CN108384741B

CN108384741B - 一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌

Info

Publication number: CN108384741B
Application number: CN201810145987.4A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 宿玲恰; 李云菲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2038-02-12
Also published as: CN108384741A

Abstract

本发明公开了一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌，属于基因工程技术领域。本发明构建pHYα/βCGTd4、pHYα/βCGTd4‑sp1和pHYα/βCGTd4‑sp1‑βN三种Bacillus stearothermophilus来源的环糊精葡萄糖基转移酶表达质粒，并转化表达宿主枯草芽孢杆菌WSH13，得到三种表达环糊精葡萄糖基转移酶的重组工程菌B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4)、B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4‑sp1)、B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4‑sp1‑βN)，摇瓶酶活分别为7.99U/mL、11.99U/mL和12.65U/mL，3L罐酶活分别为110.4U/mL、150.3U/mL和225.9U/mL。

Description

一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌

技术领域

本发明涉及一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌，属于基因工程领域。

背景技术

维生素C是一种水溶性维生素，参与人体多项生理活动，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。然而，由于自身不稳定，易被氧化降解的性质，严重影响应用。因此VC衍生物成为研究热点，其中2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)，具有Vc正常生理功能、安全性高，并且在胞外稳定存在，成为很好的VC替代品。环糊精葡萄糖基转移酶(CyclodextrinGlycosyltransferase，简称CGTase，EC 2.4.1.19)具有环化、歧化和耦合三种转糖基反应和水解反应。CGTase利用偶联和歧化两种特异转糖基作用将淀粉、环糊精等葡萄糖基供体上的葡萄糖苷转移到Vc的C-2位上，得到产物AA-2G_n(n＝1，2，3，4，5，6，7)，再利用葡糖淀粉酶(glucoamylase)将AA-2G_n较长的糖链降解为成只连接一个葡萄糖基团的AA-2G。影响AA-2G转化效率的关键是糖基转移酶的选择，目前为止，有报道的用于AA-2G合成的糖基转移酶共有5种，分别为α-淀粉酶(α-amylase)、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphatase)、α-异麦芽糖基葡糖基糖合成酶(α-isomaltosylglucosaccharide-forming enzyme)和环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextringlycosyltransferase)。其中尤以环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的强产物特异性而使其成为目前AA-2G生物合成中使用最广泛的酶种。B.Stearothermophilis来源的α/β-环糊精葡萄糖基转移酶(α/β-CGTase)具有合成AA-2G的优良性能。本实验室已成功将α/β-CGTase在E.coli异源表达，但AA-2G作为食品、医药添加剂，需要以食品安全菌株作为宿主生产CGTase。

枯草芽孢杆菌B.subtilis是一类广泛分布革兰氏阳性杆状好养型细菌，具备无致病性，环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，而且还具有良好的发酵基础，其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力，目前广泛用于生产各种工业用酶。枯草芽孢杆菌遗传背景清晰，实验模式菌株B.subtilis 168已完成全基因组测序，并根据发酵工艺需求改造成多种突变体，例如工业上使用的菌株B.subtilis WB600和B.subtilis WB800。B.subtilisWSH13是本实验室以B.subtilisATCC 6051a为出发菌株经过定向基因组改造，实现高密度发酵的菌株，减少了发酵过程泡沫、芽孢、胞外淀粉酶和蛋白酶的产生。

为了提高CGTase在枯草枯草芽孢杆菌的异源表达，处理选择合适的表达载体和启动子外，筛选出匹配度高的信号肽也是提高表达量的有效手段。不同的信号肽对不同的异源蛋白表达量的影响不尽相同，毛婷等在枯草芽孢杆菌WB600表达系统筛选不同信号肽(est A、bpr、vpr、ync M、yvg O和ywb N)对CGTase表达量的影响，在相同的发酵条件下，estA信号肽介导的分泌效果最好。前人筛选信号肽所用的样本量较小，通过高通量平台从大样本中筛选出一个适合α/β-CGTase的信号肽就显得尤为重要。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过筛选合适的信号肽以及替换N端前的氨基酸，来提高环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的表达量。

