CN102071235A - 利用超声波促进酶制剂高效转化异麦芽酮糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用超声波促进酶制剂高效转化异麦芽酮糖的方法，其特点是通过对酶制剂及转化液进行超声波照射来提高异麦芽酮糖转化率进而提高收率，无母液等副产物。同时给出具有超声波耐受性的转化用菌种以及增强的细胞固定化方法。本发明首先发酵红色精朊杆菌并收集菌体，然后对菌体固定化用于蔗糖的转化，在转化过程中使用超声波照射，再将该蔗糖转化液进行脱色、过滤、离子交换、浓缩和结晶或喷雾造粒，干燥后得到异麦芽酮糖成品。本发明的方法可将98%以上的蔗糖地转化为异麦芽酮糖，没有副产物，实际收率可达到100%。这大幅度地降低了生产成本，从而提高了产品的竞争力。
Description
技术领域
本发明涉及一种异麦芽酮糖制备方法，具体涉及利用超声波促进酶制剂高效转化异麦芽酮糖的制备方法。
背景技术
异麦芽酮糖是蔗糖的同分异构体，含1摩尔的结晶水，分子量为360.32，熔点123~124℃，甜度为蔗糖的42%，吸湿性低，耐酸解，具有还原性，不易被细菌利用，不易引起血糖和胰岛素波动等特点，是一种理想的功能甜味剂。由于在体内吸收缓慢，可作为缓释的能量给体力劳动者和脑力劳动者食用。
通常情况下，利用酶制剂对蔗糖进行转化得到异麦芽酮糖。现有的生物酶制剂及生产工艺对蔗糖的转化率可达到99% 以上，但是异麦芽酮糖的获得率只占85% 左右，其余为海藻酮糖等。在此基础上，通过结晶的方式得到的异麦芽酮糖的收率只有55%左右，所得母液难以处理。因此生产成本居高不下，国内两家企业目前都处于停产或半停产状态。为解决异麦芽酮糖的收率问题，一些发明人提出一些了解决方案：中国专利200710190755.2当中，发明人徐虹等提出了利用大黄欧文氏菌制备异麦芽酮糖的方法。该方法中最多能够得到90% 的异麦芽酮糖转化率，仍有10% 的杂糖；中国专利200910114186.2当中，发明人广西投资集团维科特生物技术有限公司提出的利用酒精发酵手段除去杂糖，可使收率最高达到85%。其中杂糖的发酵损失仍然有15% 左右。发酵后，成品糖中的异味难以除去。上述两个专利当中，都提出了利用海藻酸钙固定化细胞的方法。在规模化生产当中，这种细胞固定化方式无法承受长时间的流体冲击，造成海藻酸钙球体软化粘结，细胞脱落。
发明内容
本发明的目的是通过对酶制剂及转化液进行超声波照射来提高异麦芽酮糖转化率进而提高收率。降低生产成本，提高产品的竞争力。
本发明提出的利用超声波促进酶制剂高效转化异麦芽酮糖的方法，其工艺过程如下：
（1）菌体的发酵、培养和收集：将为总量5~20% 的菌种红色精朊杆菌TS101变种以及由下列组成的发酵培养基：蔗糖2~8%、玉米浆1~6%、酵母浸膏0.1~2%、氯化钠0.01~0.5%、磷酸氢二钾0.01~0.1%和余量水，装入发酵罐内，装料量为罐体积的50~80%，控制PH 6.0~7.5，温度25~33℃，通气量为：通气量/发酵罐体积=1:0.5~1:1.0。搅拌速度100~250转/分钟。于6~12小时多次补充浓度为10~60% 的灭菌蔗糖溶液，总补糖量为装料量的5~10%，总发酵时间10~30小时。发酵结束后，通过离心工序回收得到细胞浓浆。离心采用10000~20000转/分钟的离心机分离。整个回收细胞浓浆的过程中，控制温度为15~25℃；
（2）菌体的包埋固定化及转化罐：将步骤（1）所得到的细胞浓浆10mL与10mL质量分数为2~4%的海藻酸钠溶液以及100~1000mg的玻璃纤维粉（50~1000 μm左右）混合，用注射器滴加到200mL 0.2mol/L的CaCl2溶液中，25~30℃下静置固化2小时后，过滤洗涤。将颗粒体移至200mL质量分数为0.1~0.2%的戊二醛溶液中，于33~37℃交联2小时后，过滤洗涤后，得到球状固定化酶。将固定化酶装入转化罐中并固定好，始终保持无污染状态。转化罐中设置有超声波发射器，可发射一定频率及强度的超声波，频率及强度可根据需要调整设定；
