CN114164161B

CN114164161B - 一种生产新橙皮苷的双酶共表达菌株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN114164161B
Application number: CN202210136207.6A
Authority: CN
Inventors: 李荣旭; 李慧灵; 周金林; 黄佳俊; 卢宇靖; 白少钰
Original assignee: Foshan Huiteng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Foshan Huiteng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-02-15
Filing date: 2022-02-15
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2042-02-15
Also published as: CN114164161A

Abstract

本发明公开了一种生产新橙皮苷的双酶共表达菌株及其构建方法和应用，所述双酶共表达菌株同时携带鼠李糖转移酶和UDP‑鼠李糖合酶；本发明的生产新橙皮苷的双酶共表达菌株能同时表达鼠李糖转移酶和UDP‑鼠李糖合酶，实现两种酶的不同表达水平的高效表达。对表达系统进行优化设计，具体为限定引物序列和限定双启动模式构建双酶共表达载体，获得双酶体系表达菌株。利用该双酶共表达菌株能通过生物酶法催化橙皮素单葡萄糖苷转化制备新橙皮苷。该方法无需额外添加UPD‑鼠李糖，直接通过添加底物橙皮素单葡萄糖苷进行全细胞催化，即可利用菌株体内自主合成的UPD‑鼠李糖进行一步化制备新橙皮苷，整个过程高效且简单。

Description

一种生产新橙皮苷的双酶共表达菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及酶学技术领域，具体涉及一种生产新橙皮苷的双酶共表达菌株及其构建方法和应用。

背景技术

新橙皮苷(Neohesperidin，NH)是芸香科柑橘属植物的次生代谢产物，属于黄酮类化合物，可从柑橘属的白皮层，以及中药枳实(酸橙或甜橙)和枳壳中提取，也可通过柚皮苷或橙皮苷制备。NH是天然的抗氧化剂，在降血脂、镇静、抗氧化、抗肿瘤等方面具有较强的生物活性，能通过降低亚硝基胺、黄曲霉素和其他致癌物质的致癌作用，以达到预防癌症的效果。NH还有抗炎、降血脂、降血胆固醇、解痉、镇痛等多种功效，是当前常见的医用原料。此外，NH也是重要的工业原料，在碱性条件下，经氢化可得到新橙皮苷二氢查耳酮(Neohesperidin Dihydrochalcone，NHDC)，是一种具有极高甜度的新型甜味剂和苦味抑制剂，其具有性质稳定、甜度高(是蔗糖甜度的1500-1800倍)、热量小、口感好、无毒无害、代谢速度快等优点。

当前NH仅在酸橙中发现，其含量非常低，价格昂贵。NH的合成原料主要是柚皮苷和橙皮苷，常用的合成工艺分为化学法和生物法。化学法是柚皮苷通过碱醇、脯氨酸或四氢吡咯等催化剂合成新橙皮苷，但产率低，成本高，是化学法合成NH的难题之一。随后朱思明等通过生物法，将橙皮苷与金属溶液反应得到橙皮苷金属配合物，再经橙皮苷酶和鼠李糖基转移酶先后催化，最后除去金属离子得到新橙皮苷。