本发明的第一个目的是提供一株枯草芽孢杆菌基因工程菌，所述基因工程菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶α/β-CGTase。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌WSH13，所述枯草芽孢杆菌WSH13是以B.subtilisATCC 6051a为出发菌株，通过敲除基因fenB和基因sfp得到。

在本发明的一种实施方式中，所述基因fenB的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，基因sfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

在本发明的一种实施方式中，用于分泌表达所述环糊精葡萄糖基转移酶α/β-CGTase的信号肽sp1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶α/β-CGTase的N前端12个氨基酸替换为氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的15个氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以pHYd4(Kang Zhang,LingqiaSu,Xuguo Duan,Lina Liu,Jing Wu.High-level extracellular protein production inBacillus subtilis using an optimized dual-promoter expressionsystem.Microbial Cell Factories.2017,16(1):32)为载体构建得到。

本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，所述方法具体是：

(1)以B.circulans环糊精葡萄糖基转移酶基因为模板扩增得N端前15个氨基酸的核苷酸序列，以B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶为模板扩增除N端前12个氨基酸的核苷酸序列，利用重叠PCR的方法，将两端序列连接，得到重组环糊精葡萄糖基转移酶基因βN-α/βcgt；

(2)以pHYd4为模板扩增载体片段，利用重叠PCR连接sp1与载体片段，得环糊精葡萄糖基转移酶表达载体pHYd4-sp1；

(3)以pHYd4为模板扩增载体片段，连接载体pHYd4-sp1与重组环糊精葡萄糖基转移酶基因βN-α/βcgt，构成表达质粒pHYα/βCGTd4-sp1-βN；

(4)然后转化B.subtilis WSH13，得到基因工程菌B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4-sp1-βN)。

本发明的第三个目的是提供基因工程菌高密度发酵的方法，所述方法是将所述枯草杆菌基因工程菌接种至发酵培养基中，控制pH6.5～7.5，培养温度32～35℃，先溶氧维持在25～35％，至溶氧迅速上升，开始流加补料液培养基，当环糊精葡萄糖基转移酶酶活下降时，结束培养。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：酵母粉15g/L，玉米浆25g/L，葡萄糖12g/L，(NH₄)₂-H-citrate 1g/L，Na₂SO₃2g/L，(NH₄)₂SO₄2.68g/L，K₂HPO₄·3H₂O 19.2g/L，NaH₂PO₄·H₂O 4g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，金属离子PTM溶液3ml/L。

在本发明的一种实施方式中，金属离子PTM溶液的组成为：CuSO₄·5H₂O 6g/L，KI0.08g/L，MnSO₄·H₂O 0.5g/L，Na₂MoO₃·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂0.5g/L，ZnCl₂20g/L，FeSO₄·7H₂O 65g/L，生物素0.2g/L，H₂SO₄5.0g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述补料液培养基为：葡萄糖500g/L，MgSO₄·7H₂O7.89g/L，(NH₄)₂HPO₄ 63.36g/L，金属离子PTM溶液40mL。

本发明的第四个目的是提供所述基因工程菌在食品、医药、化妆品中的应用。

附图说明

图1为重组菌3L发酵罐发酵产酶曲线；图中方形代表B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4)，圆形代表B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4-sp1)，三角代表B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4-sp1-βN)。

具体实施方式

环糊精葡萄糖基转移酶酶活测定方法：

将2mL 1％可溶性淀粉底物置于水浴锅内预热10min，然后加入适当稀释的环糊精葡萄糖基转移酶酶液0.1mL，反应10min后，加入0.2mL 3M HCl终止反应，然后加入0.2mL甲基橙显色液，置于16℃反应15min。在505nm下测定吸光度，计算酶活。一个酶活单位(U)定义为每分钟生成1μmolα-CD所需的酶量。

