CN104232602B - 一种降低环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降低环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用定点突变方法削弱了环糊精产物对酶活力的抑制，提高CGT酶的产环糊精能力，提供了增强来源于Bacillus circulans STB01的β‑CGT酶产环糊精能力的突变方案，获得突变体酶制品。相比于野生CGT酶，突变体酶制品产环糊精的能力明显增强，更适合环糊精的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种降低环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
环糊精是由D-吡喃葡萄糖通过α-1,4-糖苷键连接而成的环状化合物，其中以6、7和8个葡萄糖单元所构成的α-、β-和γ-环糊精最为常见。由于其呈中空圆筒状结构，具有外部亲水、内部疏水的特性，环糊精能与许多疏水客体分子形成包合物，从而改变客体分子的理化性质，因此，在食品、医药等工业领域中有着广泛的应用。
环糊精的工业化生产均采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)催化作用下通过环化反应转化淀粉所合成。由于CGT酶作用淀粉过程中，所产生的环糊精会与CGT酶结合，导致环糊精的生成速率下降，出现产物抑制现象。当酶反应体系中环糊精达到一定浓度后，由于产物抑制，环糊精产量基本不再增加，造成淀粉转化率相对偏低，环糊精生产成本居高不下，环糊精在工业中的应用受到限制。
本发明中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的β-CGT酶，在酶反应过程中产物抑制比较明显，因此，降低该酶的产物抑制，将有利于提高环糊精得率。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生CGT酶的第598～636位的氨基酸TALGQNVYLTGSVSELGNWDPAKAIGPMYNQVVYQYPNW替换成TNYGTNVYLVGNAAELGTWDPNKAIGPMYNQVIAKYPSW。
编码所述野生CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述突变体的方法。根据SEQ IDNO.1所示的基因序列，设计合成新基因片段，通过基因重组的方法将此新基因片段替换表达载体cgt/pST中编码野生CGT酶第598～636位氨基酸的基因片段，获得编码突变体的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。
所述方法包括以下步骤：
(1)突变体的构建
设计合成新基因片段，通过基因重组的方法将此新基因片段替换表达载体cgt/pST中编码野生CGT酶第598～636位氨基酸的基因片段，构建含编码CGT酶突变体基因的表达载体cgt/pST。
新基因片段：
5’-ACCAATTACGGAACAAATGTTTATCTTGTCGGCAACGCCGCCGAGCTCGGCACCTGGGACCCGAACAAAGCGATTGGGCCGATGTACAATCAGGTGATCGCCAAGTACCCGTCCTGG-3’
编码野生CGT酶第598～636位氨基酸的基因片段(第1792～1908的基因片段)：
5’-ACGGCCCTTGGGCAAAATGTGTACCTGACGGGCAGTGTCAGCGAGCTGGGGAACTGGGACCCGGCAAAAGCAATCGGGCCGATGTACAATCAGGTCGTTTACCAATATCCGAACTGG-3’
将含编码CGT酶突变体基因的表达载体cgt/pST转入大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证，然后将质粒转入表达宿主B.subtilisWB600感受态细胞中。上述各培养基中均添加5μg/mL硫酸卡那霉素和10μg/mL赤霉素。
(2)突变体的表达与纯化
挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵24～48h。各培养基中添加5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素。将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，纯化得到CGT酶突变体酶制品。
本发明的有益效果：构建了1个有意义的突变体，其三种环化活力所对应的非竞争性抑制常数均增加了2-4倍，说明非竞争性产物抑制明显减弱，而且，竞争性产物抑制也有一定程度减弱，实现了重组CGT酶产物抑制的降低，比野生型CGT酶更利于环糊精的工业化生产。
具体实施方式
实施例1突变位点的确定
CGT酶中存在3个麦芽糖基结合位点(简称MBS)，分别称为MBS1、MBS2和MBS3。CGT酶作用淀粉生成环糊精过程中，环糊精产物会与CGT酶中MBS2结合，阻碍淀粉分子进入催化活性中心，产生明显的产物抑制现象，导致环糊精得率偏低。来源于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)STB01的CGT酶的MBS2，是由第598～636位的39个氨基酸残基组成。因此，若改变MBS2区域的的空间结构，可能能够降低CGT酶的产物抑制，提高环糊精得率。
实施例2CGT酶突变体的制备
(1)突变体的构建
设计合成新基因片段，并添加酶切位点5’BsaI和5’UTR，使用基因重组的方法通过酶切位点5’Bsa I和3’BsrG I将此新基因片段替换表达载体cgt/pST中编码野生CGT酶第598～636位氨基酸的基因片段，构建含编码CGT酶突变体基因的表达载体cgt/pST。
新基因片段：
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替换编码野生CGT酶第598～636位氨基酸的基因片段(第1792～1908的基因片段)：
5’-ACGGCCCTTGGGCAAAATGTGTACCTGACGGGCAGTGTCAGCGAGCTGGGGAACTGGGACCCGGCAAAAGCAATCGGGCCGATGTACAATCAGGTCGTTTACCAATATCCGAACTGG-3’
将含编码CGT酶突变体基因的表达载体cgt/pST转入大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证，然后将质粒转入表达宿主B.subtilisWB600感受态细胞中。上述各培养基中均添加5μg/mL硫酸卡那霉素和10μg/mL赤霉素。
(2)突变体的表达和纯化
挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵24～48h。各培养基中添加5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素。将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，纯化得到CGT酶突变体酶制品。
