CN105647847A - 产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用 - Google Patents

产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用，所述基因工程菌是将环糊精葡萄糖苷转移酶基因通过载体导入到宿主细胞中得到的，其可将产生的环糊精葡萄糖苷转移酶留在细胞内；其中所述的载体为质粒载体pET28a。所述宿主细胞中导入有含分子伴侣Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的质粒pGKJE8。所述菌株将含有分子伴侣Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的质粒pGKJE8和pET28a-cgt一并导入宿主细胞中，实现共表达，可以有效提高蛋白的正确折叠率，从而减少包涵体的形成，提高酶的正确表达率，提高酶活。本发明构建的菌株酶活可提高到7.82U/mg？DCW，通过酶活的提高可以有效提高2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸产量。

Description

产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
L-抗坏血酸（即维生素C，VC）是一种人体自身不能合成但在体内发挥重要生理作用的水溶性维生素。可用来防止坏血病，促进伤口愈合；还可作为还原剂，紫外线吸收剂和黑色素形成抑制剂用于化妆品中。但位于2位碳的羟基极不稳定，导致VC还原性强，极不稳定，易被热和氧化剂破坏，尤其是光，重金属等物质能促进其氧化，使其在应用方面收到限制。
2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸（AA-2G）是一种L-抗坏血酸的衍生物，是由日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系共同发现的，可作为美白剂添加到化妆品中，且由于VC分子上的C-2羟基被葡萄糖苷所取代，其C-2位上有葡萄糖基掩蔽，故其具有较高的稳定性和抗氧化性，是良好的VC替代品。
用于催化VC生成AA-2G的酶有以下五大类，分别为环糊精葡萄糖苷转移酶，α-淀粉酶，蔗糖磷酸酶，α-异麦芽糖基葡糖基形成酶，α-葡糖苷酶。其中最具工业化前景的两种酶为环糊精葡萄糖苷转移酶和α-异麦芽糖基葡糖基形成酶，使用环糊精葡萄糖苷转移酶的最多。α-异麦芽糖基葡糖基形成酶因其酶表达量很低，不利于AA-2G的生成，因此一般要和环糊精葡萄糖苷转移酶一起使用。环糊精葡萄糖苷转移酶的主要来源是细菌Bacillus和Klebsiell属。该酶最大的优势为转化效率较高，但在反应过程中会生成中间产物AA-2Gs，故需要进一步利用葡糖淀粉酶将其水解为AA-2G，但目前CGTase的酶活比较低，相关文献中Peanibacillusmacerans产出的CGTase胞内酶活水平在0.8U/mgDCW左右。
E.coli具有遗传背景清楚、生长速度快、成本低、表达量高、操作简单、表达产物易纯化等优点，是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的经典表达系统。然而，由于E.coli过高的表达水平以及缺乏真核生物的蛋白加工体系，容易导致错误折叠的蛋白聚集形成包涵体，产生没有活性的酶。常用的促进蛋白可溶性表达的方法有降低蛋白合成速度，如降低诱导温度；优化培养条件，如优化培养基，诱导时间；利用分子伴侣和折叠酶等辅助蛋白共表达等。通过以上方法，均可有效提高蛋白可溶性表达，从而提高酶活。
分子伴侣的概念是由Lasky在1978年首先提出的，他将细胞核内能与组蛋白结合并介导核小体有序组装的核质素称为分子伴侣。根据ELLis的定义及后续研究，分子伴侣概念延伸为：它们结合并稳定其它蛋白质的不稳定构象，通过可调控的结合和释放，促进细胞内蛋白质的正确折叠、跨膜转运、寡聚体组装、蛋白与细胞内其它组分的相互作用、有活性和无活性蛋白构象的转换、胞内转运以及蛋白质降解；并且当底物蛋白恢复到正确的天然结构并发挥正常生理功能时，分子伴侣不再与底物蛋白结合。DnaK属于Hsp70家族，其辅助伴侣为DnaJ（属于Hsp40家族）和核苷酸交换因子GrpE。部分科学家认为，DnaK的结合能使去折叠蛋白保持在可折叠状态。当去折叠蛋白从DnaK解离后，一部分能够自发折叠成天然构象。而另一部分折叠缓慢的中间体能反复被Hsp70系统结合与释放，从而阻止肽链中间体的错误聚集，促进蛋白质正确折叠。经过该系统后，将有5-18％的蛋白质折叠为天然结构。GroEL属于伴侣蛋白，其辅助伴侣为GroES。当蛋白质翻译完成后，利用DnaK系统不能实现正常折叠的蛋白将被转移至伴侣蛋白。故可将分子伴侣和含目的基因的质粒一起导入，有效地使蛋白正确折叠，从而提高酶活。