实施例1：枯草芽孢杆菌转化方法

1.感受态的制备

用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌，然后在LB平板上划线，37℃培养过夜活化。挑取单菌落接种于10mL LB液体培养基中，37℃培养过夜培养8h。取2.5mL培养物接种至40mL含有0.5M山梨醇的LB培养基，37℃200rpm振荡培养至OD600达到0.85-0.95之间。将菌液冰水浴10min，然后4℃5000rpm离心5min，收集菌体。用50mL预冷的电转培养基15-20mL重悬菌体，4℃5000rpm离心5min，去上清，如此漂洗4次。将洗涤后的菌体重悬于1mL电转培养基中，0.3mL分装至预冷灭菌的EP管。

2.枯草芽孢杆菌的电击转化

将50ng质粒加入0.3mL感受态细胞，冰上孵育2min，加入预冷的电击杯(1mm)，1800V电击一次。

电击完毕后，取出电击杯并迅速加入1mL预冷的RM培养基。37℃200rpm振荡复苏培养3h后，离心去除大部分上清，重悬细胞，涂在含有相应抗生素的筛选平板上，37℃过夜培养。

培养基配方：

(1)LB+0.5M山梨醇：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，山梨醇91g/L。

(2)电转培养基：山梨醇91g/L，甘露醇91g/L，葡萄糖100g/L。

(3)RM：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，山梨醇91g/L，甘露醇69g/L。

实施例2：筛选提高环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌表达量的信号肽

使用试剂盒B.subtilis Secretory Protein Expression System购自宝生物公司，筛选信号肽。按照说明书构建质粒pBE-S-α/βCGT及文库pBE-S-α/βCGT-L。以质粒pET-20b(+)-cgt^opt(本实验室保藏的B.stearothermophilus来源环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达质粒)为模板，使用引物P1/P2PCR扩增出环糊精葡萄糖基转移酶基因α/β-CGTase，连接到pMD-19T克隆载体上，转化JM109进行扩增。利用酶切位点EcoRI和BamHⅠ在pBE-S质粒中插入α/β-CGTase基因，然后T4连接酶连接过夜，转化JM109进行扩增，得到质粒pBE-S-α/βCGT。先使用MluI酶切质粒pBE-S-α/βCGT并胶回收纯化，再使用Eco52I酶切并胶回收得质粒pBE-S-α/βCGT片段，使用In-Fusion HD Cloning Plus kit连接酶连接质粒pBE-S-α/βCGT和SP DNAmixture，转化JM109进行扩增，转化子达2000以上，可以用于构建文库，用ddH₂O洗脱所有菌落，提质粒，得到文库质粒。按照说明书方法制作B.subtilisRIK1285感受态，并转化文库质粒。

使用高通量筛选仪器Qpix2(购自Molecular Devices公司)，将B.subtilisRIK1285转化子挑入每孔装有600μl LB培养基的96深孔板，37℃900rpm过夜培养，取50μl培养物转入每孔装有600μl TB培养基的96深孔板，37℃900rpm培养2h，再转入33℃发酵。发酵液4000rpm离心20min，取上清200μl于酶标板，使用高通量筛选平台的gridding功能，将发酵液点在含有1.0％可溶性淀粉的固体筛选板，37℃过夜静置后，碘液染色，挑选透明圈大的菌株，重复上述实验。

经过两次筛选的酶活提高的菌株，接种装有50mLTB发酵培养基的250mL的三角瓶，先37℃200rpm培养2h，在转入33℃200rpm培养48h。发酵液1200rpm离心5min，取上清使用甲基橙染色法测环化活性。酶活最高的菌株提质粒送测，确定信号肽序列sp1。分别以质粒pHYd4和筛选出的质粒为模板，用引P3/P4和P5/P6扩增出带有15bp同源序列的载体片段和信号肽片段，再用In-Fusion HD Cloning Plus kit连接酶连接，得提高环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中表达量的载体pHYd4-sp1。

