CN107383135A - 从发酵液中分离纯化β‑胸苷的方法 - Google Patents

从发酵液中分离纯化β‑胸苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从发酵液中分离纯化β‑胸苷的方法，将β‑胸苷发酵液依次经过微滤、超滤、离子交换树脂层析、反渗透浓缩、真空浓缩得到β‑胸苷粗品，最后将粗品脱色重结晶得到β‑胸苷精品。本发明的提取纯化工艺除杂效果好，自动化程度高，得到的β‑胸苷精品化学纯度≥99.5％，含量≥99.5％，总收率≥80％，非常适合工业化大生产。

Description

从发酵液中分离纯化β-胸苷的方法
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体从发酵液中分离纯化β-胸苷的方法。
背景技术
β-胸苷又名2’-脱氧胸腺嘧啶，是抗艾滋病司他夫定(3’-脱氧-2’,3’-双脱氢胸苷)和叠氮胸苷的前体物质。目前胸苷的生产方法主要有三种。一是化学合成法生产胸苷，工艺过程十分冗长，糖苷键的形成缺乏立体专一性，使得最终得到的胸苷成本较为昂贵。二是生物酶法，具有专一性强的优点，但是周期长，产物不易分离。三是生物发酵法，工艺简单、后续分离成本低廉，是非常有前景的生产方法，因此从生物发酵法制备胸苷得到的发酵液中提取纯化胸苷的方法的研究也成了热门。
CN105859809报道了一种从发酵液中分离纯化β-胸苷的方法：将发酵液预热至60-85℃，然后经过微滤、超滤、电渗析得到渗析液，浓缩后通过离子交换树脂或大孔吸附树脂进行层析，得到层析液浓缩后结晶即可得β-胸苷。所得的β-胸苷成品液相纯度98.98％，外标含量98.6％，总收率70.38％。该方法采用电渗析的方法进行脱盐处理，虽然可以有效的脱除色素、无机盐等，但是对杂质蛋白的脱除率不高，所以该专利后续采取了柱层析的进一步除杂，导致操作的增加、产品的损失；而且电渗析能耗高，膜价格昂贵等等均使得生产成本很高。
因此需要探索一种操作简便、低成本、收率高的分离提纯方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从发酵液中分离纯化β-胸苷的方法。
本发明的第一方面，提供一种从发酵液中分离纯化β-胸苷的方法，包括以下步骤：
a)将β-胸苷发酵液进行微滤处理，得到微滤液；
b)将所述微滤液进行超滤处理，得到超滤液；
c)将所述超滤液依次通过酸性和碱性离子交换树脂，得到离交液；
d)将所述离交液用反渗透膜浓缩，得到反渗透浓缩液；
e)将所述反渗透浓缩液真空浓缩，得到真空浓缩液；
f)将所述真空浓缩液降温至0-5℃，析晶得到β-胸苷粗品；
g)将所述β-胸苷粗品在水中用活性炭脱色后重结晶得到β-胸苷精品。
在另一优选例中，在微滤处理前，所述方法还包括将β-胸苷发酵液的pH调节至2.5-4.5，较佳为3-4的步骤。
在另一优选例中，采用酸调节pH，所述酸选自：硫酸、盐酸、磷酸。
在另一优选例中，所述微滤具有以下一个或多个特征：
(1)所述微滤采用的滤膜为无机陶瓷膜或聚砜膜；
(2)所述微滤采用的滤膜的孔径为50-500nm，较佳为100-400nm；
(3)所述微滤的操作温度为25-100℃，较佳为30-90℃或35-85℃；
(4)所述微滤的操作压力为0.1～0.4MPa，较佳为0.15-0.3MPa；
(5)待发酵液为进料发酵液体积的1/3～2/3时，加入进料发酵液体积1.5-5倍，较佳为2～3倍的水进行顶洗。
在另一优选例中，所述超滤具有以下一个或多个特征：
(1)所述超滤采用的滤膜为卷式超滤膜，选自聚醚砜膜、聚丙烯腈膜、聚偏二氟乙烯膜；