实施例3酶活测定分析
(1)酶活力的测定
α-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入1.0mL 1.0N的盐酸停止反应，再加入1.0mL用10mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙溶液20℃下保温15min，在505nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白，对应α-环糊精标准曲线的测定出α-环糊精的含量。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol的环糊精所需的酶量。
β-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入3.5mL 30mM NaOH和0.5mL由5mM Na2CO3溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液反应，在室温下保温15min，在550nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol β-环糊精所需的酶量。
γ-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入50μL 1.0N的盐酸停止反应，再加入2mL 0.2M柠檬酸缓冲液(pH4.2)和100μL 5mM溴甲酚绿溶液，在室温下保温15min，在615nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol γ-环糊精所需的酶量。
(2)酶产物抑制比较
CGT酶产物抑制的测定：控制反应温度、pH、酶添加量不变，以麦芽糊精(DE＝5)溶液作为反应底物，选择反应底物浓度范围为0.05～1％(干基)，测定不同底物浓度下反应30min后α-、β-或γ-环糊精的的含量，得到以环糊精含量为指标的初始反应速率，作米氏方程双倒数图；其他条件不变，在酶反应体系中添加1或2mg/mL的β-环糊精，测定不同底物浓度下反应30min后α-、β-或γ-环糊精的的含量，得到以环糊精含量为指标的初始反应速率，作米氏方程双倒数图。
实验结果列于表1，结果发现，β-环糊精对野生CGT酶及其突变体的三种环化活力抑制类型为线性混合型抑制，方程式如下：
其中Ki为竞争性抑制常数，Ki’为非竞争性抑制常数，v为酶反应速率，Vmax为酶最大反应速率，Km为米氏常数，[S]为底物浓度，[I]为抑制剂浓度。
从表1中可以看出，CGT酶突变体三种环化活力所对应的非竞争性抑制常数Ki’均增加了2-4倍，说明其非竞争性产物抑制明显减弱，而三种环化活力所对应的竞争性抑制常数Ki均有一定程度的增加，说明其竞争性产物抑制也有一定程度减弱。
表1
实施例4利用HPLC分析环糊精生成量
以配制5％(干基，w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液作为底物，5g麦芽糊精溶解在90mL磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，定容至100mL，在沸水中煮沸30min。分别加入一定量的野生CGT酶、突变体使反应体系中总环化活力为0.1U/mL，置于45℃下反应24h，煮沸灭酶10min，12000rpm离心10min，取上清500μL，加5μL糖化酶(70U/mL)，在30℃糖化1h，10min煮沸灭活，12000rpm离心30min，取上清经0.45μm超滤膜过滤后取20μL上HPLC分析。
HPLC测定条件为：Waters600高效液相色谱仪(配示差折光检测器)，色谱柱Lichrosorb NH2(4.6mm×150mm)，流动相采用68％的乙腈水溶液，柱温为30℃，流速为1mL/min。
实验结果如表2所示，当以5％麦芽糊精溶液为底物时，相比于野生CGT酶，突变体具有更好能将淀粉转化为环糊精的能力。经过24h的酶反应后，与野生型相比，环糊精总得率提高了19.8％，其中α-环糊精得率提高了125.2％，β-环糊精得率提高了15.6％。综合以上数据可以看出，这种突变体更适于环糊精的工业化生产。
表2
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因。
3.含有权利要求2所述基因的载体或细胞。
4.一种获得权利要求1所述一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的方法，其特征在于，通过基因重组的方法对编码野生环糊精葡萄糖基转移酶的基因进行突变，将突变后的基因进行表达得到突变体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，设计合成SEQ ID NO.4所示的基因片段，通过基因重组的方法将此新基因片段替换编码野生环糊精葡萄糖基转移酶第598～636位氨基酸的基因片段，获得编码突变体的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，挑取含突变基因的表达宿主枯草芽孢杆菌WB600的单克隆于含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以体积比4％的接种量接种到含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵24～48h；将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，得到环糊精葡萄糖基转移酶突变体。
7.一种减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第598～636位的氨基酸替换成TNYGTNVYLVGNAAELGTWDPNKAIGPMYNQVIAKYPSW。
8.权利要求1所述一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体在环糊精生产中的应用。
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| CN201410467084.XA CN104232602B (zh) | 2014-09-12 | 一种降低环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108384741A (zh) * | 2018-02-12 | 2018-08-10 | 江南大学 | 一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌 |
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