表1引物

表2EcoRI和BamHⅠ双酶切体系

37℃酶切反应2h。

表3MluI酶切体系

37℃酶切反应2h。

表4Eco52I酶切体系

37℃酶切反应2h。

实施例3：环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建

以质粒pHYCGTd4(本实验室保藏的B.circulans来源环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达质粒)为模板，用引物P7/P8扩增出B.circulans环糊精葡萄糖基转移酶基N端前15个氨基酸的核苷酸序列，得片段βN；以质粒pET-20b(+)-cgt^opt(本实验室保藏的B.stearothermophilus来源环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达质粒)为模板，用引物P9/P10扩增出B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶为模板扩增除N端前12个氨基酸的核苷酸序列的片段cgt。利用重叠PCR的方法，将片段βN与cgt连接，得到重组环糊精葡萄糖基转移酶基因βN-α/βcgt。以载体pHYd4-sp1和βN-α/βcgt为模板，用引物P11/P12和P7/P10扩增出带有15bp同源序列的载体片段和基因片段，再用In-Fusion HD CloningPlus kit连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养8h，挑转化子在含有100mg/L氨苄青霉素液体的LB中振荡培养，提取质粒，测序验证得到表达质粒pHYα/βCGTd4-sp1-βN。同理，以质粒pET-20b(+)-cgt^opt为模板，用引物P13/P10扩增出B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶基因sp1-α/βcgt，连接载体pHYd4-sp1和基因sp1-α/βcgt，构建表达质粒pHYα/βCGTd4-sp1。以载体pHYd4为模板，用引物P11/P14扩增出载体片段pHYd4，以质粒pET-20b(+)-cgt^opt为模板，用引物P15/P10扩增出B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶基因α/βcgt，连接载体pHYd4和基因α/βcgt得表达质粒pHYα/βCGTd4。

表5PCR反应体系为：

反应程序如下：94℃预变性4min；98℃10s，55℃10s,72℃1.5min，进行30个循环；72℃延伸10min，降温至4℃。

表6引物序列

采用实施例1中的方法，将质粒pHYα/βCGTd4、pHYα/βCGTd4-sp1、pHYα/βCGTd4-sp1-βN分别转化B.subtilis WSH13，涂布含四环素(20mg/L)的LB平板上，37℃培养8h。挑单菌落至液体LB中，37℃培养过夜，保存甘油管，最终得到重组环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4)、B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4-sp1)、B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4-sp1-βN)。

实施例4：环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌摇瓶酶活

对上述实施例3中构建好的三种环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌进行摇瓶培养，检验环糊精葡萄糖基转移酶表达情况，培养过程如下：吸取10μl的甘油管菌液接种于装有10mL LB培养基的50mL三角瓶中，37℃，200rpm培养8-10h。将上述培养以5％(v/v)的接种量接入装有50mLTB的250mL三角瓶中发酵罐，37℃，200rpm培养2h。然后33℃，200rpm培养48h。测定胞外葡萄糖基转移酶酶活。得出B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4)酶活为7.99U/mL，B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4-sp1)酶活为11.99U/mL，B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4-sp1-βN)酶活为12.65U/mL。

培养基配方：

(1)LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。

(2)TB培养基：酵母粉24g/L，蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K₂HPO₄12.54g/L，KH₂PO₄2.31g/L。

实施例5：环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌3-L罐发酵

对上述实施例3中重组环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4)、B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4-sp1)、B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4-sp1-βN)进行3-L发酵培养，检验环糊精葡萄糖基转移酶的表达情况。培养过程如下：吸取200μl的甘油管菌液接种于装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，37℃，200rpm培养8-10h，将上述培养液接入装液量为0.9L的3L发酵罐，以氨水和20％磷酸控制pH 7.0，培养温度33℃，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在30％左右，当溶氧迅速上升，开始流加浓度为500g/L的葡萄糖补料液，当环糊精葡萄糖基转移酶酶活下降时结束培养。