鼠李糖基转移酶UGTRha1广泛存在于自然界中，它能够将鼠李糖基从核苷糖转移至特定受体，参与次生代谢产物的生成并在生物体的结构组成及多种生理功能中发挥重要的作用。但是，鼠李糖基转移酶在体外酶催化时需依赖于价格昂贵的UDP-鼠李糖为原料，因此不具备经济可行性。相关研究表明，可通过改造大肠杆菌使其自主合成UDP-鼠李糖，继而利用大肠杆菌合成的鼠李糖完成鼠李糖基的供给，可以不依赖于外源UDP-鼠李糖的添加。UDP-鼠李糖合酶(RHM)是控制鼠李糖苷合成途径中的关键酶,能将UDP-葡萄糖催化转化为UDP-鼠李糖，参与鼠李糖分子类化合物的生物合成。此外，研究表明敲除pgi基因可增加胞内UDP-葡萄糖的供应，可为RHM酶反应提供原料，进而提高转化率。迄今为止，已有许多文献提出这两种酶在食品和医药等行业的应用价值，如柚皮苷、橙皮苷和人参皂苷等，但还未报道这两种酶共表达的相关研究。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种生产新橙皮苷的双酶共表达菌株，该菌株能同时表达鼠李糖转移酶与UDP-鼠李糖合酶，提高橙皮素单葡萄糖苷的转化率；本发明的目的之二在于提供一种生产新橙皮苷的双酶共表达菌株的构建方法，通过构建双酶共表达载体及其元件优化，得到酶活最高的双酶共表达菌株；本发明的目的之三在于提供一种生产新橙皮苷的双酶共表达菌株的应用，利用双酶共表达工程菌可有效将橙皮素单葡萄糖苷催化转化为新橙皮苷，同时可用于废弃橙皮的新加工。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种生产新橙皮苷的双酶共表达菌株，所述双酶共表达菌株同时携带鼠李糖转移酶和UDP-鼠李糖合酶；其中，鼠李糖转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述鼠李糖转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；UDP-鼠李糖合酶的氨基酸序列如SEQID NO：3所示，编码所述UDP-鼠李糖合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步，所述重组载体为pET28a。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

生产新橙皮苷的双酶共表达菌株的构建方法，包括以下步骤：

1)将鼠李糖转移酶基因和UDP-鼠李糖合酶基因分别连接到载体中，得到鼠李糖转移酶基因载体和UDP-鼠李糖合酶基因载体；

2)分别以鼠李糖转移酶基因载体和UDP-鼠李糖合酶基因载体为模版，采用引物进行PCR扩增，获得鼠李糖转移酶基因片段和UDP-鼠李糖合酶基因片段；

3)将鼠李糖转移酶基因片段和UDP-鼠李糖合酶基因片段与载体进行重组连接，得到重组载体；

4)将重组载体转化至宿主细胞中，筛选得到双酶共表达工程菌株。

5)对筛选出来的双酶共表达工程菌进行基因编辑敲除，得到生产新橙皮苷的双酶共表达菌株。

进一步，所述引物为第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四对引物对、第五对引物对和第六对引物；第一引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物如SEQID NO：6所示；第二引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物如SEQ ID NO：8所示；第三引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物如SEQ ID NO：10所示；第四引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物如SEQ ID NO：12所示；第五引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：13所示，下游引物如SEQ ID NO：14所示；第六引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：15所示，下游引物如SEQ ID NO：16所示。

再进一步，步骤4)中，其中，所述双酶共表达工程菌株分别命名为WPE1、WPE2、WPE3和WPE4，WPE1和WPE2只包含一个T7启动子，WPE3和WPE4在鼠李糖转移酶基因和UDP-鼠李糖合酶基因前各有一个T7启动子，且WPE3含有MBP可溶性标签，优选WPE4作为重组菌。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

生产新橙皮苷的双酶共表达菌株的应用，所述生产新橙皮苷的双酶共表达菌株用于将橙皮素单葡萄糖苷催化转化为新橙皮苷。

进一步，所述橙皮素单葡萄糖苷的底物浓度为0.25～2mM。

再进一步，所述生产新橙皮苷的双酶共表达菌株的催化条件为：反应温度为16℃，加入IPTG的浓度为200～500nM，葡萄糖终浓度为2～40g/L。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明的生产新橙皮苷的双酶共表达菌株能同时表达鼠李糖转移酶和UDP-鼠李糖合酶，实现两种酶的不同表达水平的高效表达。

(2)本发明采用双酶体系同时表达鼠李糖基转移酶和鼠李糖合成酶，并进一步对表达系统进行优化设计，具体为限定引物序列和限定双启动模式构建双酶共表达载体，获得具备无需添加外源鼠李糖即可催化橙皮素单葡萄糖苷形成NH的双酶体系表达菌株。