（3）蔗糖转化及成品：用浓度30~60% 的蔗糖溶液将转化系统充满，在25~35℃、PH为5~7、超声波照射频率18~150Hz 以及强度1~1000W/cm2的条件下，转化3~30小时，将蔗糖转化为异麦芽酮糖，使异麦芽酮糖转化率达到98% 以上。然后将转化液放出，经脱色、过滤、离子交换，并浓缩至50~75%的浓度，然后进行喷雾造粒或结晶及干燥等常规工序得到成品。如果对浓缩液直接加晶种喷雾造粒，则没有母液产生，全部为成品。如果采用降温式结晶罐结晶，虽有母液产生，但母液仍可循环利用；
（4）转化罐中的固定转化酶可重复使用，加入蔗糖液重复上面的条件，便可继续转化。通常，本发明所述的固定转化酶的使用周期为30~90天。到期后重复步骤（1）和（2），更换新酶。
所述的红色精朊杆菌PROTAMINOBACTOR RUBER 为美国菌种保藏中心提供的代号为ATCC8457的菌种。所述的红色精朊杆菌TS101变种的制备方法：通过蔗糖驯化和诱导使红色精朊杆菌产生高酶活的α—葡萄糖基转移酶。该菌种具有高效稳定、超声波耐受性强、超声波下转化方向性好的特点。
本发明的优点：
（1）通过对酶制剂及转化液进行超声波照射来提高异麦芽酮糖转化率进而提高收率。将98% 以上的蔗糖地转化为异麦芽酮糖，没有副产物，收率达到100%。
（2）可将转化液直接进行喷雾干燥，避免了结晶分离等过程。
（3）给出了具有超声波耐受性的转化用菌种以及增强的细胞固定化方法。
附图说明
图1是本发明的异麦芽酮糖的制备工艺原理图。
图中E-1为转化罐，E-2为循环泵，E-3为换热器。
如图1所示，在生物转化反应器固定化酶制剂区域设置超声波发射器。超声波在酶制剂区域促进酶制剂将蔗糖转化成异麦芽酮糖。循环泵使转化液在反应器内循环，循环时经过酶制剂。换热器调节转化液温度。
菌种红色精朊杆菌TS101目前已于2010年11月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号为4365。
具体实施方式
实施例1
1. 将红色精朊杆菌TS101变种从斜面菌种活化至三级摇瓶种，每次加入量是总量的10%，再转入10L种子罐发酵培养10小时，转至100L发酵罐扩大培养12小时，种子罐与发酵罐的参数相同。发酵液组成：蔗糖6%、玉米浆5%、酵母膏0.5%、氯化钠0.1%、磷酸氢二钾0.1%、其余为水，PH 6.8，装料量60%、通气量为1: 0.8，补糖时间为第8小时，补糖量为发酵体积的5%，总发酵时间为12小时；
2. 用离心机将上一步所得的发酵液离心分离获得细胞浓浆，离心机转数15000转/分，收集得2L细胞浓浆；
3. 将步骤2所的到细胞浓浆2L与2L质量分数为2%的海藻酸钠溶液以及50g的玻璃纤维粉混合，用注射器滴加到40L 0.2mol/L的CaCl2溶液中，25~30℃下静置固化2小时后，过滤洗涤。将颗粒体移至40L质量分数为0.15% 的戊二醛溶液中，于33~37℃交联2小时后，过滤洗涤后，得到球状固定化酶4L。将固定化酶装入容积为10L的转化罐中并固定好，始终保持无污染状态。转化罐中设置有超声波发射器，可发射一定频率及强度的超声波，频率及强度可根据需要调整设定；
4. 用蔗糖5kg及去离子水配置50% 浓度的蔗糖溶液10L，90℃消毒10分钟，冷却到30℃；
5. 将第4步得到的蔗糖溶液加入到转化罐及系统中，使系统充满。系统包括转化罐、固定化酶制剂、循环泵、超声波发射器、换热器等，系统有效容积为10L，如图1所示。维持转化温度28~30℃，控制循环泵流量在1~2L/分钟，保持转化罐内超声波频率20Hz、超声波强度30W/cm2，当蔗糖转化率达到99%以上时，将转化液全部放出，测得异麦芽酮糖含量达到98.0%，其它为海藻酮糖；
6. 将上一步所得转化液脱色过滤后，经离子交换使电导率达到30以下；
7. 按比例连续加入晶种500g，喷雾干燥床中对精制后的转化液进行喷雾干燥，得到粉末状异麦芽酮糖成品5.5kg；
8. 重复第4~5步80次，所得转化液异麦芽酮糖含量平均值为98.0%。酶制剂颗粒情况正常，没有通常的颗粒垮塌和细胞脱落现象。
实施例2
本实施例的前4步与实施例1相同，第5步的其它条件也与实施例1相同，只有超声波条件有变化。将超声波频率调整到20Hz、强度调整到45W/cm2，当蔗糖转化率达到99%以上时，将转化液放出，测得异麦芽酮糖含量达到98.3%。
实施例3