培养基配方：

(1)LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。

(2)发酵培养基：酵母粉15g/L，玉米浆25g/L，葡萄糖12g/L，(NH₄)₂-H-citrate 1g/L，Na₂SO₃2g/L，(NH₄)₂SO₄2.68g/L，K₂HPO₄·3H₂O 19.2g/L，NaH₂PO₄·H₂O 4g/L，MgSO₄·7H₂O1g/L，金属离子PTM溶液3ml/L。

补料液培养基：葡萄糖500g/L，MgSO₄·7H₂O 7.89g/L，(NH₄)₂HPO₄63.36g/L，金属离子PTM溶液40ml。

金属离子PTM溶液的组成：CuSO₄·5H₂O 6g/L，KI 0.08g/L，MnSO₄·H₂O 0.5g/L，Na₂MoO₃·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂0.5g/L，ZnCl₂20g/L，FeSO₄·7H₂O 65g/L，生物素0.2g/L，H₂SO₄5.0g/L。

B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4-sp1-βN)发酵培养96h，环糊精葡萄糖基转移酶酶活最优为255.9U/mL。B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4-sp1)发酵培养90h，环糊精葡萄糖基转移酶酶活为150.3U/mL，B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4)发酵培养96h，环糊精葡萄糖基转移酶酶活为110.4U/mL。各菌株发酵最高酶活点SDS-PAGE图如图1所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 680

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln

1 5 10 15

Ile Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser

20 25 30

Gly Ala Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly

35 40 45

Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr

50 55 60

Asp Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val

65 70 75 80

Phe Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr

85 90 95

Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser

100 105 110

Asp Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val

115 120 125

Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn

130 135 140

Pro Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu

145 150 155 160

Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr Phe His His Asn Gly Gly

165 170 175

Thr Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp

180 185 190

Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu Lys

195 200 205

Asp Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met

210 215 220

Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met Asp

225 230 235 240

Glu Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu

245 250 255

Ser Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser

260 265 270

Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val

275 280 285

Leu Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln

290 295 300

Asp Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile

305 310 315 320

Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg

325 330 335

Lys Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro

340 345 350

Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro

355 360 365

Asn Asn Arg Lys Met Met Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr

370 375 380

Gln Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu

385 390 395 400

Ala Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val

405 410 415

Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Val Asn Arg

420 425 430

Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro

435 440 445

Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Leu Asp Gly Asn Thr

450 455 460

Ile Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly Pro

465 470 475 480

Gly Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ile

485 490 495

Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val Thr

500 505 510

Ile Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe Gly

515 520 525

Thr Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val

530 535 540

Ala Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser

545 550 555 560

Ser Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr

565 570 575

Asn Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn

580 585 590

Leu Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn

595 600 605

Trp Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr

610 615 620

Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr

625 630 635 640

Ile Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp

645 650 655

Glu Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly

660 665 670

Lys Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn

675 680

<210> 2

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Lys Lys Lys Thr Trp Lys Arg Phe Leu His Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Gly Leu Ile Phe Thr Ser Ala Ala Pro Ala Glu Ala

20 25 30

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Pro Asp Thr Ser Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp

1 5 10 15

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catatgatgg cgggcaacct gaacaaagtg a 31

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggatccttag ttctgccagt caacgataat t 31

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagcttggta ataaaaaaac acctc 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcttgacact ccttatttga ttt 23

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

taaggagtgt caagaatgaa aaagaaaaaa acatgg 36

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttgttcaggt tgcccgccat tgcctctgcg ggagcagca 39

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gctcccgcag aggcagcacc ggataccagc gttagc 36

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tctgataaac aacgtccgtg ctgaaattct gcttgtt 37

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cagaatttca gcacggacgt tgtttatcag atcgttgt 38

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tttattacca agcttttagt tctgccagtc aacgataatt 40

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aagcttggta ataaaaaaac acctc 25

