CN101974508A

CN101974508A - 一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用

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Publication number: CN101974508A
Application number: CN2010102970752A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 堵国成; 李江华; 刘龙; 张子臣
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2030-09-30
Also published as: CN101974508B

Abstract

本发明公开了一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用，首先在酶液中加入分子筛，其次加入戊二醛使混合液交联，然后经海藻酸钠和氯化钙的包埋，得到固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶。本发明所制得的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶具有较高热稳定性和贮存稳定性，同时可采用粗酶液进行固定化，大大降低了固定化的成本，所述固定化酶可用于2-O-葡萄糖基抗坏血酸的生产，转化率高达0.22g·L^-1·h^-1，转化结束后产物易于提取，固定化酶也便于回收，还可重复利用。

Description

一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用

背景技术

L-抗坏血酸(简称VC)在体内发挥着重要的生理作用，但其还原性强，极不稳定，这使得它在应用上受到了很大的限制。VC的衍生物则大大提高了它的稳定性，而不影响它的生理功能。本专利就其衍生物之一2-O-葡萄糖基抗坏血酸在糖基转移酶的作用下的生物合成。

2-O-葡萄糖基抗坏血酸有着比L-抗坏血酸更广泛的应用价值，其生物转化合成法是唯一的生产方法。1990年日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系共同发现2-O-葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)，并已确定大量合成这种维生素C衍生物的方法。目前的研究主要集在对AA-2G生理功能研究。对于产量的提高主要通过筛选能产糖基转移酶和优化发酵过程中的参数等来提高转化效率。Prousoontorm等人通过共价结合的方法将环糊精葡萄糖苷转移酶结合在3-Aminopropyltriethoxysilane(APTS)上。(Production of 2-O-a-glucopyranosyl L-ascorbic acid from ascorbic acid and b-cyclodextrin using immobilized cyclodextrin glycosyltransferase，Incl Phenom Macrocycl Chem(2007)57：39-46)。虽然上述方法得到了固定化环糊精葡萄糖苷转移酶，但是固定化后对酶活的损失很大，不到游离酶的一半。目前开发的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶，主要存在如下不足：(1)热稳定性和贮存稳定性较差，不适合AA-2G的生产；(2)固定化成本较高，不适合工业化生产。

发明内容

本发明的所要解决的一个技术问题是提供一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的制备的方法。

为解决上述技术问题，提供如下技术方案：

首先环糊精葡萄糖苷转移酶的酶液中加入分子筛吸附，其次加入戊二醛使混合液交联，再经海藻酸钠和氯化钙的包埋，得到固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶。

具体步骤如下：

向酶液中加入2-10mg/mL的分子筛，置于摇床在16℃，150rpm下充分吸附；添加10μL/mL 25％的戊二醛溶液，使环糊精葡萄糖苷转移酶与分子筛交联4h；加入20mg/mL海藻酸钠，与溶液混匀，放入4℃冰箱过夜脱气；用注射器逐滴滴入浓度为3％CaCl₂溶液硬化1h，收集胶囊用蒸馏水冲洗至无蛋白析出，将冲洗后的胶囊置甘油中4℃冰箱保存备用。

所述环糊精葡萄糖苷转移酶来源于Paenibacillus macerans JFB05-01(CCTCC NO：M208063)，通过Escherichia coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)在胞外表达。(Calcium Leads to Further Increase in Glycine-Enhanced Extracellular Secretion of Recombinant r-Cyclodextrin Glycosyltransferase in Escherichia coli，J.Agric.Food Chem.2009，57，6231-623)

所述Escherichia coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)培养条件：

(1)种子培养：将保藏的菌种接入装有50ml LB培养基的250ml三角瓶中，回旋式摇床转速200r/min，培养温度为37℃，培养8小时。

(2)发酵培养：将培养好的种子培养液按4％(v/v)的接种量，接种至装有100mL TB培养基的500mL三角瓶中进行发酵培养，开始培养温度为30℃，摇床转速200r/min，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，添加IPTG至0.01mM，同时添加一定量的甘氨酸或CaCl₂，迅速转至25℃摇床，继续诱导90h。