目前，在生产AA-2G方面，日本林原公司在市场上占有垄断地位。AA-2G的价格是VC的100多倍，可见其具有较高的市场价值，但在我国，对于生产AA-2G的研究尚在初步探究的阶段，还未达到工业化的水平，并且其后的分离提纯工艺也需耗费人力物力，有效提高转化率，节约生产成本，简化生产工艺也是当务之急。
在糖基供体的选择中，α-环糊精转化率高，但其价格较为昂贵，不适合工业化生产使用；β-环糊精溶解性较低，转化率略低，但价格便宜；其余的糖基供体转化率很低。因此，本发明过程后期的转化过程选用β-环糊精作为糖基供体，由于其溶解性低，故采用多次分批添加β-环糊精，提高AA-2G的产量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提高环糊精葡萄糖苷转移酶的酶活，提供一种产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用。
一种产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌，该基因工程菌是将环糊精葡萄糖苷转移酶基因通过载体导入到宿主细胞中得到的，其可将产生的环糊精葡萄糖苷转移酶留在细胞内；其中所述的载体为质粒载体pET28a。
所述宿主细胞中导入有含分子伴侣Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的质粒pGKJE8。
所述的基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：
1）将质粒pGKJE8转入感受态宿主细胞中，挑选出转化菌株，制成感受态细胞；
2）将环糊精葡萄糖苷转移酶基因导入到质粒载体pET28a中，构建得到pET28a-cgt表达质粒，然后转入感受态细胞中，通过选择培养基挑选得到基因工程菌。
所述的基因工程菌在产环糊精葡萄糖苷转移酶中的应用，包括如下步骤：
1）将基因工程菌接种至种子培养基，进行种子培养；
2）将步骤1）培养好的种子培养液接种至发酵培养基中,30℃培养2-8h，加IPTG，继续培养至24h，停止发酵，离心，弃上清，用磷酸缓冲液重悬，超声，获得环糊精葡萄糖苷转移酶粗酶液。
为了进一步提高酶活，本发明优化了培养条件，
IPTG浓度为0.01mM-0.4mM。
所述发酵培养基中碳源浓度为5-30g/L，优选为15g/L。
所述的碳源可以为葡萄糖或者麦芽糖，优选为麦芽糖。
所述的基因工程菌在产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸中的应用。
所述环糊精葡萄糖苷转移酶来源于嗜碱性软化类芽孢杆菌(Peanibacillusmacerans)，GenBank登录号为X59045，优化密码子后人工合成得到环糊精葡萄糖苷转移酶基因cgt。
所述宿主细胞可以为细菌或真菌细胞。
基因工程菌的构建方法:将环糊精葡萄糖苷转移酶基因连接到质粒pET-28a上，得到包含环糊精葡萄糖苷转移酶基因的重组质粒pET28a-cgt，然后将重组质粒pET28a-cgt转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，得到重组菌BL21-pET28a-cgt。
包含有分子伴侣的基因工程菌的构建方法：将质粒pG-KJE8（购自Takara，含分子伴侣Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL）转入E.ColiBL21感受态细胞，将携有分子伴侣质粒的菌株E.ColiBL21-pGKJE8制备成感受态细胞；将构建好的pET28a-cgt表达质粒转化入E.ColiBL21-pGKJE8感受态细胞，构建出BL21-pGKJE8-pET28a-cgt菌株。所述菌株将含有分子伴侣Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的质粒pGKJE8和pET28a-cgt一并导入宿主细胞中，实现共表达，可以有效提高蛋白的正确折叠率，从而减少包涵体的形成，提高酶的正确表达率，提高酶活。
所述含环糊精葡萄糖苷转移酶基因导入的载体为pET28a，使酶留在细胞内，便于酶液的保存，同时也有利于酶液浓缩。