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgcctctgcg ggagcagcag aag 23

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgctgctccc gcagaggcaa tggcgggcaa cctgaacaa 39

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catggcttca gcactcgcag ccgcc 25

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

agtgctgaag ccatggcggg caacctgaac aaagtgaac 39

<210> 19

<211> 3837

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atgaagaaag gtgcagacac tatgaatacc attaaaaaaa tcaagaacat ttatcctctg 60

agtcatatgc aggaagggat gctgtttcat tccttcctcc gtaaagagga gggggcgtat 120

gttgagcagt cgctcttcac cattaaagga agcctcagct atgactggtt ccagcgcagc 180

attcaagcca ttatcgaccg ccatgatatt ttcagaaccg tgtttttgcc gcacgtcccg 240

catttgtcgg gacctcggca agtcgtgatg acagaacgtg aattccattt gaacagcgaa 300

gacatttctc atctgccgac aaacgaccag aatgagtata ttgaacgctt taaagagaag 360

gacaagcaaa aaggctttga tctgcaaaaa gacatgctga tgcggatttc tctattcaaa 420

acagctaaag atgagcatgt ctgtatctgg agtcaccatc acattttaat ggacggatgg 480

tgcctaggta tcgttatgca ggaatttatg caaatttatc aatcgattca tgcaggaaaa 540

ccgctttcat tagaccctgt ccgtccgtac agcacctata tttcatggct gacaaaccga 600

gacaaagaaa aagcagcggc ctactgggat acctatttaa aaaactacag cgctccatca 660

cctctgcctc gtgtgtctga taaagaaaca aaagaaagtt atcaccgtga agatttgata 720

ttttcattaa ataaaccact gacagacaag ctgaaagaga ctgccaaaca acacggcgtc 780

acgctcgcta cccttattca ggcagtctgg ggtgtgatgc tgcagcaata taaccgcaca 840

gacgacgttg tgtttggcgc agttgtatca ggaagaccgt cagaaatccc aggcgtggag 900

caaatgatag ggttgtttat caataccata ccgattcgaa ttaaaacaca ccaagacgaa 960

acgtttcacg agctgctcat acgctgccag aaagaaatgc tggaagctga gccgtttacc 1020

tgccagcctt tatttgatat tcaggcaaac accgcattaa aacaggaact gattgatcac 1080

attatcgtct ttgaaaacta tccgttacag cagaaaatcg ccgattccgc tgatcaaacc 1140

gattcaccgc tgcaaatcga tcaagttcaa gtatccgagc aatcaggata taactttaat 1200

cttgtcgttg ctcctggcga agagcttgtc atcaagttca gctataatgc attcgtttac 1260

gatgctgcct ggatcagctg tatcaagagg caatttacgc aagcgcttag cacagctgca 1320

cagcaccctc atatgccaat tgctgatttt tcttttcttg atgcaacaga aaaagagcag 1380

attgtcacac agttcaacaa tacaaaaacg gagtatccaa agaatcatac aattatcgat 1440

ttatttcgcg aacaagcaga aaagacgcca gaccataccg cacttgtgta tggcaatatg 1500

tctatttcgt ataaagagct tgataaacgc tctaatgcgc tcgccagaga gttaattcaa 1560

aagggatttc ggaaaaacga gacagccgga atattggctg cacattctcc cgaattcatg 1620

atcagtgtgc ttgccgtatt aaaagcaggg ggagcatacc tcccgcttga tgcggagctt 1680

ccgcctgaac gagtcagctt tatgcttgag gaaacgcagg caaaaatgct gattgttcaa 1740

aagggattgg agcaaaacgc tgcgttctca ggaacatgta tcatttcaga tgcgcaggga 1800

