CN107446874B - 重组大肠杆菌及其在合成莱鲍迪苷d中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组大肠杆菌及其在合成莱鲍迪苷D中的用途，属于生物工程技术领域。本发明解决的是提供重组大肠杆菌及其在合成莱鲍迪苷D中的用途。该重组大肠杆菌为带有eugt11基因序列的转化子。本发明利用生物学方法，实现了重组大肠杆菌的构建，将eugt11基因引入大肠杆菌中诱导表达，得到重组蛋白酶，可用于催化RA转化成RD，为RD的生产提供了一条新途径。此外，本发明还采用重组大肠杆菌全细胞高效催化合成RD，为RD及更多天然化合物通过大肠杆菌全细胞转化法大规模生产奠定了基础。

Description

重组大肠杆菌及其在合成莱鲍迪苷D中的用途
技术领域
本发明涉及重组大肠杆菌及其在合成莱鲍迪苷D中的用途，属于生物工程技术领域。
背景技术
目前全世界的糖尿病患者大约占18岁以上总人口的9％，肥胖病患者更是超过了20亿。这些人群需要在饮食中严格控制糖类摄入，然而目前市场上大部分的无热量代糖都有健康隐患并不适合长期使用，因此市场需要新型安全代糖甜味剂。甜菊糖(steviolglycosides)是从甜叶菊(Stevia rehaudiana)叶片中提取分离得到的一类甜菊糖苷类化合物，因其甜度高、热量低、无毒性、耐高温、耐酸碱和水溶性好等优点，受到了科学界、产业界等多个领域的广泛重视，已被公认为新一代甜味剂。甜菊糖苷类化合物组分众多，均具有四环二萜母核并且有不同程度的糖基化修饰从不同程度的甜味口感。目前，甜菊糖苷类化合物中的含量相对丰富的甜菊苷(Stevioside.ST)、莱鲍迪苷A(RA)等已广泛应用于饮料、食品、调味剂、酒类、乳制品等食品加工领域。
虽然ST和RA具有高甜度，但是口感上还存在除甜味之外的苦后味。相比之下，莱鲍迪苷D(RD)具有更好的口感特性，是甜菊糖苷类甜味剂开发的新方向。以下为RA(Rebaudioside A)和RD(Rebaudioside D)的化学结构式：
Figure GDA0002448415480000011
然而，甜叶菊中RD这样高品质的珍稀组分含量极低，仅约占干叶重0.5％。用传统分离方法难以得到高纯度产品且产量也无法满足市场需要。
发明内容
针对以上问题，本发明的发明人发现来自水稻的糖基水解酶EUGT11在UDPG存在条件下，具有催化RA生成RD的活性。通过构建重组大肠杆菌，实现了RA催化合成RD，为RD的生产提供一种新方法。
本发明解决的第一个技术问题是提供一种重组大肠杆菌。
本发明重组大肠杆菌，为带有eugt11基因序列的转化子。
eugt11基因序列为现有的(Accession No.AK121682)，在GenBank数据库中可以查到。
进一步的，该重组大肠杆菌优选采用如下方法制备得到：采用如下方法制备得到：将源于水稻的eugt11基因与载体pETDuet-1连接构建重组质粒，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌。
本发明解决的第二个技术问题是提供本发明所述的重组大肠杆菌在催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D中的用途。
本发明的重组大肠杆菌，可作为全细胞催化反应的催化剂，用于催化RA转化成RD。
本发明解决的第三个技术问题是提供糖基水解酶在催化RA转化成RD中的用途，其中，所述糖基水解酶为eugt11基因编码得到的蛋白。
优选的，所述糖基水解酶为本发明所述的重组大肠杆菌经过诱导表达的产物。
本发明解决的第四个技术问题是提供RD的合成方法。
本发明RD的合成方法，采用本发明所述的糖基水解酶为催化剂，催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D；所述糖基水解酶为eugt11基因编码得到的蛋白。
优选的，催化反应体系为：pH＝6.4～8.0、1～15mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖、0.1～2mmol/L MgCl2、0.1～0.5mg/mL糖基水解酶、0.5～2mmol/L莱鲍迪苷A；20～50℃反应0.3～3h后加入5％HC1终止反应。