(2)所述超滤采用的滤膜的截留分子量为2000Da～12000Da，较佳为2500Da-10000Da；
(3)所述超滤的操作压力为0.5～1.5MPa，较佳为0.8-1.2MPa或0.9-1MPa；
(4)所述超滤的操作温度为20～40℃；
(5)待微滤液为进料微滤液体积的1/20～1/60或1/40～1/50时，加入进料发酵液体积1/12～1/4或1-10-1/5的水进行顶洗。
在另一优选例中，所述酸性离子交换树脂选自：00或D00系列的强酸性阳离子交换树脂、11或D11系列弱酸性阳离子交换树脂。
在另一优选例中，所述碱性离子交换树脂选自：20或D20系列的强碱性阴离子交换树脂、21或D21系列的强碱性阴离子交换树脂、30或D30系列弱碱性阴离子交换树脂、31或D31系列弱碱性阴离子交换树脂。
在另一优选例中，所述的00或D00系列的强酸性阳离子交换树脂，其型号选自001X4、001X7、D001。
在另一优选例中，所述的11或D11系列弱酸性阳离子交换树脂，其型号选自112、D113。
在另一优选例中，所述的20或D20系列的强碱性阴离子交换树脂，其型号选自201X2、201X4、202、D201、D202。
在另一优选例中，所述的21或D21系列的强碱性阴离子交换树脂，其型号选自213、D213。
在另一优选例中，所述的30或D30系列弱碱性阴离子交换树脂，其型号选自D301、D306。
在另一优选例中，所述的31或D31系列弱碱性阴离子交换树脂，其型号选自313、316、D311、D315。
在另一优选例中，00或D00系列的强酸性阳离子交换树脂、20或D20系列的强碱性阴离子交换树脂、21或D21系列的强碱性阴离子交换树脂的用量为进料发酵液体积的25％～40％。
在另一优选例中，11或D11系列弱酸性阳离子交换树脂、30或D30系列弱碱性阴离子交换树脂、31或D31系列弱碱性阴离子交换树脂的用量为进料发酵液体积的45～55％。
在另一优选例中，所述反渗透具有以下一个或多个特征：
(1)所述反渗透采用的滤膜选自醋酸纤维素膜、聚酰胺膜；
(2)所述反渗透的操作压力为0.5～2.5MPa，较佳为1-2MPa；
(3)所述反渗透的操作温度为20～40℃；
(4)经反渗透离交液浓缩至原体积的1/4～1/12或1/5-1/10，得到反渗透浓缩液。
在另一优选例中，所述步骤e)，真空浓缩在40-50℃下进行，得到的真空浓缩液中β-胸苷含量达到150-300g/L或200～250g/L。
在另一优选例中，所述步骤g)包括以下步骤：
g1)将β-胸苷粗品悬浮于3～5.5倍或3.5-5倍重量的水中，加热至45-90℃或50-85℃，使固体溶解；
g2)加入活性炭，搅拌15～60分钟脱色；
g3)趁热过滤，滤液冷却至0-5℃，析晶得到β-胸苷精品。
本发明的从胸苷发酵液中分离纯化胸苷的方法，运用了膜分离技术、离子交换技术、反渗透技术和重结晶技术，工艺操作简单；工业成本低；收率高；产品质量稳定，具有良好的经济效益和市场前景，具体地：
(1)以离子交换技术代替电渗析进行脱盐处理，可以有效的脱除色素、无机盐以及杂质蛋白等，避免了再次柱层析，节约能耗、简化操作、提高收率；
(2)反渗透技术的运用使得浓缩效率大大提高，并且降低能耗；
(3)利用活性炭脱色然后重结晶的方法进一步纯化，操作简便；
(4)所得产品质量稳定，液相纯度≥99.5％，外标含量≥99.5％，总收率≥80％，比现有工艺提高10％以上。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次研发出一种新型的从胸苷发酵液中分离纯化胸苷的方法，运用了膜分离技术、离子交换技术、反渗透技术和重结晶技术，工艺操作简单；工业成本低；收率高；产品质量稳定，液相纯度≥99.5％，外标含量≥99.5％，总收率≥80％，比现有工艺提高10％以上。在此基础上，完成了本发明。