ttgatggaag agaacgatat ccctattaat atcagctcca gcccggatga tcttgcgtac 1860

atcatgtata cctcaggatc aacaggccgg ccgaaagggg tcatgatcac gaatcgcaat 1920

gtcgtgtccc ttgtcagaaa cagcaattac acgtctgcgt ccggtgatga ccggtttatt 1980

atgactggat ctatcagctt tgacgccgtc acctttgaaa tgttcggggc acttttaaat 2040

ggcgcaagcc ttcatatcat tgataaatcg acaatgctga cacctgatcg gtttggagcg 2100

tatttgcttg aaaatgacat tacagtgcta tttttaacga cagctctttt taatcagctg 2160

gcacaggtac gagctgacat gtttcgcgga ctccatacgt tatatgtcgg aggagaagca 2220

ctctctcctg ccctgatgaa tgccgtcaga cacgcctgtc cagatctcgc gcttcataat 2280

atttacgggc caacggaaaa cacgactttt tcaacctttt ttgaaatgaa gagagactat 2340

gcggggccga ttccgattgg aaaaccaatc agtaatagca ccgcttacat cttagataca 2400

aaaggacgtc ttttgccaat aggcgttccc ggcgagcttt gtgttggcgg tgatggagtc 2460

gctaaaggct atttgaacag agtagatctg acaaatgctg tgttttctcc tcatcctttc 2520

ttgcctggag aaagaatata ccgtactggt gatttggcgc gctggctgcc tgatggaaac 2580

ttagaataca tcagcagaat tgacaggcaa atgaaaatcc gcggaaaacg aattgagcct 2640

gccgaaatag aagcgcgcct gttagaaatg gaaggcgttc aagaagcagc agtgacattg 2700

agagaaaaag atggagaggc gcagctgtac actcattacg tcggtgatca caaaaaaaca 2760

gatacggatt ttcgcgccga tttggcgcgt gtgcttccag actatatgat cccgcagcac 2820

tgggtgcgtg tggagcggat gccgcttacc ggaaacggaa aaatagaccg cagcgcgctg 2880

cctattccag aaaataagcc tgccaaacga cagaacatca tattgccaag aaacttggtt 2940

gaagaagaat tggcgaacat ttggaagcaa gtcctcggtg ttaacacaat cagtattgat 3000

gatgacttct ttgctattgg cggacattca ctaagagcac tgcaagtcat acatacacta 3060

aaacatcagc agaacattga cataccgatt gatttcttgt tcgaacatcc gacaatcgct 3120

cagcttgccg aaaaacttta ttctaaacag ctgacagcag caaatgaaca gcatgtgatc 3180

aaactgaacc agcacggcgc gcaaaatctt ttctgcttcc cgccgatatc gggatttggc 3240

atttatttta aagaccttgc tttattgctg aatgagaagg cagccgtata cgggtttcac 3300

tttattgaac aagacacccg cattgaacaa tatgttaatt gcatgacgga catacagcct 3360

gagggcccat acgttttatt aggctactct gcaggcggaa acctggcttt tgaagtggca 3420

caggctatgg agcgcaaagg attagaagtc agcgacttca ttatcgtgga cgcttatcta 3480

aaagaacagc ctttgcctat cgataccggt aatgacgaat ctgcagcata tctgcctgaa 3540

gcagtcagag aaaaggtgat gaagaaaaaa agaaactatc aggaatattg ggcacaattg 3600

ctgaatgaag gccacatcaa agcaagcatt catttcatcg aagctggaat ccaccccgaa 3660

accagcgggc atacaggctt aacgaaatgg gaaggcgcct gcggaaacta tagtgagtac 3720

acgggttttg gcgctcataa agacatgctg gaaggaacat atgctgaaaa gaatgccgac 3780

atcatcctcg acattttaga aaagatcact tcaaatcaag taatactgca caaacga 3837

<210> 20

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atgaagattt acggaattta tatggaccgc ccgctttcac aggaagaaaa tgaacggttc 60