(3)本发明利用该双酶共表达菌株能通过生物酶法催化橙皮素单葡萄糖苷转化制备新橙皮苷。该方法无需额外添加UPD-鼠李糖，直接通过添加底物橙皮素单葡萄糖苷进行全细胞催化，即可利用菌株体内自主合成的UPD-鼠李糖进行一步化制备新橙皮苷，整个过程高效且简单。

附图说明

图1为不同构建策略的菌株的载体信息图；

图2为不同构建策略的菌株的全细胞催化效率示意图；

图3为不同催化条件的菌株的全细胞催化效率示意图；

图4为不同糖基供体供应条件的菌株的全细胞催化效率示意图；

图5为菌株在不同底物浓度下催化合成的效率示意图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

分别将来源于拟南芥的鼠李糖基转移酶UGTRha1基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和来源于柚子的UDP-鼠李糖合成酶RHM(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。

引物信息如表1所示。合成如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的两条引物，在合成的引物,两端分别加Nhe I和BamH I两个酶切位点，以合成基因RHM为模板进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KOD DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，72℃2min，共35个循环；72℃10min降至10℃。采用Axygen Gel ExtractionKit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的PCR产物利用ThermoFisher公司的T4 DNA连接酶连入经Nhe I和BamH I双酶切的pET28a载体(Invitrogen公司)中。用含Kan抗性的培养基筛选出阳性转化子，所获得的重组载体命名为pET28a-RHM。

合成如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的两条引物，在合成的引物,两端分别加EcoR I和Xho I两个酶切位点，以合成基因Rha为模板进行PCR和片段回收。回收后的PCR产物利用的T4 DNA连接酶连入经EcoR I和Xho I双酶切的pET28a载体和pET28a-RHM中，所获得的重组载体分别命名为pET28a-Rha和pET28a-RHM-Rha。将重组载体pET28a-RHM-Rha转化至宿主细胞中，用含Kan抗性的培养基筛选出阳性转化子，筛选得到双酶共表达工程菌株WPE1。

合成如序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的两条引物，在合成的引物,两端分别各加Nhe I酶切位点，以合成基因Rha为模板进行PCR和片段回收。回收后的PCR产物利用T4 DNA连接酶连入经Nhe I酶切的pET28a-RHM载体中。所获得的重组载体命名为pET28a-Rha-RHM。将重组载体pET28a-Rha-RHM转化至宿主细胞中，用含Kan抗性的培养基筛选出阳性转化子，筛选得到双酶共表达工程菌株WPE2。

合成如序列表中SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的两条引物，在合成的引物,两端分别各加Sph I酶切位点，以pET28a-RHM为模板进行PCR和片段回收。回收后的PCR产物利用T4 DNA连接酶连入经Sph I酶切的pET28a-Rha载体中。所获得的重组载体命名为pET28a-TRHM-TRha。将重组载体pET28a-TRHM-TRha转化至宿主细胞中，用含Kan抗性的培养基筛选出阳性转化子，筛选得到双酶共表达工程菌株WPE4。

合成如序列表中SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的两条引物，引物5’分别包含了pMAL-p5x的同源臂，以pET28a-TRHM-TRha为模板进行PCR和片段回收。合成如序列表中SEQID NO:15和SEQ ID NO:16的两条引物，以pMAL-p5x为模板进行PCR和片段回收，将上述回收后的两个PCR回收片段，经金沙生物公司的Uniclone One step Seamleaa Cloning kit无缝克隆，得到重组载体命名为pMc5x-MBP-RHM-Rha。将pMc5x-MBP-RHM-Rha转化至宿主细胞中，用含Amp和Kan双抗性的培养基筛选出阳性转化子，筛选得到双酶共表达工程菌株WPE3。

