CN101974508A - 一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101974508A CN101974508A CN2010102970752A CN201010297075A CN101974508A CN 101974508 A CN101974508 A CN 101974508A CN 2010102970752 A CN2010102970752 A CN 2010102970752A CN 201010297075 A CN201010297075 A CN 201010297075A CN 101974508 A CN101974508 A CN 101974508A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzyme
- cyclodextrin
- glucose glycosides
- immobilized
- transferring enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用,首先在酶液中加入分子筛,其次加入戊二醛使混合液交联,然后经海藻酸钠和氯化钙的包埋,得到固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶。本发明所制得的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶具有较高热稳定性和贮存稳定性,同时可采用粗酶液进行固定化,大大降低了固定化的成本,所述固定化酶可用于2-O-葡萄糖基抗坏血酸的生产,转化率高达0.22g·L-1·h-1,转化结束后产物易于提取,固定化酶也便于回收,还可重复利用。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域,具体涉及一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用
背景技术
L-抗坏血酸(简称VC)在体内发挥着重要的生理作用,但其还原性强,极不稳定,这使得它在应用上受到了很大的限制。VC的衍生物则大大提高了它的稳定性,而不影响它的生理功能。本专利就其衍生物之一2-O-葡萄糖基抗坏血酸在糖基转移酶的作用下的生物合成。
2-O-葡萄糖基抗坏血酸有着比L-抗坏血酸更广泛的应用价值,其生物转化合成法是唯一的生产方法。1990年日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系共同发现2-O-葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G),并已确定大量合成这种维生素C衍生物的方法。目前的研究主要集在对AA-2G生理功能研究。对于产量的提高主要通过筛选能产糖基转移酶和优化发酵过程中的参数等来提高转化效率。Prousoontorm等人通过共价结合的方法将环糊精葡萄糖苷转移酶结合在3-Aminopropyltriethoxysilane(APTS)上。(Production of 2-O-a-glucopyranosyl L-ascorbic acid from ascorbic acid and b-cyclodextrin using immobilized cyclodextrin glycosyltransferase,Incl Phenom Macrocycl Chem(2007)57:39-46)。虽然上述方法得到了固定化环糊精葡萄糖苷转移酶,但是固定化后对酶活的损失很大,不到游离酶的一半。目前开发的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶,主要存在如下不足:(1)热稳定性和贮存稳定性较差,不适合AA-2G的生产;(2)固定化成本较高,不适合工业化生产。
发明内容
本发明的所要解决的一个技术问题是提供一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的制备的方法。
为解决上述技术问题,提供如下技术方案:
首先环糊精葡萄糖苷转移酶的酶液中加入分子筛吸附,其次加入戊二醛使混合液交联,再经海藻酸钠和氯化钙的包埋,得到固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶。
具体步骤如下:
向酶液中加入2-10mg/mL的分子筛,置于摇床在16℃,150rpm下充分吸附;添加10μL/mL 25%的戊二醛溶液,使环糊精葡萄糖苷转移酶与分子筛交联4h;加入20mg/mL海藻酸钠,与溶液混匀,放入4℃冰箱过夜脱气;用注射器逐滴滴入浓度为3%CaCl2溶液硬化1h,收集胶囊用蒸馏水冲洗至无蛋白析出,将冲洗后的胶囊置甘油中4℃冰箱保存备用。
所述环糊精葡萄糖苷转移酶来源于Paenibacillus macerans JFB05-01(CCTCC NO:M208063),通过Escherichia coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)在胞外表达。(Calcium Leads to Further Increase in Glycine-Enhanced Extracellular Secretion of Recombinant r-Cyclodextrin Glycosyltransferase in Escherichia coli,J.Agric.Food Chem.2009,57,6231-623)
所述Escherichia coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)培养条件:
(1)种子培养:将保藏的菌种接入装有50ml LB培养基的250ml三角瓶中,回旋式摇床转速200r/min,培养温度为37℃,培养8小时。
(2)发酵培养:将培养好的种子培养液按4%(v/v)的接种量,接种至装有100mL TB培养基的500mL三角瓶中进行发酵培养,开始培养温度为30℃,摇床转速200r/min,当菌体培养至OD600为0.6时,添加IPTG至0.01mM,同时添加一定量的甘氨酸或CaCl2,迅速转至25℃摇床,继续诱导90h。
上述各培养基中使用前添加100μg/mL氨苄青霉素。
所述酶液可以为去除菌体后的发酵液,或上述发酵液去除杂质得到的精制酶液,其中环糊精葡萄糖苷转移酶的活力为160U/mL。
本发明所要解决的另一个问题是提供一种通过上述方法制备的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶。