分离纯化方法
在一优选的实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：
(1)将β-胸苷发酵液用酸调节pH至3.0～4.0得到酸化液
(2)在操作压力为0.1～0.3MPa，操作温度为30～90℃的条件下，将β-胸苷酸化液通过孔径为50nm-500nm的滤膜，待发酵液为进料发酵液体积的1/3～2/3时，加入进料发酵液体积2～3倍的水进行顶洗，去除发酵液中的菌体、不溶物以及大分子蛋白等杂质得到微滤液。
(3)将微滤液降温至20-40℃，使用截留分子量为2000Da～10000Da的滤膜，在操作压力为0.5～1.0MPa下对微滤液进行超滤，待微滤液为进料微滤液体积的1/20～1/50时，加入进料发酵液体积1/10～1/5的水进行顶洗，去除大分子蛋白和色素等杂质得到超滤液；
(4)将超滤液依次通过酸性和碱性离子交换树脂，去除料液中的杂质离子得到离交液；
(5)将离交液用反渗透膜浓缩至离交液原体积的1/5～1/10得到反渗透浓缩液；
(6)40～50℃下，将反渗透浓缩液真空浓缩方式至β-胸苷含量达到200～250g/L得到真空浓缩液；
(7)将真空浓缩液降温至0-5℃，析晶得到β-胸苷粗品。
(8)将粗品在水中用活性炭脱色后重结晶得到β-胸苷精品。
该方法中的步骤(1)、(2)、(3)为预处理步骤，可分离除去发酵液中的菌体、蛋白、色素等杂质。
在另一优选例中，步骤(1)中所述的酸选自：硫酸、盐酸、磷酸；
在另一优选例中，步骤(2)中所述的滤膜为无机陶瓷膜、聚砜膜；
在另一优选例中，步骤(3)中所述的滤膜为卷式超滤膜，选自聚醚砜膜、聚丙烯腈膜、聚偏二氟乙烯膜。
步骤(4)、(5)、(6)、(7)为制备胸苷粗品步骤，可去除可溶性蛋白、杂质阴阳离子、色素和培养基等杂质，获得合格粗品。
在另一优选例中，步骤(4)所述的酸性离子交换树脂选自：00或D00系列的强酸性阳离子交换树脂、11或D11系列弱酸性阳离子交换树脂。
在另一优选例中，所述碱性离子交换树脂选自：20或D20系列的强碱性阴离子交换树脂、21或D21系列的强碱性阴离子交换树脂、30或D30系列弱碱性阴离子交换树脂、31或D31系列弱碱性阴离子交换树脂。
在另一优选例中，所述的00或D00系列的强酸性阳离子交换树脂，其型号选自001X4、001X7、D001。
在另一优选例中，所述的11或D11系列弱酸性阳离子交换树脂，其型号选自112、D113。
在另一优选例中，所述的20或D20系列的强碱性阴离子交换树脂，其型号选自201X2、201X4、202、D201、D202。
在另一优选例中，所述的21或D21系列的强碱性阴离子交换树脂，其型号选自213、D213。
在另一优选例中，所述的30或D30系列弱碱性阴离子交换树脂，其型号选自D301、D306。
在另一优选例中，所述的31或D31系列弱碱性阴离子交换树脂，其型号选自313、316、D311、D315。
在另一优选例中，所述的00或D00系列的强酸性阳离子交换树脂、20或D20系列的强碱性阴离子交换树脂、21或D21系列的强碱性阴离子交换树脂的用量为进料发酵液体积的25％～40％。
在另一优选例中，所述的11或D11系列弱酸性阳离子交换树脂、30或D30系列弱碱性阴离子交换树脂、31或D31系列弱碱性阴离子交换树脂的用量为进料发酵液体积的45～55％。
在另一优选例中，步骤(5)中所述的反渗透膜选自醋酸纤维素膜、聚酰胺膜。
步骤(8)为胸苷精制步骤，目的在于进一步去除粗品中的色素和其它杂质，提升成品的颜色、含量和纯度。