表1

表2

注：WPE1、WPE2、WPE3、WPE4相关载体信息见图1。

工程菌株的转化及活性检测

将表2所示的WEP1、WPE2、WPE3和WEP4分别在含Kan的M9培养基中培养至OD600为0.6～1.0时，加入0.1～0.3mmol/L的IPTG进行14～18℃诱导16～20h，随后经过离心去上清、水洗菌体、重悬菌体等步骤得到4份等浓度的全细胞粗酶液。最后加入终浓度为2mM的橙皮素单葡萄糖苷，在30℃中进行全细胞催化反应24h，经HPLC检测NH的转化率，如图2所示，结果显示WPE4的酶活最高，转化率提高至7.2％，相比出发菌株提高了75％以上。

WPE4催化体系的优化：

我们对催化体系进行了系统优化，包括菌株诱导条件优化、催化体系中关键组分含量优化等，使橙皮素单葡萄糖苷的转化率得到巨大的提升，具体参数见表3。最终在最优催化条件下，转化率从原来的7.2％提高到56％，如图3所示，相比于初始条件提高了近8倍。

表3

UDP-葡萄糖供应优化：

为进一步提高糖基供体UDP-鼠李糖的供应，我们对WPE4菌株进行了优化，具体优化条件如表3所示，以提高其UDP-葡萄糖供应，采用经典基因敲除方法R-red同源重组策略，对大肠杆菌宿主菌的内源基因pgi进行敲除，得到菌株WPES4。最终经全细胞催化测试，如图4所示，WPE4S-2催化效率相比于出发菌株(WPE4)提高了50％。

综合优化：

通过综合上述菌株的系列优化与催化工艺的优化等策略，我们发现，在底物浓度为0.25mM下，催化效率达到了100％。进一步提高底物浓度(橙皮素单葡萄糖苷)，如图5所示，最终发现底物浓度提高到2mM下，转化率提高到接近100％，新橙皮苷产量为1.2g/L。进一步提高底物浓为5mM，转化率为60％，新橙皮苷产量达到1.8g/L。图5中HG表示橙皮素单葡萄糖苷，NH表示新橙皮苷。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山市汇腾生物技术有限公司

<120> 一种生产新橙皮苷的双酶共表达菌株及其构建方法和应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asp Thr Lys His Gln Asp Lys Pro Ser Ile Leu Met Leu Pro Trp

1 5 10 15

Leu Ala His Gly His Ile Ala Pro His Leu Glu Leu Ala Lys Lys Leu

20 25 30

Ser Gln Lys Asn Phe His Ile Tyr Phe Cys Ser Thr Pro Asn Asn Leu

35 40 45

Gln Ser Phe Gly Arg Asn Val Glu Lys Asn Phe Ser Ser Ser Ile Gln

50 55 60

Leu Ile Glu Leu Gln Leu Pro Asn Thr Phe Pro Glu Leu Pro Ser Gln

65 70 75 80

Asn Gln Thr Thr Lys Asn Leu Pro Pro His Leu Ile Tyr Thr Leu Val

85 90 95

Gly Ala Phe Glu Asp Ala Lys Pro Ala Phe Cys Asn Ile Leu Glu Thr

100 105 110

Leu Lys Pro Thr Leu Val Met Tyr Asp Leu Phe Gln Pro Trp Ala Ala

115 120 125

Glu Ala Ala Tyr Gln Tyr Asp Ile Ala Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu

130 135 140

Ser Ala Val Ala Cys Ser Phe Leu Leu His Asn Ile Val Asn Pro Ser

145 150 155 160

Leu Lys Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Asp Tyr Gln Asp Arg Glu Ser Lys

165 170 175

Asn Ile Asn Tyr Phe Leu His Leu Thr Ala Asn Gly Thr Leu Asn Lys

180 185 190

Asp Arg Phe Leu Lys Ala Phe Glu Leu Ser Cys Lys Phe Val Phe Ile

195 200 205

Lys Thr Ser Arg Glu Ile Glu Ser Lys Tyr Leu Asp Tyr Phe Pro Ser

210 215 220

Leu Met Gly Asn Glu Ile Ile Pro Val Gly Pro Leu Ile Gln Glu Pro

225 230 235 240

Thr Phe Lys Glu Asp Asp Thr Lys Ile Met Asp Trp Leu Ser Gln Lys

245 250 255

Glu Pro Arg Ser Val Val Tyr Ala Ser Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Pro