作为优选方案，该催化反应体系为：pH＝8.0、5mmol/L UDPG、1mmol/L MgCl2、0.25mg/mL糖基水解酶、1mmol/L RA；30℃反应0.5h后加入5％HC1终止反应。
本发明解决的第五个技术问题是提供全细胞催化合成RD的方法。
本发明全细胞催化合成RD的方法，采用本发明所述的重组大肠杆菌为全细胞催化剂，将莱鲍迪苷A催化转化成莱鲍迪苷D。
优选的，催化反应体系为：pH＝6.4～8.0、UDPG浓度为5～15mmol/L、菌体密度为0.2～0.64g/mL、RA浓度为0.5～2mmol/L、柠檬酸钠浓度为0～80mmol/L、二甲苯体积浓度为0～2％、反应温度为20～50℃、反应时间为1～3d。
作为优选方案，催化反应体系为：pH＝8.0、尿苷二磷酸葡萄糖浓度为12mmol/L、菌体密度为0.16g/mL、莱鲍迪苷A浓度为1mmol/L、柠檬酸钠浓度为60mmol/L、二甲苯体积浓度为1％、反应温度为42℃，反应时间为1d。
进一步优选的，本发明的全细胞催化体系中还可以加入ZnCl2。
优选的，ZnCl2的浓度为0.1mmol/L。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用生物学方法，实现了重组大肠杆菌的构建，将eugt11基因引入大肠杆菌中诱导表达，得到重组蛋白酶，可用于催化RA转化成RD，为RD的生产提供了一条新途径。
本发明还采用重组大肠杆菌全细胞高效催化合成RD，为RD及更多天然化合物通过大肠杆菌全细胞转化法大规模生产奠定了基础。
附图说明
图1为实施例1中PCR扩增产物的电泳图谱。
图2为实施例1中载体质粒(pETDuet-l)和重组质粒(pETDuet-eugt11)经BamH I/Hind III双酶切后的电泳图谱。
图3为实施例2中蛋白的SDS-PAGE图谱。图中，M：标记；1：E.coli BL21(pETDuet-l)中的总蛋白；2：E.coli BL21(pETDuet-l)上清中的蛋白；3：E.coli BL21(pETDuet-eugt11)中的总蛋白；4：E.coli BL21(pETDuet-eugt11)上清中的蛋白；5：纯化后的重组蛋白6His-EUGT11。
图4为实施例3中各样品的HPLC图谱。图中，(1)：重组蛋白酶6His-EUGT11催化反应后的滤出液；(2)：空白对照的滤出液；(3)：RD标准品；(4)：RA标准品。
图5为实施例5中pH值对全细胞催化反应的影响。
图6为实施例6中温度对全细胞催化反应的影响。
图7为实施例7中柠檬酸钠浓度对全细胞催化反应的影响。
图8为实施例8中菌体密度对全细胞催化反应的影响。
图9为实施例9中不同二价离子对全细胞催化反应的影响。
图10为实施例10中二甲苯浓度对全细胞催化反应的影响。
图11为实施例11中UDPG浓度对全细胞催化反应的影响。
具体实施方式
本发明重组大肠杆菌，为带有eugt11基因序列的转化子。
eugt11基因序列为现有的(Accession No.AK121682)，在GenBank数据库中可以查到。
进一步的，该重组大肠杆菌采用如下方法制备得到：将源于水稻的eugt11基因与载体pETDuet-1连接构建重组质粒(该重组质粒记为pETDuet-eugt11)，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌，记为E.coli BL21(pETDuet-eugt11)。
本发明解决的第二个技术问题是提供本发明所述的重组大肠杆菌在催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D中的用途。
本发明的重组大肠杆菌，可作为全细胞催化反应的催化剂，用于催化RA转化成RD。
本发明解决的第三个技术问题是提供糖基水解酶在催化RA转化成RD中的用途，其中，所述糖基水解酶为eugt11基因编码得到的蛋白。