所述固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的最适温度45℃,最适pH为5.0,贮存两个月后仍然保持71.1%活力(图4)。
所述酶活力损失的测定方法:将固定化环糊精葡萄糖苷转移酶放于4℃冰箱内,每隔10天从冰箱中取样,通过固定化环糊精葡萄糖苷转移酶转化合成AA-2G的量表征固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的活力。
本发明还要解决的一个问题是提供了一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的应用。
为解决上述技术问题,提供如下技术方案:
以固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶为催化剂,催化β-环糊精和L-抗坏血酸反应生产2-O-葡萄糖基抗坏血酸。
将900U/mL的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶加入含β-环糊精(5%,w/v),L-抗坏血酸(5%,w/v)的磷酸盐缓冲溶液(pH=6),置于45℃水浴锅中保温,在避光避氧的条件下反应。
反应的过程中取样,利用HPLC检测2-O-葡萄糖基抗坏血酸生成情况,当反应完成时,将固定化好的环糊精葡萄糖苷转移酶离心取出,用磷酸盐缓冲溶液(pH=6)冲洗后保存到甘油中留下次备用;优选24h时作为反应结束时间。
本发明改进了传统的酶固定化工艺,所制备得到的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶具有较高热稳定性和贮存稳定性,同时可采用粗酶液进行固定化,大大降低了固定化的成本,所制备得到的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶可用于2-O-葡萄糖基抗坏血酸的生产,转化率高达0.22g*L-1*h-1,转化结束后产物易于提取,固定化酶也便于回收,还可重复利用。
附图说明:
图1:固定化酶的储存稳定性
-□-游离酶-■-固定化酶
图2:pH对固定化酶和游离酶转化合成AA-2G的影响
-□-游离酶-■-固定化酶
图3:温度对固定化酶和游离酶转化合成AA-2G的影响
-□-游离酶-■-固定化酶
图4:固定化酶的重复利用
具体实施方式
实施例1:2-O-葡萄糖基抗坏血酸测定方法(HPLC法)
转化液经8000rpm离心5min后,取1mL上清液,用蒸馏水定容至10mL容量瓶。然后,用0.22μm滤膜过滤后进样。根据吸峰面积代入标准曲线,计算AA-2G浓度。
液相仪:Agilent 1200液相仪
色谱柱:Agilent SB-Aq
流速:0.5mL/min
检测器:DAD
柱温:25℃
检测波长:238nm
流动相:6.86g KH2PO4,5mL甲醇,溶于1000mL超纯水,用磷酸调pH至2.0。
酶活力定义:以转化液中葡萄糖基抗坏血酸的含量(g/L)来表示酶活,以AA-2G作为标样,并采用HPLC法进行测定。
实施例2:环糊精葡萄糖苷转移酶固定化方法1
向10mL酶液中0.02g的分子筛,然后放入摇床16℃,150rpm摇10h进行充分吸附,然后加入100μL 25%戊二醛溶液混合、交联4h,然后加入0.2g海藻酸钠混匀,放入4℃冰箱过夜脱气,然后用注射器逐滴滴入浓度为3%CaCl2中硬化4h。收集胶囊用蒸馏水冲洗至无蛋白析出,将冲洗后的胶囊置甘油中4℃冰箱保存备用。
实施例3:环糊精葡萄糖苷转移酶固定化方法2
向10mL酶液中0.06g的分子筛,然后放入摇床16℃,150rpm摇8h进行充分吸附,然后加入100μL 25%戊二醛溶液混合、交联4h,然后加入0.2g海藻酸钠混匀,放入4℃冰箱过夜脱气,然后用注射器逐滴滴入浓度为6%CaCl2中硬化2h。收集胶囊用蒸馏水冲洗至无蛋白析出,将冲洗后的胶囊置甘油中4℃冰箱保存备用。
实施例4:环糊精葡萄糖苷转移酶固定化方法3
向10mL酶液中0.1g的分子筛,然后放入摇床16℃,150rpm摇2h进行充分吸附,然后加入100μL 25%戊二醛溶液混合、交联4h,然后加入0.2g海藻酸钠混匀,放入4℃冰箱过夜脱气,然后用注射器逐滴滴入浓度为3%CaCl2中硬化2h。收集胶囊用蒸馏水冲洗至无蛋白析出,将冲洗后的胶囊置甘油中4℃冰箱保存备用。
实施例5:固定化酶的酶学性质
(1)固定化酶的最适反应pH
固定化酶制备过程同实施例2
图2给出了不同的pH条件下分别测定10mL固定化酶和10mL游离酶转化合成AA-2G的量,以合成的AA-2G的量最高作为最适pH,固定化酶的最适pH为5.0。
(2)固定化酶的最适反应温度
固定化酶制备过程同实施例2
图3给出了不同的的温度条件下分别测定10mL固定化酶和10mL游离酶转化合成AA-2G的量,以合成的AA-2G的量最高作为最适温度,固定化酶的最适温度为45℃。
实施例6:固定化酶的应用
固定化酶制备过程同实施例2
将10mL(160U/mL)游离的环糊精葡萄糖苷转移酶固定化好后,加入到10mL含β-环糊精(5%,w/v),L-抗坏血酸(5%,w/v)的磷酸盐缓冲溶液(pH=6),置于45℃水浴锅中保温,在避光避氧的条件下反应。当反应到达24h后,将固定化酶离心后,取上清检测AA-2G的含量,经测定,转化率高达0.22g*L-1*h-1。
实施例7固定化酶的重复利用
固定化酶制备过程同实施例2
将10mL(160U/mL)游离的环糊精葡萄糖苷转移酶固定化好后,加入到10mL含β-环糊精(5%,w/v),L-抗坏血酸(5%,w/v)的磷酸盐缓冲溶液(pH=6),置于45℃水浴锅中保温,在避光避氧的条件下反应。当反应到达24h后,将固定化酶离心后,取上清检测AA-2G的含量,固定化酶用磷酸盐缓冲溶液(pH=6)冲洗3遍后进行下一次的反应,结果见图4。
由图4可知,同一批固定化酶连续反应6次后,依然具有转化合成AA-2G的活性。
Claims (10)
1.一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的制备的方法,其特征在于,首先环糊精葡萄糖苷转移酶的酶液中加入分子筛,其次加入戊二醛使混合液交联,然后经海藻酸钠和氯化钙的包埋,得到固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述酶液为去除菌体后的发酵液或上述发酵液去除杂质得到的精制酶液。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,分子筛浓度为2-10mg/mL,混合液置于转速为150rpm的摇床,充分吸附1-10h。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,戊二醛浓度为10-20μL/mL,交联时间为4-10h。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,海藻酸钠浓度为20mg/mL海藻酸钠,混匀后4℃冰箱过夜脱气。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,逐滴滴入浓度为3-10%CaCl2溶液使之硬化1-4h,蒸馏水冲洗至无蛋白析出后收集胶囊。