在另一优选例中，步骤(8)中所述的粗品在水中用活性炭脱色后重结晶步骤包含如下步骤：
i)将β-胸苷粗品悬浮于4～5倍的水中，加热至50-90℃，使固体溶解；
ii)加入活性炭，搅拌15～60分钟脱色；
iii)趁热过滤，滤液冷却至0-5℃，析晶得到得到β-胸苷精品。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
搅拌下，将80m3β-胸苷发酵液用98％的浓硫酸调pH至3.5。蒸汽加热至60℃，用孔径200nm的陶瓷膜进行微滤，操作压力0.15MPa，浓缩至原体积的1/2时，开始加水顶洗，顶洗水量为160m3。
获得的澄清微滤液用换热器降温至25℃，用截留分子量为5000Da的聚醚砜卷式超滤膜进行超滤分离，操作压力1.0MPa，浓缩至原体积的1/40时，加入15m3水顶洗。
超滤液以10m3/h的速度依次通过D001型强酸性阳离子交换树脂柱和D201型强碱性阴离子交换树脂柱，树脂装量均为20m3。
收集离交液，用醋酸纤维素膜进行反渗浓缩，操作压力1.5MPa，温度25℃，浓缩至原体积的1/10。
于40℃，反渗透浓缩液再用真空浓缩至β-胸苷含量220g/L，降温至0-5℃，保温4小时析晶。离心分离，得到β-胸苷粗品1077.8kg，含量95.4％。
将粗品悬浮于4900L纯化水中，加热至70℃，加入50.0kg活性炭，搅拌45分钟。趁热过滤，滤液降温至0-5℃，析出晶体，保温4小时。离心分离，得到β-胸苷精品978.9kg，颜色纯白色，液相纯度99.5％，外标含量99.5％。总收率为80.3％。
实施例2
搅拌下，将100m3β-胸苷发酵液用31％的盐酸调pH至3.0。蒸汽加热至85℃，用孔径100nm的陶瓷膜进行微滤，操作压力0.2MPa，浓缩至原体积的1/2时，开始加水顶洗，顶洗水量为200m3。
获得的澄清微滤液用换热器降温至20℃，用截留分子量为2500Da的聚丙烯腈卷式超滤膜进行超滤分离，操作压力1.0MPa，浓缩至原体积的1/40时，加入10m3水顶洗。
超滤液以10m3/h的速度依次通过001X4型强酸性阳离子交换树脂和D213型强碱性阴离子交换树脂柱，树脂装量均为30m3。
收集离交液，用醋酸纤维素膜进行反渗浓缩，操作压力1.0MPa，温度20℃，浓缩至原体积的1/8。
于50℃，反渗透浓缩液再用真空浓缩至β-胸苷含量200g/L，降温至0-5℃，保温4小时析晶。离心分离，得到β-胸苷粗品1410.5kg，含量90.5％。
将粗品悬浮于5600L纯化水中，加热至85℃，加入56.4kg活性炭，搅拌15分钟。趁热过滤，滤液降温至0-5℃，析出晶体，保温4小时。离心分离，得到β-胸苷精品1232.8kg。颜色纯白色，液相纯度99.7％，外标含量99.7％。总收率为80.9％。
实施例3
搅拌下，将50m3β-胸苷发酵液用85％的磷酸调pH至4.0。蒸汽加热至35℃，用孔径400nm的聚砜膜进行微滤，操作压力0.3MPa，浓缩至原体积的1/3时，开始加水顶洗，顶洗水量为150m3。
获得的澄清微滤液用换热器降温至30℃，用截留分子量为10000Da的聚偏二氟乙烯卷式超滤膜进行超滤分离，操作压力1.0MPa，浓缩至原体积的1/50时，加入10m3水顶洗。
超滤液以10m3/h的速度依次通过112型弱酸性阳离子交换树脂柱和313型弱碱性阴离子交换树脂柱，树脂装量均为25m3。
收集离交液，用聚酰胺膜进行反渗浓缩，操作压力2.0MPa，温度30℃，浓缩至原体积的1/5。
于45℃，反渗透浓缩液再用真空浓缩至β-胸苷含量250g/L，降温至0-5℃，保温4小时析晶。离心分离，得到β-胸苷粗品680.3kg，含量96.8％。