优选的，所述糖基水解酶为本发明所述的重组大肠杆菌经过诱导表达的产物。该产物可以通过常规的方法进行纯化，得到重组蛋白酶，记为6His-EUGT11。
本发明解决的第四个技术问题是提供RD的合成方法。
本发明RD的合成方法，采用本发明所述的糖基水解酶为催化剂，催化RA转化成RD；所述糖基水解酶为eugt11基因编码得到的蛋白。
优选的，催化反应体系为pH＝6.4～8.0、1～15mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、0.1～2mmol/L MgCl2、0.1～0.5mg/mL糖基水解酶、0.5～2mmol/L莱鲍迪苷A；20～50℃反应0.3～3h后加入5％HC1(质量浓度)终止反应。
作为优选方案，该催化反应体系为：pH＝8.0、5mmol/L UDPG、1mmol/L MgCl2、0.25mg/mL糖基水解酶、1mmol/L RA；30℃反应0.5h后加入5％HC1终止反应。
本发明解决的第五个技术问题是提供全细胞催化合成RD的方法。
本发明全细胞催化合成RD的方法，采用本发明所述的重组大肠杆菌为全细胞催化剂，将RA催化转化成RD。
优选的，催化反应体系为：pH＝6.4～8.0、UDPG浓度为5～15mmol/L、菌体密度为0.2～0.64g/mL、RA浓度为0.5～2mmol/L、柠檬酸钠浓度为0～80mmol/L、二甲苯体积浓度为0～2％、反应温度为20～50℃、反应时间为1～3d。
全细胞催化反应的实质就是是酶促反应，而反应体系pH是酶催化或全细胞催化体系最为关键的因素。经研究发现，6His-EUGT11在碱性条件下(pH8.0)具有最高的相对催化效率。在中性条件pH7.0～7.4之间催化效率相对较为稳定；在弱酸性条件下催化效率相对较低，RD的产量减少48％。6His-EUGT11在其最适pH值条件下，酶分子上活性基团的解离状态，最适于酶与底物的结合，而高于或低于最适pH值时，酶活性部位基团的解离状态不利于酶和底物结合，酶活力也相应降低。因此反应体系的pH是否在酶最适pH范围内，是影响其催化效率的关键。另一方面，pH影响除了对酶的催化效率以外，还与糖基供体UDPG的稳定性相关。UDPG为一焦磷酸化合物，在弱碱性条件下具有较好的稳定性，在弱酸性条件下稳定性较差。因此，优选的反应体系pH值为8.0。
在全细胞催化过程中，温度也是影响其催化效率的关键因素之一。温度不仅与酶活性息息相关，而且还影响底物和供体的分子运动能力。当温度较低时，酶催化活力较低，而且分子布朗运动较弱；当温度升高时，酶活力会有所提高，活化分子数增多，但是酶的相对稳定性会变差，直至变性成非功能性沉淀。本发明优选的反应温度为20～50℃。经研究发现，当温度超过42℃至50℃时，RD的产量开始持续下降至25.1mg/L，仅为最适温度时的40.6％；与此相反，当催化温度降低时，RD的产量也会有所降低。因此，最优选的反应温度为42℃。
柠檬酸钠对糖酵解途径有抑制作用，促进UDPG的生成。因此，本发明的催化体系中可以加入柠檬酸钠。研究发现，柠檬酸钠浓度从0mmol/L～60mmol/L时，RD的产量逐渐增加。在60mmol/L时RD产量达到相对最大，继续增加柠檬酸钠浓度使得RD产量略有降低，可能是菌体量有所减少导致。表明柠檬酸钠的添加可以促进糖苷类化合物的生成，但是过高浓度的柠檬酸钠可影响菌体的基本代谢，进而影响菌体活性。因此，最优选的柠檬酸钠浓度为60mmol/L。
菌体密度对RD产量也有一定的影响。在一定范围内，菌体密度的增加，使得反应体系中的酶量也相应增加，相当于单位体积中酶量增多，反应转化率提高。过大密度的菌体量对反应体系的影响较大，引起了反应体系中总缓冲液量不同，进而影响了转化体系中溶氧量和底物与细胞间的传质，因而影响了最终的转化效果。研究发现，最优选的菌体密度为0.16g湿细胞/mL反应液。
全细胞转化体系与体外酶反应体系最主要的区别在于，前者底物与酶结合要通过细胞传质，而后者则是在均质条件下自由结合。二甲苯是一种常用的表面活性剂，它在反应溶液中可以改变细胞膜的通透性。因此，在本发明的催化反应体系中可以加入二甲苯。经过研究发现，不加入二甲苯时，使用未经细胞膜通透化处理的大肠杆菌催化RD产生，由于细胞膜的屏障作用，使得底物不能很好地进入细胞内与酶结合，RD的产量有限。当二甲苯在1％(v/v)浓度时具有促进作用，在相同反应体系中产量提高近70％。因此，优选的二甲苯浓度为1％。