260 265 270

Ser Lys Asp Glu Ile His Glu Ile Ala Ser Gly Leu Leu Leu Ser Glu

275 280 285

Val Asn Phe Ile Trp Ala Phe Arg Leu His Pro Asp Glu Lys Met Thr

290 295 300

Ile Glu Glu Ala Leu Pro Gln Gly Phe Ala Glu Glu Ile Glu Arg Asn

305 310 315 320

Asn Lys Gly Met Ile Val Gln Gly Trp Val Pro Gln Ala Lys Ile Leu

325 330 335

Arg His Gly Ser Ile Gly Gly Phe Leu Ser His Cys Gly Trp Gly Ser

340 345 350

Val Val Glu Gly Met Val Phe Gly Val Pro Ile Ile Gly Val Pro Met

355 360 365

Ala Tyr Glu Gln Pro Ser Asn Ala Lys Val Val Val Asp Asn Gly Met

370 375 380

Gly Met Val Val Pro Arg Asp Lys Ile Asn Gln Arg Leu Gly Gly Glu

385 390 395 400

Glu Val Ala Arg Val Ile Lys His Val Val Leu Gln Glu Glu Ala Lys

405 410 415

Gln Ile Arg Arg Lys Ala Asn Glu Ile Ser Glu Ser Met Lys Lys Ile

420 425 430

Gly Asp Ala Glu Met Ser Val Val Val Glu Lys Leu Leu Gln Leu Val

435 440 445

Lys Lys Ser Glu

450

<210> 2

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggacacca agcaccagga taaaccgagc attctgatgc tgccgtggct ggcgcatggt 60

cacattgcgc cgcacctgga gctggcgaag aaactgagcc agaaaaactt ccacatctac 120

ttttgcagca ccccgaacaa cctgcaaagc ttcggccgta acgtggaaaa gaactttagc 180

agcagcatcc agctgattga gctgcaactg ccgaacacct tcccggaact gccgagccag 240

aaccaaacca ccaaaaacct gccgccgcac ctgatttaca ccctggtggg tgcgtttgag 300

gatgcgaagc cggcgttttg caacatcctg gaaaccctga aaccgaccct ggttatgtat 360

gacctgtttc agccgtgggc ggcggaggcg gcgtaccaat atgatatcgc ggcgattctg 420

ttcctgccgc tgagcgcggt ggcgtgcagc tttctgctgc acaacattgt taacccgagc 480

ctgaagtacc cgttctttga gagcgactat caggatcgtg aaagcaaaaa catcaactat 540

ttcctgcacc tgaccgcgaa cggcaccctg aacaaggacc gtttcctgaa agcgtttgag 600

ctgagctgca agttcgtgtt tatcaaaacc agccgtgaga ttgaaagcaa atacctggat 660

tatttcccga gcctgatggg taacgaaatc attccggttg gcccgctgat tcaggagccg 720

acctttaagg aagacgatac caaaatcatg gactggctga gccaaaaaga gccgcgtagc 780

gtggtttacg cgagcttcgg tagcgaatat tttccgagca aggatgagat ccacgaaatt 840

gcgagcggcc tgctgctgag cgaggtgaac ttcatttggg cgtttcgtct gcacccggac 900

gaaaagatga ccatcgagga agcgctgccg cagggtttcg cggaggaaat tgagcgtaac 960

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gttccgatca ttggcgttcc gatggcgtac gaacagccga gcaacgcgaa ggtggttgtg 1140

gacaacggta tgggcatggt tgtgccgcgt gataaaatta accaacgtct gggtggcgag 1200

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<210> 3

<211> 667

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Asp Asp Thr Thr Tyr Lys Pro Lys Asn Ile Leu Ile Thr Gly Ala

1 5 10 15

Ala Gly Phe Ile Ala Ser His Val Ala Asn Arg Leu Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Pro Asp Tyr Lys Ile Val Val Leu Asp Lys Leu Asp Tyr Cys Ser Asp