将粗品悬浮于3300L纯化水中，加热至50℃，加入21.1kg活性炭，搅拌60分钟。趁热过滤，滤液降温至0-5℃，析出晶体，保温4小时。离心分离，得到β-胸苷精品609.56kg，颜色纯白色，液相纯度99.8％，外标含量99.8％，总收率为80.0％。
对比例1：
搅拌下，将80m3β-胸苷发酵液用98％的浓硫酸调pH至3.5。
蒸汽加热至60℃，用孔径200nm的陶瓷膜进行微滤，操作压力0.15MPa，浓缩至原体积的1/2时，开始加水顶洗，顶洗水量为160m3。
获得的澄清微滤液用换热器降温至25℃，用截留分子量为1000Da的聚醚砜卷式超滤膜进行超滤分离，操作压力1.0MPa，浓缩至原体积的1/40时，加入15m3水顶洗。
超滤液以10m3/h的速度通过AB-8型大孔吸附树脂柱，树脂装量均为24m3。
收集离交液，经三效真空浓缩得到离交浓缩液(β-胸苷含量220g/L)，降温至0-5℃，保温4小时析晶。离心分离，得到β-胸苷粗品792.0kg，含量96.1％。
将粗品悬浮于4800L纯化水中，加热至65℃，加入50.0kg活性炭，搅拌30分钟。趁热过滤，滤液降温至0-5℃，析出晶体，保温4小时。离心分离，得到β-胸苷精品635.2kg，颜色纯白色，液相纯度99.5％，外标含量99.5％。总收率为52.1％。
对比例2
搅拌下，将100m3β-胸苷发酵液用98％的浓硫酸调pH至3.5。蒸汽加热至60℃，用孔径200nm的陶瓷膜进行微滤，操作压力0.15MPa，浓缩至原体积的1/2时，开始加水顶洗，顶洗水量为200m3。
获得的澄清微滤液用换热器降温至25℃，用截留分子量为20000Da的聚丙烯腈超滤膜进行超滤分离，操作压力1.0MPa，浓缩至原体积的1/40时，加入10m3水顶洗。
超滤液以10m3/h的速度通过AB-8型大孔吸附树脂柱，树脂装量均为25m3。
收集离交液，经三效真空浓缩得到离交浓缩液(β-胸苷含量为200g/L)，温至0-5℃，保温4小时析晶。离心分离，得到β-胸苷粗品1142.9kg，含量85.5％。
将粗品悬浮于5100L纯化水中，加热至70℃，加入65.0kg活性炭，搅拌45分钟。趁热过滤，滤液降温至0-5℃，析出晶体，保温4小时。离心分离，得到β-胸苷精品993.6kg，颜色纯白色，液相纯度90.5％，外标含量90.5％。总收率为65.2％。
在实验过程中发现与三效真空浓缩相比，反渗透浓缩有以下优势：在常温下进行，对产品质量影响小；其能耗约为三效真空浓缩的10％～20％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种从发酵液中分离纯化β-胸苷的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)将β-胸苷发酵液进行微滤处理，得到微滤液；
b)将所述微滤液进行超滤处理，得到超滤液；
c)将所述超滤液依次通过酸性和碱性离子交换树脂，得到离交液；
d)将所述离交液用反渗透膜浓缩，得到反渗透浓缩液；
e)将所述反渗透浓缩液真空浓缩，得到真空浓缩液；
f)将所述真空浓缩液降温至0-5℃，析晶得到β-胸苷粗品；
g)将所述β-胸苷粗品在水中用活性炭脱色后重结晶得到β-胸苷精品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在微滤处理前，所述方法还包括将β-胸苷发酵液的pH调节至2.5-4.5的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微滤具有以下一个或多个特征：
(1)所述微滤采用的滤膜为无机陶瓷膜或聚砜膜；