上述各培养基中使用前添加100μg/mL氨苄青霉素。

所述酶液可以为去除菌体后的发酵液，或上述发酵液去除杂质得到的精制酶液，其中环糊精葡萄糖苷转移酶的活力为160U/mL。

本发明所要解决的另一个问题是提供一种通过上述方法制备的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶。

所述固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的最适温度45℃，最适pH为5.0，贮存两个月后仍然保持71.1％活力(图4)。

所述酶活力损失的测定方法：将固定化环糊精葡萄糖苷转移酶放于4℃冰箱内，每隔10天从冰箱中取样，通过固定化环糊精葡萄糖苷转移酶转化合成AA-2G的量表征固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的活力。

本发明还要解决的一个问题是提供了一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的应用。

为解决上述技术问题，提供如下技术方案：

以固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶为催化剂，催化β-环糊精和L-抗坏血酸反应生产2-O-葡萄糖基抗坏血酸。

将900U/mL的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶加入含β-环糊精(5％，w/v)，L-抗坏血酸(5％，w/v)的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6)，置于45℃水浴锅中保温，在避光避氧的条件下反应。

反应的过程中取样，利用HPLC检测2-O-葡萄糖基抗坏血酸生成情况，当反应完成时，将固定化好的环糊精葡萄糖苷转移酶离心取出，用磷酸盐缓冲溶液(pH＝6)冲洗后保存到甘油中留下次备用；优选24h时作为反应结束时间。

本发明改进了传统的酶固定化工艺，所制备得到的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶具有较高热稳定性和贮存稳定性，同时可采用粗酶液进行固定化，大大降低了固定化的成本，所制备得到的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶可用于2-O-葡萄糖基抗坏血酸的生产，转化率高达0.22g*L^-1*h^-1，转化结束后产物易于提取，固定化酶也便于回收，还可重复利用。

附图说明：

图1：固定化酶的储存稳定性

-□-游离酶-■-固定化酶

图2：pH对固定化酶和游离酶转化合成AA-2G的影响

-□-游离酶-■-固定化酶

图3：温度对固定化酶和游离酶转化合成AA-2G的影响

-□-游离酶-■-固定化酶

图4：固定化酶的重复利用

具体实施方式

实施例1：2-O-葡萄糖基抗坏血酸测定方法(HPLC法)

转化液经8000rpm离心5min后，取1mL上清液，用蒸馏水定容至10mL容量瓶。然后，用0.22μm滤膜过滤后进样。根据吸峰面积代入标准曲线，计算AA-2G浓度。

液相仪：Agilent 1200液相仪

色谱柱：Agilent SB-Aq

流速：0.5mL/min

检测器：DAD

柱温：25℃

检测波长：238nm

流动相：6.86g KH₂PO₄，5mL甲醇，溶于1000mL超纯水，用磷酸调pH至2.0。

酶活力定义：以转化液中葡萄糖基抗坏血酸的含量(g/L)来表示酶活，以AA-2G作为标样，并采用HPLC法进行测定。

实施例2：环糊精葡萄糖苷转移酶固定化方法1

向10mL酶液中0.02g的分子筛，然后放入摇床16℃，150rpm摇10h进行充分吸附，然后加入100μL 25％戊二醛溶液混合、交联4h，然后加入0.2g海藻酸钠混匀，放入4℃冰箱过夜脱气，然后用注射器逐滴滴入浓度为3％CaCl2中硬化4h。收集胶囊用蒸馏水冲洗至无蛋白析出，将冲洗后的胶囊置甘油中4℃冰箱保存备用。