35 40 45

Leu Lys Asn Leu Asp Pro Ser Phe Ser Ser Pro Asn Phe Lys Phe Val

50 55 60

Lys Gly Asp Ile Ala Ser Asp Asp Leu Val Asn Tyr Leu Leu Ile Thr

65 70 75 80

Glu Asn Ile Asp Thr Ile Met His Phe Ala Ala Gln Thr His Val Asp

85 90 95

Asn Ser Phe Gly Asn Ser Phe Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Tyr Gly

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115 120 125

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130 135 140

Ala Ala Val Gly Asn His Glu Ala Ser Gln Leu Leu Pro Thr Asn Pro

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165 170 175

Arg Ser Tyr Gly Leu Pro Val Ile Thr Thr Arg Gly Asn Asn Val Tyr

180 185 190

Gly Pro Asn Gln Phe Pro Glu Lys Met Ile Pro Lys Phe Ile Leu Leu

195 200 205

Ala Met Ser Gly Lys Pro Leu Pro Ile His Gly Asp Gly Ser Asn Val

210 215 220

Arg Ser Tyr Leu Tyr Cys Glu Asp Val Ala Glu Ala Phe Glu Val Val

225 230 235 240

Leu His Lys Gly Glu Ile Gly His Val Tyr Asn Val Gly Thr Lys Arg

245 250 255

Glu Arg Arg Val Ile Asp Val Ala Arg Asp Ile Cys Lys Leu Phe Gly

260 265 270

Lys Asp Pro Glu Ser Ser Ile Gln Phe Val Glu Asn Arg Pro Phe Asn

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Ser Ser Glu Lys Lys Asp Val Ser Ser Asn Thr Val Gln Thr Phe Thr

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Val Val Thr Pro Lys Asn Gly Asp Ser Gly Asp Lys Ala Ser Leu Lys

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420 425 430

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Asn Asn Pro Arg Asn Phe Ile Thr Lys Ile Ser Arg Tyr Asn Lys Val

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Val Asp Ile Pro Asn Ser Met Thr Val Leu Asp Glu Leu Leu Pro Ile

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Ser Ile Glu Met Ala Lys Arg Asn Leu Arg Gly Ile Trp Asn Phe Thr

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Asn Pro Gly Val Val Ser His Asn Glu Ile Leu Glu Met Tyr Lys Asn

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<210> 4

<211> 2001

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tttgtggaga accggccctt taatgatcaa aggtacttcc ttgatgatca gaagctgaag 900