糖基转移酶介导的催化反应需要UDPG作为糖基供体。本发明中，UDPG的供应是全细胞催化糖苷类化合物RD生成的关键。研究表明添加UDPG的浓度从5mmol/L～12mmol/L，其RD生成量显著增加，UDPG浓度为12mmol/L时，RD生成量达到最大值，UDPG浓度为15mmol/L时，RD生成量无明显变化。因此，优选的UDPG浓度为12mmol/L。
综上所述，本发明优选的催化反应体系为：
pH＝8.0、尿苷二磷酸葡萄糖浓度为12mmol/L、菌体密度为0.16g/mL、莱鲍迪苷A浓度为1mmol/L、柠檬酸钠浓度为60mmol/L、二甲苯体积浓度为1％、反应温度为42℃，反应时间为1d。
此外，为了提高RD的产率，本发明的全细胞催化体系中还可以加入ZnCl2。优选的，ZnCl2的浓度为0.1mmol/L。下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1重组大肠杆菌的构建
1、糖基转移酶基因eugt11的克隆
提取水稻(Oryzasativa)叶总RNA并通过反转录获得水稻cDNA。根据GeneBank数据库中的eugt11基因序列(AccessionNo.AK121682)，设计PCR扩增引物，上下游引物分别引入BamH I、Hind III位点。
引物序列分别为：F：5'-CGCGGATCCATGGACTCCGGCTACTCCTCC-3'(BamH I)和R:5'-CCCAAGCTTTCAATCCTTGTAAGATCTCAATTGC-3'(Hind III)。
PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min。
扩增后的PCR产物电泳图谱见图1。从图1中可以看出，该产物的大小约为1.4kb，与预期糖基转移酶基因eugt11(1401bp)大小一致。
2、重组质粒的构建
将纯化后的PCR产物即eugt11片段与表达载体pETDuet-l分别用(BamH I)和HindIII双酶切，回收目的片段后以T4连接酶16℃条件下进行连接。将连接产物转化至E.coliDH10B感受态细胞，涂氨苄霉素抗性LB平板并37℃培养12h。挑取单克隆并提取质粒，经BamHI/Hind III双酶切验证，分别获得了5.3kb与1.4kb大小的两个片段(详见图2)，与线性化的pETDuet-l质粒及eugt11片段大小一致。将该阳性克隆，送样至上海生工生物公司进行DNA测序。经测序结果比对验证，将鉴定为阳性克隆的重组质粒命名为pETDuet-eugt11。
3、重组大肠杆菌的构建
将重组质粒pETDuet-eugt11转化至感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，通过氨苄霉素抗性筛选，获得重组菌E.coli BL21(pETDuet-eugt11)。
实施例2重组蛋白的获得及纯化
1、重组蛋白的获得
取E.coli BL21(pETDuet-eugt11)保存甘油菌并划线至含氨苄霉素LB平板上，挑取单克隆至2mLLB液体培养基中(含100mg/L氨苄霉素)，37℃、250r/min过夜培养。以1％接种量经2步接种法将重组菌E.coli BL21(pETDuet-eugt11)转接到1L新鲜LB培养基(含100mg/L氨苄霉素)，相同条件下继续培养至OD600为0.5。添加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，在16℃，180r/min条件下诱导培养20h后收集菌体。发酵液经4℃、6000r/min离心10mm，所获得菌体用于重组蛋白纯化和后续全细胞转化研究。
菌体经0.1mol/L，pH7.5磷酸钠缓冲液洗涤2次后，用buffer A重悬至OD约为20。经高压均质机破碎后，流出液于10000r/min、4℃离心60min，弃去沉淀，收集上清即为粗酶液。以E.coli BL21(pETDuet-l)细胞破碎离心后上清作为空白对照。