实施例3：环糊精葡萄糖苷转移酶固定化方法2

向10mL酶液中0.06g的分子筛，然后放入摇床16℃，150rpm摇8h进行充分吸附，然后加入100μL 25％戊二醛溶液混合、交联4h，然后加入0.2g海藻酸钠混匀，放入4℃冰箱过夜脱气，然后用注射器逐滴滴入浓度为6％CaCl2中硬化2h。收集胶囊用蒸馏水冲洗至无蛋白析出，将冲洗后的胶囊置甘油中4℃冰箱保存备用。

实施例4：环糊精葡萄糖苷转移酶固定化方法3

向10mL酶液中0.1g的分子筛，然后放入摇床16℃，150rpm摇2h进行充分吸附，然后加入100μL 25％戊二醛溶液混合、交联4h，然后加入0.2g海藻酸钠混匀，放入4℃冰箱过夜脱气，然后用注射器逐滴滴入浓度为3％CaCl2中硬化2h。收集胶囊用蒸馏水冲洗至无蛋白析出，将冲洗后的胶囊置甘油中4℃冰箱保存备用。

实施例5：固定化酶的酶学性质

(1)固定化酶的最适反应pH

固定化酶制备过程同实施例2

图2给出了不同的pH条件下分别测定10mL固定化酶和10mL游离酶转化合成AA-2G的量，以合成的AA-2G的量最高作为最适pH，固定化酶的最适pH为5.0。

(2)固定化酶的最适反应温度

固定化酶制备过程同实施例2

图3给出了不同的的温度条件下分别测定10mL固定化酶和10mL游离酶转化合成AA-2G的量，以合成的AA-2G的量最高作为最适温度，固定化酶的最适温度为45℃。

实施例6：固定化酶的应用

固定化酶制备过程同实施例2

将10mL(160U/mL)游离的环糊精葡萄糖苷转移酶固定化好后，加入到10mL含β-环糊精(5％，w/v)，L-抗坏血酸(5％，w/v)的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6)，置于45℃水浴锅中保温，在避光避氧的条件下反应。当反应到达24h后，将固定化酶离心后，取上清检测AA-2G的含量，经测定，转化率高达0.22g*L^-1*h^-1。

实施例7固定化酶的重复利用

固定化酶制备过程同实施例2

将10mL(160U/mL)游离的环糊精葡萄糖苷转移酶固定化好后，加入到10mL含β-环糊精(5％，w/v)，L-抗坏血酸(5％，w/v)的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6)，置于45℃水浴锅中保温，在避光避氧的条件下反应。当反应到达24h后，将固定化酶离心后，取上清检测AA-2G的含量，固定化酶用磷酸盐缓冲溶液(pH＝6)冲洗3遍后进行下一次的反应，结果见图4。

由图4可知，同一批固定化酶连续反应6次后，依然具有转化合成AA-2G的活性。

Claims

1.一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的制备的方法，其特征在于，首先环糊精葡萄糖苷转移酶的酶液中加入分子筛，其次加入戊二醛使混合液交联，然后经海藻酸钠和氯化钙的包埋，得到固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶液为去除菌体后的发酵液或上述发酵液去除杂质得到的精制酶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分子筛浓度为2-10mg/mL，混合液置于转速为150rpm的摇床，充分吸附1-10h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，戊二醛浓度为10-20μL/mL，交联时间为4-10h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，海藻酸钠浓度为20mg/mL海藻酸钠，混匀后4℃冰箱过夜脱气。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，逐滴滴入浓度为3-10％CaCl₂溶液使之硬化1-4h，蒸馏水冲洗至无蛋白析出后收集胶囊。

7.权利要求1至6任一所述的方法制备得到的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶，其特征在于，酶促反应的最适温度范围为35-45℃，最适pH范围为4.5-6.5。

8.一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的应用，其特征在于，以固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶为催化剂，催化β-环糊精和L-抗坏血酸反应生产2-O-葡萄糖基抗坏血酸。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，催化反应体系为pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液；β-环糊精在反应体系中质量浓度为5％；L-抗坏血酸在反应体系中质量浓度为5％。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，催化条件为45℃水浴锅中避光避氧反应24h。