本发明应用于AA-2G的生产，反应底物为L-抗坏血酸和β-环糊精，环糊精葡萄糖苷转移酶酶量为50U/mL-200U/mL，温度为30-45℃，pH为4.0-6.0，反应时间20-28h，而后加入糖化酶35-55℃反应20-28h。
有益效果：本发明构建了产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌，该菌株能够使酶留在胞内，便于保存浓缩。优化了菌株的发酵培养条件，利用麦芽糖为碳源，培养基成分简单，且有利于酶活的提高，使酶活由0.61U/mgDCW提高到2.00U/mgDCW。优选的构建了含有分子伴侣的菌株，可以有效减少包涵体的形成，使错误折叠的蛋白重新正确折叠，从而有效地提高酶活。酶活可由原始菌株的2.00U/mgDCW提高到7.82U/mgDCW。通过酶活的提高可以有效提高2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸产量。
具体实施案例
以下实施例中采用的环糊精葡萄糖苷转移酶基因是：根据来源于嗜碱性软化类芽孢杆菌(Peanibacillusmacerans)的环糊精葡萄糖苷转移酶（GenBank登录号为X59045）进行密码子优化人工合成得到环糊精葡萄糖苷转移酶基因，基因序列如SEQ.NO.1所示。
实施例1菌株的构建
pET28a-cgt表达质粒的构建：采用化学合成法合成环糊精葡萄糖基转移酶基因序列cgt。用于构建大肠杆菌的质粒是pET28a，带有T7启动子。将pET28a的质粒用XhoI和BamHI双酶切，酶切产物胶回收。对含有cgt基因的质粒进行菌落PCR，引物如下：
正向引物5’-CAGCAAATGGGTCGCGGATCCAGTCCTGACACCAGCGTGG-3’
反向引物5’-GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATTCTGCCAGTCAACGGTCACTG-3’，
PCR条件：94℃预变性5min；随后30个循环（94℃45s，57℃45s，72℃2min30s）；72℃再延伸10min。
进行胶回收，将胶回收好的PCR过的基因与胶回收好的酶切过的质粒一步克隆，转化入BL21（DE3）中，转化的具体步骤如下：将装有200μl制作好的感受态细胞冰盒上解冻5-10min；加入20μl冷却的一步克隆反应液；手指轻弹，混匀，冰上放置30min；42℃，水浴90s，冰浴2min；加入900μlLB培养基，复苏细胞，37℃，200rpm，培养1h。取100μl涂布在抗性平板上，37℃培养箱培养过夜，长出的菌即为转化成功的菌株。经37℃培养过夜后，进行转点，提取质粒后酶切验证，得到的菌BL21-pET28a-cgt中成功转化有表达质粒pET28a-cgt。
实施例2
分子伴侣共表达体系的构建步骤如下：
步骤1：制备E.ColiBL21感受态细胞（在无菌条件下操作）：将BL21菌体加入5ml的LB试管中，37℃，200rpm，培养12h；取1ml菌液接种到100mlLB摇瓶中，37℃，200rpm，培养至OD600=0.5-0.6，冰上放置10min，然后于4℃下4100rpm离心10min，弃上清；沉淀用4-5ml0.1MCaCl2重悬，冰上放置30min，4℃4100rpm离心10min，弃上清；沉淀用2ml0.05MCaCl2(含15%甘油)重悬，分装后-80℃保存。
步骤2：将质粒pGKJE8（购自Takara，含分子伴侣Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL）转入E.ColiBL21感受态细胞，使用含有25μg/ml氯霉素的选择培养基（酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，氯霉素25μg/ml，琼脂粉15g/L）挑选转化菌株，得到携有分子伴侣质粒的菌株E.ColiBL21-pGKJE8；转化的具体步骤如下：将装有200μl制作好的感受态细胞冰盒上解冻5-10min；加入50-100ng质粒；手指轻弹，混匀，冰上放置30min；42℃，水浴90s，冰浴2min；加入900μlLB培养基，复苏细胞，37℃，200rpm，培养1h。取100μl涂布在抗性平板上，37℃培养箱培养过夜，长出的菌即为转化成功的菌株。
步骤3：制备E.ColiBL21-pGKJE8感受态细胞，具体操作参照步骤1。
步骤4：将构建好的pET28a-cgt表达质粒转化入E.ColiBL21-pGKJE8感受态细胞，使用含25μg/ml氯霉素和30μg/ml卡那霉素的选择性培养基（酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，氯霉素25μg/ml，卡那霉素30μg/ml，琼脂粉15g/L）挑选转化菌株,。