2、重组蛋白的纯化
约30mL粗酶液经0.22μm滤膜过滤后使用镍柱进行亲和层析纯化。粗酶液中加入1mL氨基三乙酸合镍，并在4℃孵育1h。装柱后弃去流出液，用10倍柱体积buffer B洗脱非特异结合杂蛋白，再用10倍柱体积buffer C将目的蛋白洗脱。收集含目的蛋白流份并合后，通过AKTA快速蛋白液相色谱(Fast Protein Liquid Chromatography,FPLC)进行离子交换层析(Ion Exchange Chromatography，FIEC)和凝胶排阻层析(Gel ExclusionChromatography)。离子交换层析条件为：阴离子交换柱(PENG，Pharmical Biotech)；梯度洗脱：0min～20min100％buffer A，流速3mL/min；20min～40min buffer D比例上升至100％；流速5mL/min；柱温：4℃；UV:280nm。收集蛋白并用超滤管在4℃、2000g条件下浓缩至1mL。浓缩液进行下一步凝胶排阻层析。色谱条件为：凝胶排阻柱(Superdex 200 10/300GL，GE Healthcare)；等度洗脱条：25mL100％buffer A，流速0.4mL/min，柱温：4℃；UV:280nm。收集洗脱蛋白，得到纯化后的重组蛋白。
其中，各蛋白缓冲液的组成为：
Buffer A：0.1mol/L氯化钠、20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、10mmol/L咪唑；
Buffer B：0.1mol/L氯化钠、20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、25mmol/L咪唑；
Buffer C：0.1mol/L氯化钠.20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、0.25mol/L咪唑；
Buffer D：20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mol/L氯化钠。
以细胞破碎液离心后上清作为诱导后总蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，电泳图谱见图3。结果显示：经IPTG诱重组大肠杆菌总蛋白中得到一条大小约为50kD可溶性蛋白条带，这与糖基转移酶EUGT11的大小一致。初步表明重组蛋白6His-EUGT11在重组菌中成功获得了可溶性表达。以E.coliBL21(pETDuet-l)诱导蛋白为空白对照。通过阴离子交换层析及凝胶排阻层析后获得重组酶纯度到90％。
实施例3重组蛋白酶催化反应合成RD
在2mL的反应体系中(0.1mol/L磷酸钠缓冲液pH＝8.0、5mmol/L UDPG、1mmol/LMgCl2、0.25mg/mL 6His-EUGT11)加入底物1mmol/L RA(1mmol/L RA的DMSO溶液)，30℃反应0.5h后加入5％HC1终止反应。反应液用相同体积正丁醇萃取4次，合并有机相并浓缩干燥。残留物用0.5mLDMSO溶解后用0.22μm滤膜过滤。将滤出液进行高效液相色谱(Thermo，Ultimate3000)分析。色谱条件为：色谱柱TOSOHC18(ODS，5um，4.6mm×250mm)；梯度洗脱：0min～5min25％乙腈，5min～30min25％～65％乙腈，30min—40min65％～100％乙腈；流速1mL/min；柱温：30℃；UV:205mm。空白对照为不加入酶液的反应液。
HPLC图谱见图4。反应结果显示RA在无酶的反应体系中是稳定存在的，保留时间tR＝15.1min与标准品时间一致；当重组酶6His-EUGT11存在条件下，RA被转化成另一化合物，转化率达98.1％。其色谱峰的保留时间与标准品RD-致(tR＝11.7min)(图4)。该结果表明6His-EUGT11具有很强的催化RA生成RD的能力。