atgtctttca tatcacctga aaaacgggag aaatgccgga gattttatca taaagaagat 120

gctcaccgca ccctgctggg agatgtgctc gttcgctcag tcataagcag gcagtatcag 180

ttggacaaat ccgatatccg ctttagcacg caggaatacg ggaagccgtg catccctgat 240

cttcccgacg ctcatttcaa catttctcac tccggacgct gggtcatttg cgcgtttgat 300

tcacagccga tcggcataga tatcgaaaaa acgaaaccga tcagccttga gatcgccaag 360

cgcttctttt caaaaacaga gtacagcgac cttttagcaa aagacaagga cgagcagaca 420

gactattttt atcatctatg gtcaatgaaa gaaagcttta tcaaacagga aggcaaaggc 480

ttatcgcttc cgcttgattc cttttcagtg cgcctgcacc aggacggaca agtatccatt 540

gagcttccgg acagccattc cccatgctat atcaaaacgt atgaggtcga tcccggctac 600

aaaatggctg tatgcgccgt acaccctgat ttccccgagg atatcacaat ggtctcgtac 660

gaagagcttt tataa 675

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶α/β-CGTase；所述基因工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSH13，所述枯草芽孢杆菌WSH13是以B.subtilis ATCC6051a为出发菌株，通过敲除核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的侧柏素合成酶ppsE基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的4'-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶sfp基因得到；用于分泌表达所述环糊精葡萄糖基转移酶α/β-CGTase的信号肽sp1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述环糊精葡萄糖基转移酶α/β-CGTase的N前端12个氨基酸替换为氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的15个氨基酸。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以pHYd4为载体构建得到。

3.权利要求1或2所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法具体是：

(3)以pHYd4-sp1为模板扩增载体片段，连接载体pHYd4-sp1与重组环糊精葡萄糖基转移酶基因βN-α/βcgt，构成表达质粒pHYα/βCGTd4-sp1-βN；

(4)然后转化B.subtilis WSH13，得到基因工程菌。

4.权利要求1或2所述基因工程菌高密度发酵的方法，其特征在于，所述方法是将所述枯草芽孢杆菌基因工程菌接种至发酵培养基中，控制pH6.5～7.5，培养温度32～35℃，先溶氧维持在25～35％，至溶氧迅速上升，开始流加补料液培养基，当环糊精葡萄糖基转移酶酶活下降时，结束培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：酵母粉10～20g/L，玉米浆20～30g/L，葡萄糖10～15g/L，(NH₄)₂-H-citrate 0.5～1.5g/L，Na₂SO₃ 1.5～2.5g/L，(NH₄)₂SO₄2～3g/L，K₂HPO₄·3H₂O 18～20g/L，NaH₂PO₄·H₂O 3～5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.5g/L，金属离子PTM溶液2～4ml/L；所述金属离子PTM溶液的组成为：CuSO₄·5H₂O 5～7g/L，KI 0.05～0.1g/L，MnSO₄·H₂O 0.4～0.6g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.1～0.3g/L，H₃BO₃ 0.01～0.03g/L，CoCl₂ 0.4～0.6g/L，ZnCl₂ 15～25g/L，FeSO₄·7H₂O 60～70g/L，生物素0.1～0.3g/L，H₂SO₄ 4～6g/L。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述补料液培养基为：葡萄糖400～600g/L，MgSO₄·7H₂O 7～8g/L，(NH₄)₂HPO₄ 60～65g/L，金属离子PTM溶液30～50mL；所述金属离子PTM溶液的组成为：CuSO₄·5H₂O 5～7g/L，KI 0.05～0.1g/L，MnSO₄·H₂O 0.4～0.6g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.1～0.3g/L，H₃BO₃ 0.01～0.03g/L，CoCl₂ 0.4～0.6g/L，ZnCl₂ 15～25g/L，FeSO₄·7H₂O 60～70g/L，生物素0.1～0.3g/L，H₂SO₄ 4～6g/L。

7.权利要求1或2所述基因工程菌在食品、医药、化妆品中的应用。