液中添加一定量活化后的酵母菌，发酵20h后，检测葡萄糖和糊精均被酵母菌吸收利用，离心去除菌体，上清液进行离子交换树脂分离提纯葡萄糖苷抗坏血酸。首先进强酸型阳离子交换树脂脱盐，在通过强酸型阳离子树脂分离L-坏血酸及葡萄糖苷抗坏血酸，得到纯度为95％以上的葡萄糖苷抗坏血酸溶液，将该溶液减压40℃浓缩至浓度80％以上，加入1％的晶种，逐渐降温至10℃结晶制的葡萄糖苷抗坏血酸纯品。

实施例4：

5％直链淀粉或者环糊精加热溶解，在还原态条件向溶液中加入5％L-抗坏血酸钠与L-抗坏血酸混合物，调节反应液pH至5.3，按照糊精质量加入100U/g的异麦芽葡萄糖基生成酶，在超声反应釜中50℃反应5h，超声波频率40KHz，反应结束后加入糖化酶1000u/g，水解1.5h，对反应液进行HPLC分析发现，70％的L-抗坏血酸转化为葡萄糖苷抗坏血酸。将反应液通过超滤膜以去除溶液中的酶及其他大分子物质，将超滤流出液超滤加入活性炭脱色后过滤，将滤液低温抽真空浓缩，浓缩滤液中含有葡萄糖、糊精、葡萄糖苷抗坏血酸及L-抗坏血酸，向溶液中添加一定量活化后的酵母菌，发酵16h后，检测葡萄糖和糊精均被酵母菌吸收利用，离心去除菌体，上清液进行离子交换树脂分离提纯葡萄糖苷抗坏血酸，通过强酸型阳离子树脂分离L-坏血酸及葡萄糖苷抗坏血酸，得到纯度为90％以上的葡萄糖苷抗坏血酸溶液，将该溶液减压40℃浓缩至浓度76％以上，加入2％的晶种，逐渐降温至25℃结晶制的含量99.5％以上葡萄糖苷抗坏血酸纯品。

综上所述，本发明，使用外加能量场提高了淀粉类物质以及L-抗坏血酸或L-抗坏血酸盐的分子活化能、加速了分子的相互碰撞，因此有效提高了分子间的反应速度，缩短了整体的反应时间，降低了分子间反应时对于温度的要求，同时提高葡萄糖苷抗坏血酸的转化率；与传统的柱层析分离除糖法相比，在进行柱层析分离前，使用微生物酵母菌发酵除去反应中残余的糖，酵母菌代谢途径清晰，发酵过程容易控制，产物多为醇类，在后续柱层析时易于除去，能够大大减少纯水使用量、再生树脂的酸碱使用量，既节能减排，又降低了成本。

包括以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺，其特征在于：依次包括以下步骤：

使用淀粉糖基及L-抗坏血酸或其盐为原料，在外加能量场的条件下制备葡萄糖苷抗坏血酸，反应结束后，得的葡萄糖、糊精、葡萄糖苷抗坏血酸及L-抗坏血酸的混合物，之后通过添加一定量的微生物以去除反应溶液中的葡萄糖和糊精，再通过离子交换色谱去除L-抗坏血酸，分离提取纯度＞95％的产物，最后通过浓缩结晶即可制备出葡萄糖苷抗坏血酸晶体。

2.权利要求1所述的葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺，其特征在于：所述糖基原料为淀粉类物质，只要能与L-抗坏血酸反应生成葡萄糖苷抗坏血酸的均可，包括直链淀粉，支链淀粉，糊精、环糊精或低聚麦芽糊精。

3.权利要求1所述的葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺，其特征在于：所述糖基转移酶只要能使糖基与L-抗坏血酸反应生成葡萄糖苷抗坏血酸的酶均可，包括α淀粉酶、α葡萄糖苷转移酶、环糊精葡萄糖基转移酶或异麦芽葡萄糖基生成酶。

4.权利要求1所述的葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺，其特征在于：所述L-抗坏血酸或其盐包括L-抗坏血酸，L-抗坏血酸钠、L-抗坏血酸钙、L-抗坏血酸钾等L-抗坏血酸金属盐。

5.权利要求1所述的葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺，其特征在于：所述外加能量场只要能加速反应，提高反应转化率均可，包括但不限于超声波、电磁波。

6.权利要求1所述的葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺，其特征在于：所述微生物只要能消耗葡萄糖、糊精，不水解或者在一定条件下不水解葡萄糖苷抗坏血酸的均可。

7.根据权利要求1-4中任意一项所述的葡萄糖苷抗坏血酸制备的新工艺，其特征在于：其步骤包括：将淀粉类物质作为糖基原料加热溶解后，在还原态条件下加入L-抗坏血酸或L-抗坏血酸盐或两者的混合物，调节反应溶液的PH为5-5.5，再加入糖基转移酶，加入外加能量场，在40-60℃下，反应3-5h；加入糖化酶，水解1-1.5h后，超滤膜过滤得到超滤流出液；超滤流出液中加入活性炭脱色后过滤得到滤液；向滤液中加入已活化的酵母菌，发酵16-24h，离心除去菌体，得到上清液；上清液经过柱层析分离提纯后得到纯度90-95％以上的葡萄糖苷抗坏血酸溶液；葡萄糖苷抗坏血酸溶液在压力-0.1MPa，40℃浓缩至浓度76-80％以上，加入1-2％的晶种，逐步降温至10-25℃结晶制得葡萄糖苷抗坏血酸纯品；

以每克淀粉类物质计，淀粉类物质与L-抗坏血酸或L-抗坏血酸盐的比例为10∶1～1∶10，优选4∶1～1∶4。