在2mL的反应体系中，在30℃反应条件下，重组酶6His-EUGT11的酶活性为65.4U/mg。
酶活力单位定义为：在上述反应体系30℃条件下，1min催化形成1μmolRD所需要的酶量为1个活力单位(U)。
实施例4重组大肠杆菌催化反应合成RD
以重组大肠杆菌[E.coli BL21(pETDuet-eugt11)]为催化剂，全细胞反应催化RA转化为RD。全细胞反应体系为：pH＝8.0，1.0mmol/L RA，1mmol/L UDPG、10mmol/L MgCl2、60mmol/L柠檬酸三钠、0.1％(v/v)二甲苯、菌体密度0.2g/mL、反应温度37℃，反应时间为24h。
反应结束后12000r/min离心10min去除沉淀，上清经0.22μm滤膜过滤后用于高效液相色谱分析，高效液相色谱分析的条件同实施例3。
通过测定RD的生成量来间接反映重组大肠杆菌细胞的催化活性。
本发明RD的产量均通过外标法计算获得。即配制5个不同浓度(12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L)标准品溶液进行HPLC测定。以RD的质量分数为横坐标，RD对应峰面积为纵坐标绘制标准曲线，获得线性方程：y＝4.9372x+0.6835，相关系数R＝0.9999。
通过计算，RD的产量为51.6mg/L。
实施例5 pH值对全细胞催化反应的影响
采用实施例4的反应条件，仅改变反应的pH值，缓冲液pH值分别为6.4、6.8、7.2、7.6和8.0。每个条件进行3组平行实验。
反应结束后，测定RD产量，详见图5。
由图5可知，EUGT11在碱性条件下(pH8.0)具有最高的相对催化效率。表现为RD的产量达51.6mg/L。在中性条件pH7.0～7.4之间催化效率相对较为稳定；在弱酸性条件下催化效率相对较低，RD的产量减少48％。6His-EUGT11在其最适pH值条件下，酶分子上活性基团的解离状态，最适于酶与底物的结合，而高于或低于最适pH值时，酶活性部位基团的解离状态不利于酶和底物结合，酶活力也相应降低。因此反应体系的pH是否在酶最适pH范围内，是影响其催化效率的关键。
另一方面，pH影响除了对酶的催化效率以外，还与糖基供体UDPG的稳定性相关。UDPG为一焦磷酸化合物，在弱碱性条件下具有较好的稳定性，在弱酸性条件下稳定性较差。
实施例6温度对全细胞催化反应影响
采用实施例4的反应条件，仅改变反应的温度，反应的温度分别为20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、45℃和50℃。每个条件进行3组平行实验。
反应结束后，测定RD产量，详见图6。
如图6所示，最适温度为42℃时RD产量为61.8mg/L。当温度超过42℃至50℃时，RD的产量开始持续下降至25.1mg/L，仅为最适温度时的40.6％；与此相反，当催化温度降低时，RD的产量也会有所降低。
实施例7柠檬酸钠浓度对全细胞催化反应的影响
采用实施例4的反应条件，改变反应的温度为42℃，柠檬酸钠浓度分别为0mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L和80mmol/L。每个条件进行3组平行实验。
反应结束后，测定RD产量，详见图7。
从图7中可以看出，柠檬酸钠浓度从0mmol/L～60mmol/L时，RD的产量逐渐增加。在60mmol/L时RD产量达到相对最大，为50.863mg/L。继续增加柠檬酸钠浓度使得RD产量略有降低，可能是菌体量有所减少导致。表明柠檬酸钠的添加可以促进糖苷类化合物的生成，但是过高浓度的柠檬酸钠可影响菌体的基本代谢，进而影响菌体活性。
实施例8茵体密度对全细胞催化反应的影响
采用实施例4的反应条件，改变反应的温度为42℃，菌体密度为0.02g/mL、0.04g/mL、0.08g/mL、0.16g/mL、0.32g/mL和0.64g/mL菌体。每个条件进行3组平行实验。
反应结束后，测定RD产量，详见图8。
从图8可以看出，随着细胞密度增加(从0.02g湿细胞/mL到0.16g/mL)，RD的产量也从14.7mg/L提高到66.3mg/L，进一步增加单位体积细胞量，RD的产量逐渐降低至30.3mg/L，此时的细胞密度为0.64g/mL时。