本实施例的前4步与实施例1相同，第5步的其它条件也与实施例1相同，只有超声波条件有变化。将超声波频率调整到30Hz、强度调整到45W/cm2，当蔗糖转化率达到99%以上时，将转化液放出，测得异麦芽酮糖含量达到98.7%。
实施例4
将实施例1中第3步玻璃纤维粉调整为30g，其它步骤不变，在第8步中转化80次时，固定化酶制剂已经粘连成块。异麦芽酮糖平均转化率也只有95%。
Claims (6)
1.本发明是一种利用超声波促进酶制剂高效转化异麦芽酮糖的方法，其特征包括以下步骤：
（1） 菌体的发酵、培养和收集：将为总量5~20% 的菌种红色精朊杆菌TS101变种以及由下列组成的发酵培养基：蔗糖2~8%、玉米浆1~6%、酵母浸膏0.1~2%、氯化钠0.01~0.5%、磷酸氢二钾0.01~0.1%和余量水，装入发酵罐内，装料量为罐体积的50~80%，控制PH 6.0~7.5，温度25~33℃，通气量为：通气量/发酵罐体积=1:0.5~1:1.0；搅拌速度100~250转/分钟；于6~12小时多次补充浓度为10~60%的灭菌蔗糖溶液，总补糖量为装料量的5~10%，总发酵时间10~30小时；发酵结束后，通过离心工序回收得到细胞浓浆；离心采用10000~20000转/分钟的离心机分离；整个回收细胞浓浆的过程中，控制温度为15~25℃；
（2）菌体的包埋固定化及转化罐：将步骤（1）所得到的细胞浓浆10mL与10mL质量分数为2~4% 的海藻酸钠溶液以及100~1000mg玻璃纤维丝粉（50~1000 μm左右）混合，用注射器滴加到200mL 0.2mol/L的CaCl2溶液中，25~30℃下静置固化2小时后，过滤洗涤；将颗粒体移至200mL质量分数为0.1~0.2%的戊二醛溶液中，于33~37℃交联2小时后，过滤洗涤后，得到球状固定化酶；将固定化酶装入转化罐中并固定好，始终保持无污染状态；转化罐中设置有超声波发射器，可发射一定频率及强度的超声波，频率及强度可根据需要调整设定；
（3）蔗糖转化及成品：用浓度30~60% 的蔗糖溶液将转化系统充满，在25~35℃、PH为5~7、超声波照射频率18~150Hz，强度1~1000W/cm2的条件下，转化3~30小时，将蔗糖转化为异麦芽酮糖，使异麦芽酮糖转化率达到98% 以上；然后将转化液放出，经脱色、过滤、离子交换，并浓缩至50~75% 的浓度，然后进行喷雾造粒或结晶及干燥等常规工序得到成品；如果对浓缩液直接加晶种喷雾造粒，则没有母液产生，全部为成品；如果采用降温式结晶罐结晶，虽有母液产生，但母液仍可循环利用；转化罐中的固定转化酶可重复使用，加入蔗糖液重复上面的条件，便可继续转化；通常，本发明所述的固定转化酶的使用周期为30~90天；到期后重复步骤（1）和（2），更换新酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）所述的红色精朊杆菌TS101变种是通过蔗糖驯化和诱导使红色精朊杆菌产生高酶活的α—葡萄糖基转移酶；该菌种具有高效稳定、超声波耐受性强、超声波下转化方向性好的特点。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所述的在生物转化反应器固定化酶制剂区域设置超声波发射器；超声波设置在酶制剂区域促进酶制剂将蔗糖转化成异麦芽酮糖。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所述的在制备固定化酶制剂颗粒时，加入50~1000μm左右的玻璃纤维丝粉，混入海藻酸钙骨架中，增加颗粒强度，以适应超声波照射下的耐久性和对超声波的传导性。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所述的玻璃纤维丝粉的加入量为100~1000mg；这是在由步骤（1）所得细胞浓浆为10mL体系下的加入量；若所得细胞浓浆体积有变，则按比例相应调整玻璃纤维丝粉的加入量；玻璃纤维丝粉的加入量会影响异麦芽酮糖的转化率。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）所述的超声频率及强度设置为超声波照射频率18~150Hz，强度1~1000W/cm2。
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