(2)所述微滤采用的滤膜的孔径为50-500nm；
(3)所述微滤的操作温度为25-100℃；
(4)所述微滤的操作压力为0.1～0.4MPa；
(5)待发酵液为进料发酵液体积的1/3～2/3时，加入进料发酵液体积1.5-5倍的水进行顶洗。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超滤具有以下一个或多个特征：
(1)所述超滤采用的滤膜为卷式超滤膜，选自聚醚砜膜、聚丙烯腈膜、聚偏二氟乙烯膜；
(2)所述超滤采用的滤膜的截留分子量为2000Da～12000Da；
(3)所述超滤的操作压力为0.5～1.5MPa；
(4)所述超滤的操作温度为20～40℃；
(5)待微滤液为进料微滤液体积的1/20～1/60时，加入进料发酵液体积1/12～1/4的水进行顶洗。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸性离子交换树脂选自：00或D00系列的强酸性阳离子交换树脂、11或D11系列弱酸性阳离子交换树脂；和/或
所述碱性离子交换树脂选自：20或D20系列的强碱性阴离子交换树脂、21或D21系列的强碱性阴离子交换树脂、30或D30系列弱碱性阴离子交换树脂、31或D31系列弱碱性阴离子交换树脂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的00或D00系列的强酸性阳离子交换树脂，其型号选自001X4、001X7、D001；
所述的11或D11系列弱酸性阳离子交换树脂，其型号选自112、D113；
所述的20或D20系列的强碱性阴离子交换树脂，其型号选自201X2、201X4、202、D201、D202；
所述的21或D21系列的强碱性阴离子交换树脂，其型号选自213、D213；
所述的30或D30系列弱碱性阴离子交换树脂，其型号选自D301、D306；或
所述的31或D31系列弱碱性阴离子交换树脂，其型号选自313、316、D311、D315。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，00或D00系列的强酸性阳离子交换树脂、20或D20系列的强碱性阴离子交换树脂、21或D21系列的强碱性阴离子交换树脂的用量为进料发酵液体积的25％～40％；和/或
11或D11系列弱酸性阳离子交换树脂、30或D30系列弱碱性阴离子交换树脂、31或D31系列弱碱性阴离子交换树脂的用量为进料发酵液体积的45～55％。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反渗透具有以下一个或多个特征：
(1)所述反渗透采用的滤膜选自醋酸纤维素膜、聚酰胺膜；
(2)所述反渗透的操作压力为0.5～2.5MPa；
(3)所述反渗透的操作温度为20～40℃；
(4)经反渗透离交液浓缩至原体积的1/4～1/12，得到反渗透浓缩液。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤e)，真空浓缩在40-50℃下进行，得到的真空浓缩液中β-胸苷含量达到150-300g/L。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤g)包括以下步骤：
g1)将β-胸苷粗品悬浮于3～5.5倍重量的水中，加热至45-90℃，使固体溶解；
g2)加入活性炭，搅拌15～60分钟脱色；
g3)趁热过滤，滤液冷却至0-5℃，析晶得到β-胸苷精品。
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