实施例3构建的菌株发酵生产环糊精葡萄糖苷转移酶
种子培养基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，PH7.0，121℃灭菌15min。
发酵培养基（g/L）：酵母粉24，蛋白胨12，KH2PO42.31，K2HPO416.43，葡萄糖5，121℃灭菌15min。
取一环平板上的BL21-pET28a-cgt菌体接种至装有5ml种子培养基的试管中，200r/min，37℃培养11h。将培养好的种子培养液按照4%（v/v）接种量,接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，200r/min，30℃培养2.5h加IPTG，浓度为1mM，继续培养至24h。停止发酵后将发酵液经10000r/min离心10min，弃上清，用PH为6.2的磷酸缓冲液重悬，冻融一次，获得粗酶液。测得酶活为0.61U/mgDCW。
实施例4
种子培养基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，pH7.0，121℃灭菌15min。
发酵培养基（g/L）：酵母粉24，蛋白胨12，KH2PO42.31，K2HPO416.43，葡萄糖5，121℃灭菌15min。
取一环平板上的BL21-pET28a-cgt菌体接种至装有5ml种子培养基的试管中，200r/min，37℃培养11h。将培养好的种子培养液按照4%（v/v）接种量,接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，200r/min，30℃培养2.5h加IPTG，浓度为0.01mM，继续培养至24h。停止发酵后将发酵液经10000r/min离心10min，弃上清，用PH为6.2的磷酸缓冲液重悬，冻融一次，获得粗酶液。测得酶活为1.04U/mgDCW。
实施例6
种子培养基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，pH7.0,121℃灭菌15min。
发酵培养基（g/L）：酵母粉24，蛋白胨12，KH2PO42.31，K2HPO416.43，麦芽糖5,121℃灭菌15min。
取一环平板上的BL21-pET28a-cgt菌体接种至装有5ml种子培养基的试管中，200r/min，37℃培养11h。将培养好的种子培养液按照4%（v/v）接种量,接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，200r/min，30℃培养2.5h加IPTG，浓度为0.01mM，继续培养至24h。停止发酵后将发酵液经10000r/min离心10min，弃上清，用PH为6.2的磷酸缓冲液重悬，超声，获得粗酶液。测得酶活为1.58U/mgDCW。
实施例7
种子培养基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，pH7.0,121℃灭菌15min。
发酵培养基（g/L）：酵母粉24，蛋白胨12，KH2PO42.31，K2HPO416.43，麦芽糖15,121℃灭菌15min。
取一环平板上的BL21-pET28a-cgt菌体接种至装有5ml种子培养基的试管中，200r/min，37℃培养11h。将培养好的种子培养液按照4%（v/v）接种量,接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，200r/min，30℃培养2.5h加IPTG，浓度为0.01mM，继续培养至24h。停止发酵后将发酵液经10000r/min离心10min，弃上清，用PH为6.2的磷酸缓冲液重悬，超声，获得粗酶液。测得酶活为2.00U/mgDCW。
实施例8
种子培养基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，pH7.0,121℃灭菌15min。
发酵培养基（g/L）：酵母粉24，蛋白胨12，KH2PO42.31，K2HPO416.43，麦芽糖15,121℃灭菌15min。
取一环平板上构建好的BL21-pET28a-cgt-pGKJE8菌体接种至装有5ml种子培养基的试管中，200r/min，37℃培养11h。将培养好的种子培养液按照4%（v/v）接种量,接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，并加入0.5g/L的L-阿拉伯糖和5ng/ml的四环素诱导分子伴侣表达，200r/min，30℃，2.5h，加入0.01mMIPTG诱导产酶，继续培养至24h。停止发酵后将发酵液经10000r/min离心10min，弃上清，用PH为6.2的磷酸缓冲液重悬，超声，获得粗酶液，测得酶活为7.82U/mgDCW。