aaattggggt ggcaagagcg aacaaattgg gaagatggat tgaagaagac aatggactgg 960

tacactcaga atcctgagtg gtggggtgat gtttctggag ctttgcttcc tcatccgaga 1020

atgcttatga tgcccggtgg aagactttct gatggatcta gtgagaagaa agacgtttca 1080

agcaacacgg tccagacatt tacggttgta acacctaaga atggtgattc tggtgacaaa 1140

gcttcgttga agtttttgat ctatggtaag actggttggc ttggtggtct tctagggaaa 1200

ctatgtgaga agcaagggat tacatatgag tatgggaaag gacgtctgga ggatagagct 1260

tctcttgtgg cggatattcg tagcatcaaa cctactcatg tgtttaatgc tgctggttta 1320

actggcagac ccaacgttga ctggtgtgaa tctcacaaac cagagaccat tcgtgtaaat 1380

gtcgcaggta ctttgactct agctgatgtt tgcagagaga atgatctctt gatgatgaac 1440

ttcgccaccg gttgcatctt tgagtatgac gctacacatc ctgagggttc gggtataggt 1500

ttcaaggaag aagacaagcc aaatttcttt ggttctttct actcgaaaac caaagccatg 1560

gttgaggagc tcttgagaga atttgacaat gtatgtacct tgagagtccg gatgccaatc 1620

tcctcagacc taaacaaccc gagaaacttc atcacgaaga tctcgcgcta caacaaagtg 1680

gtggacatcc cgaacagcat gaccgtacta gacgagcttc tcccaatctc tatcgagatg 1740

gcgaagagaa acctaagagg catatggaat ttcaccaacc caggggtggt gagccacaac 1800

gagatattgg agatgtacaa gaattacatc gagccaggtt ttaaatggtc caacttcaca 1860

gtggaagaac aagcaaaggt cattgttgct gctcgaagca acaacgaaat ggatggatct 1920

aaactaagca aggagttccc agagatgctc tccatcaaag agtcactgct caaatacgtc 1980

Tttgaaccaa acaagagaacc 2001

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cggctagcga aggagatata ccatggatga tactacg 47

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgggatccgg ttctcttgtt tggttcaaag acgta 45

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggaattcatg gacaccaagc accag 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctcgagtta ttcgcttttc ttaaccagtt gc 45

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggctagcat ggacaccaag caccag 26

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggctagctt attcgctttt cttaaccagt tgc 33

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catgcatgct aatacgactc actatagggg aattgtg 37

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

catgcatgcc aaaaaacccc tcaagacccg ttta 34

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aattcgagct cgaacaacaa cgcaaggaat ggtgcatgc 39

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aagcttattt aattacctgc atccggatat agttcctcct ttcag 45

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcaggtaatt aaataagctt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttgttgttcg agctcgaatt 20

Claims

1.一种生产新橙皮苷的双酶共表达菌株，其特征在于，所述双酶共表达菌株同时携带鼠李糖转移酶和UDP-鼠李糖合酶；其中，鼠李糖转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述鼠李糖转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；UDP-鼠李糖合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，编码所述UDP-鼠李糖合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；鼠李糖转移酶基因和UDP-鼠李糖合酶基因各用一个T7启动子；

所述生产新橙皮苷的双酶共表达菌株的构建方法包括以下步骤：

1)合成如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的两条引物，以合成基因UDP鼠李糖合成酶基因为模板进行PCR；DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KOD DNA聚合酶；PCR扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，72℃2min，共35个循环；72℃10min降至10℃；采用AEYGEN公司的Axygen Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的PCR产物利用ThermoFisher公司的T4 DNA连接酶连入经Nhe I和BamH I双酶切的Invitrogen公司的pET28a载体中；用含Kan抗性的培养基筛选出阳性转化子，所获得的重组载体命名为pET28a-RHM；

2)合成如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的两条引物，以合成基因鼠李糖转移酶基因为模板进行PCR和片段回收；回收后的PCR产物利用T4 DNA连接酶连接经EcoR I和Xho I双酶切的pET28a载体中，所获得的重组载体命名为pET28a-Rha；

3)合成如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的两条引物，以pET28a-RHM为模板进行PCR和片段回收；回收后的PCR产物利用T4DNA连接酶连入经Sph I酶切的pET28a-Rha载体中；所获得的重组载体命名为pET28a-TRHM-TRha；

4)将重组载体pET28a-TRHM-TRha转化至宿主细胞中，用含Kan抗性的培养基筛选出阳性转化子，筛选得到双酶共表达工程菌株WPE4；

5)对筛选出来的双酶共表达工程菌WPE4的内源基因pgi进行基因编辑敲除，得到生产新橙皮苷的双酶共表达菌株；

所述宿主细胞为大肠杆菌。

2.权利要求1所述的生产新橙皮苷的双酶共表达菌株的应用，其特征在于，所述生产新橙皮苷的双酶共表达菌株用于将橙皮素单葡萄糖苷催化转化为新橙皮苷。

3.如权利要求1所述的生产新橙皮苷的双酶共表达菌株的应用，其特征在于，所述橙皮素单葡萄糖苷的底物浓度为0.25～2mM。

4.如权利要求1所述的生产新橙皮苷的双酶共表达菌株的应用，其特征在于，所述生产新橙皮苷的双酶共表达菌株的催化条件为：反应温度为16℃，加入IPTG的浓度为200～500nM，葡萄糖终浓度为2～40g/L。