实施例9不同二价离子对全细胞催化反应的影响
采用实施例4的反应条件，改变反应的温度为42℃，菌体密度为0.16g/mL，二价离子分别为0.1mmol/L的Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Co2+以及不加入二价离子。每个条件进行3组平行实验。
反应结束后，测定RD产量，详见图9。其中，control为空白对照。
结果表明，仅0.1mmoL/L Zn2+离子可以提高RD的产量，在此条件下RD的产量为68.2mg/L。而相同浓度的其它二价金属离子Mg2+、Mn2+、Ca2+以及Co2+的存在，使得RD的生成量分别降低了59.7％、61.9％、50.0％和25.1％。推测主要原因是不同金属离子能以不同的方式与底物、酶的活性产物和酶本身产生极强的亲和力，而导致酶活性的改变。而高浓度的金属离子也降低酶活性，例如MgCl2浓度低于6g/L时可以促进糖基转移酶UGT76G1催化甜菊苷(Stevioside，ST)合成RA的活性，而MgCl2浓度高于6g/L时，则对UGT76G1的催化活性具有抑制作用。
实施例10二甲苯浓度对全细胞催化反应的影响
采用实施例4的反应条件，改变反应的温度为42℃，菌体密度为0.16g/mL，二价离子为0.1mmol/L ZnCl2，二甲苯体积浓度分别为0％、0.1％、0.5％、1％、1.5％和2％。每个条件进行3组平行实验。
反应结束后，测定RD产量，详见图10。
结果表明，使用未经细胞膜通透化处理的大肠杆菌催化RD产生，由于细胞膜的屏障作用，使得底物不能很好地进入细胞内与酶结合，RD的产量仅为40.1mg/L。当二甲苯在1％(v/v)浓度时具有促进作用，在相同反应体系中可获得68.2mg/LRD，产量提高近70％。
实施例11 UDPG浓度对全细胞催化反应的影响
采用实施例4的反应条件，改变反应的温度为42℃，菌体密度为0.16g/mL，二价离子为0.1mmol/L ZnCl2，二甲苯体积浓度为1％，UDPG浓度分别为5mmol/L、7mmol/L、10mmol/L、12mmol/L和15mmol/L。每个条件进行3组平行实验。
反应结束后，测定RD产量，详见图11。
结果表明，结果表明添加UDPG的浓度从5mmol/L～12mmol/L，其RD生成量显著增加(从88.2mg/L到123.6mg/L)，UDPG浓度为12mmol/L时，RD生成量达到最大值，其转化率为11.0％，UDPG浓度为15mmol/L时，RD生成量无明显变化。
实施例12重组大肠杆菌催化反应合成RD
以重组大肠杆菌[E.coli BL21(pETDuet-eugt11)]为催化剂，全细胞反应催化RA转化为RD。全细胞反应体系为：菌体密度0.16g湿细胞/mL反应液，底物RA浓度为1.0mmol/L，pH＝8.0，60mmol/L柠檬酸钠，1％(v/v)二甲苯，0.1mmol/L ZnCl2，12.0mmol/L UDPG，反应温度42℃，反应时间为24h。
反应结束后12000r/min离心10min去除沉淀，上清经0.22μm滤膜过滤后用于高效液相色谱分析，高效液相色谱分析的条件同实施例3。
通过计算，RD的产量为0.1mmol/L(123.6mg/L)，转化率达11.0％。
Figure IDA0001417966920000011

Claims (11)

1.重组大肠杆菌在催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D中的用途，该重组大肠杆菌为带有eugt11基因序列的转化子，采用如下方法制备得到：将源于水稻的eugt11基因与载体pETDuet-1连接构建重组质粒，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌，其中，eugt11基因序列为GenBank数据库中登录号为AK121682的序列。