7.权利要求1至6任一所述的方法制备得到的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶,其特征在于,酶促反应的最适温度范围为35-45℃,最适pH范围为4.5-6.5。
8.一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的应用,其特征在于,以固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶为催化剂,催化β-环糊精和L-抗坏血酸反应生产2-O-葡萄糖基抗坏血酸。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,催化反应体系为pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液;β-环糊精在反应体系中质量浓度为5%;L-抗坏血酸在反应体系中质量浓度为5%。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,催化条件为45℃水浴锅中避光避氧反应24h。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2010102970752A CN101974508B (zh) | 2010-09-30 | 2010-09-30 | 一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2010102970752A CN101974508B (zh) | 2010-09-30 | 2010-09-30 | 一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101974508A true CN101974508A (zh) | 2011-02-16 |
CN101974508B CN101974508B (zh) | 2012-05-30 |
Family
ID=43574416
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2010102970752A Expired - Fee Related CN101974508B (zh) | 2010-09-30 | 2010-09-30 | 一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101974508B (zh) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105506037A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-04-20 | 长兴制药股份有限公司 | 一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末及其制造方法 |
CN105647847A (zh) * | 2016-03-17 | 2016-06-08 | 南京工业大学 | 产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用 |
CN105707640A (zh) * | 2016-03-07 | 2016-06-29 | 三峡大学 | 一种柑橘果汁脱苦的方法 |
CN106497907A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-03-15 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种生产低聚果糖的固定化细胞及其制备方法与应用 |
CN108277217A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-07-13 | 江南大学 | 一种减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法 |
CN108905983A (zh) * | 2018-07-19 | 2018-11-30 | 浙江工业大学 | 一种用于处理金属加工废水的海藻酸钠-环糊精基材料的制备方法 |
CN115786290A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-03-14 | 郑州尼采生物科技有限公司 | 利用磁性纳米固定化酶将s腺苷甲硫氨酸转化合成acc方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4950600A (en) * | 1987-01-16 | 1990-08-21 | Kabushiki Kaisha Kibun | Method of immobilizing enzymes or microbes with alginate having a low mannuronic acid to guluronic acid ratio |
-
2010
- 2010-09-30 CN CN2010102970752A patent/CN101974508B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4950600A (en) * | 1987-01-16 | 1990-08-21 | Kabushiki Kaisha Kibun | Method of immobilizing enzymes or microbes with alginate having a low mannuronic acid to guluronic acid ratio |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
《Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry》 20070118 Manchumas Hengsakul Prousoontorn et al Production of 2-O-a-glucopyranosyl L-ascorbic acid from ascorbic acid and b-cyclodextrin using immobilized cyclodextrin glycosyltransferase 8-10 第57卷, 2 * |
《中国生物工程杂志》 20090131 杨红艺等 alpha-环状糊精葡萄糖基转移酶的固定化及其性质研究 1-7 第29卷, 第1期 2 * |
《食品与发酵工业》 20070930 郭燕等 海藻酸钠固定化环糊精糖基转移酶的研究 1-7 第33卷, 第9期 2 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105506037A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-04-20 | 长兴制药股份有限公司 | 一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末及其制造方法 |
CN105506037B (zh) * | 2016-01-29 | 2019-05-17 | 长兴制药股份有限公司 | 一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末及其制造方法 |
CN105707640A (zh) * | 2016-03-07 | 2016-06-29 | 三峡大学 | 一种柑橘果汁脱苦的方法 |
CN105647847A (zh) * | 2016-03-17 | 2016-06-08 | 南京工业大学 | 产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用 |
CN106497907A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-03-15 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种生产低聚果糖的固定化细胞及其制备方法与应用 |
CN108277217A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-07-13 | 江南大学 | 一种减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法 |
CN108905983A (zh) * | 2018-07-19 | 2018-11-30 | 浙江工业大学 | 一种用于处理金属加工废水的海藻酸钠-环糊精基材料的制备方法 |
CN115786290A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-03-14 | 郑州尼采生物科技有限公司 | 利用磁性纳米固定化酶将s腺苷甲硫氨酸转化合成acc方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101974508B (zh) | 2012-05-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101974508B (zh) | 一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用 | |
CN106434782A (zh) | 一种产顺式‑4‑羟脯氨酸的方法 | |
CN102586216B (zh) | 一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法 | |
CN101831389B (zh) | 一种产β-D-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法 | |
CN107236695A (zh) | 一种表达蔗糖磷酸化酶的基因工程菌及其应用 | |
CN112760311B (zh) | 一种具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液及其制备方法和应用 | |
CN103756992B (zh) | 一种巧克力微杆菌磁性细胞及其制备方法和应用 | |
CN110317843B (zh) | 一种超分子树枝状淀粉粒子及其合成方法 | |
CN105219661B (zh) | 合成低聚半乳糖的专用菌株及用其合成低聚半乳糖的方法 | |
CN105219663A (zh) | 合成海藻糖的专用菌株及其用于合成海藻糖的方法 | |
CN105713927A (zh) | 利用包埋菌种发酵制取氢气的方法 | |
CN106957835A (zh) | 一种用于海藻糖合酶反应的反应液 | |
CN108977430A (zh) | 一种海洋微生物环糊精葡萄糖基转移酶的固定化方法 | |
CN108660129B (zh) | 溶胶凝胶法固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶双酶的方法 | |
CN105506041A (zh) | 一种发酵生产去甲万古霉素的方法 | |
CN107254461A (zh) | 一种介孔二氧化硅载体固定化内切菊粉酶及其在低聚果糖生产中的应用 | |
CN105296458B (zh) | 一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法 | |
CN104845961A (zh) | 产1,3-二羟基丙酮重组基因工程菌的固定化及应用 | |
CN104450665A (zh) | 一种固定红发夫酵母及制备新科思糖的方法及应用 | |
CN113234609A (zh) | 合成低聚果糖的专用菌株及其用于合成低聚果糖的方法 | |
CN109321559B (zh) | 一种以磁性Fe3O4-多糖微球为载体固定化果糖基转移酶的方法 | |
CN114349806A (zh) | 一种应用纳豆芽孢杆菌对岩藻寡糖混合物进行单糖脱除及纯化的方法 | |
CN103114109B (zh) | 红球菌催化硫醚合成手性亚砜的方法 | |
CN102144768A (zh) | 一种利用固定生物酶酶改甜菊苷母液糖的方法 | |
CN101914601A (zh) | 一种高效生产2-o-葡萄糖基抗坏血酸的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120530 Termination date: 20120930 |