实施例9
合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸
将100g/L的L-抗坏血酸和25g/L的β-环糊精溶于PH为4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液中，并加入酶活为30U/mL环糊精葡萄糖苷转移酶粗酶液（发酵液经10000r/min离心10min，弃上清，用pH为6.2的磷酸缓冲液重悬，超声，获得粗酶液），37℃，避光除氧，200r/min，每隔6h加25g/L的β-环糊精，共反应24h，反应结束后加入100U/mL的糖化酶，55℃，200r/min反应24h，2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸产量达到6g/L。
实施例102-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸测定方法（HPLC法）
样品10000r/min离心10min，取上清适度稀释，0.22μm超滤膜过滤，进行HPLC分析。条件如下：流动相为PH2.0的KH2PO4（0.025M）：甲醇=99.5：0.5溶液，流速0.5ml/min,柱温25℃，进样量5μL。
虽然本发明已以最佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
<110>南京工业大学常茂生物化学工程股份有限公司
<120>产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.3
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<212>DNA
<213>人工序列
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Claims (10)

1.一种产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌是将环糊精葡萄糖苷转移酶基因通过载体导入到宿主细胞中得到的，其可将产生的环糊精葡萄糖苷转移酶留在细胞内；其中所述的载体为质粒载体pET28a。
2.权利要求1所述的产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞中导入有含分子伴侣Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的质粒pGKJE8。
3.权利要求2所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将质粒pGKJE8转入感受态宿主细胞中，挑选出转化菌株，制成感受态细胞；
2）将环糊精葡萄糖苷转移酶基因导入到质粒载体pET28a中，构建得到pET28a-cgt表达质粒，然后转入感受态细胞中，通过选择培养基挑选得到基因工程菌。
4.权利要求1或2所述的基因工程菌在产环糊精葡萄糖苷转移酶中的应用。
5.权利要求1或2所述的基因工程菌在产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1）将基因工程菌接种至种子培养基，进行种子培养；
2）将步骤1）培养好的种子培养液接种至发酵培养基中,30℃培养2-8h，加IPTG，继续培养至24h，停止发酵，离心，弃上清，用磷酸缓冲液重悬，超声，获得环糊精葡萄糖苷转移酶粗酶液。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）中加入的IPTG浓度为0.01mM-0.4mM。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）中所述发酵培养基中碳源浓度为5-30g/L。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）中所述发酵培养基中碳源为麦芽糖。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤2）中所述发酵培养基中碳源浓度为15g/L。
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