2.糖基水解酶在催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D中的用途，其中，所述糖基水解酶为eugt11基因编码得到的蛋白，eugt11基因序列为GenBank数据库中编号为AK121682的序列。
3.根据权利要求2所述的糖基水解酶在催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D中的用途，其特征在于：所述糖基水解酶为重组大肠杆菌经诱导表达的产物，该重组大肠杆菌为带有eugt11基因序列的转化子，采用如下方法制备得到：将源于水稻的eugt11基因与载体pETDuet-1连接构建重组质粒，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌，其中，eugt11基因序列为GenBank数据库中登录号为AK121682的序列。
4.莱鲍迪苷D的合成方法，其特征在于：采用糖基水解酶为催化剂，催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D；所述糖基水解酶为eugt11基因编码得到的蛋白，eugt11基因序列为GenBank数据库中编号为AK121682的序列。
5.根据权利要求4所述的莱鲍迪苷D的合成方法，其特征在于：催化反应体系为：pH＝6.4～8.0、1～15mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖、0.1～2mmol/L MgCl2、0.1～0.5mg/mL糖基水解酶、0.5～2mmol/L莱鲍迪苷A；20～50℃反应0.3～3h后加入5％HC1终止反应。
6.根据权利要求5所述的莱鲍迪苷D的合成方法，其特征在于：催化反应体系为：pH＝8.0、5mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖、1mmol/L MgCl2、0.25mg/mL糖基水解酶、1mmol/L莱鲍迪苷A；30℃反应0.5h后加入5％HC1终止反应。
7.全细胞催化合成莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：采用重组大肠杆菌为全细胞催化剂，将莱鲍迪苷A催化转化成莱鲍迪苷D，该重组大肠杆菌为带有eugt11基因序列的转化子，采用如下方法制备得到：将源于水稻的eugt11基因与载体pETDuet-1连接构建重组质粒，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌，其中，eugt11基因序列为GenBank数据库中登录号为AK121682的序列。
8.根据权利要求7所述的全细胞催化合成莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：催化反应体系为：pH＝6.4～8.0、尿苷二磷酸葡萄糖浓度为5～15mmol/L、菌体密度为0.2～0.64g/mL、莱鲍迪苷A浓度为0.5～2mmol/L、柠檬酸钠浓度为0～80mmol/L、二甲苯体积浓度为0～2％、反应温度为20～50℃、反应时间为1～3d。
9.根据权利要求7所述的全细胞催化合成莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：催化反应体系为pH＝8.0、尿苷二磷酸葡萄糖浓度为12mmol/L、菌体密度为0.16g/mL、莱鲍迪苷A浓度为1mmol/L、柠檬酸钠浓度为60mmol/L、二甲苯体积浓度为1％、反应温度为42℃，反应时间为1d。
10.根据权利要求8所述的全细胞催化合成莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：催化反应体系中还含有ZnCl2。
11.根据权利要求10所述的全细胞催化合成莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：ZnCl2的浓度为0.1mmol/L。
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