CN115637262A

CN115637262A - 一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法及融合蛋白

Info

Publication number: CN115637262A
Application number: CN202111076885.XA
Authority: CN
Inventors: 孙华君; 熊淑婷; 郭晨; 赵威; 江汝泳; 谈敏; 郑艳; 唐佳乐; 钱志强
Original assignee: Hubei Yuanda Life Science And Technology Co ltd
Current assignee: Hubei Yuanda Life Science And Technology Co ltd
Priority date: 2021-09-14
Filing date: 2021-09-14
Publication date: 2023-01-24
Also published as: WO2023040205A1

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白及其在制备生产烟酰胺单核苷酸的催化剂中的应用，所述融合蛋白包括使用linker相连的烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。本发明还提供了一种蛋白组合及其应用，所述蛋白组合包括上述融合蛋白中的烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。本发明还提供了编码上述融合蛋白或蛋白组合的核酸、含有该核酸的重组表达载体以及含有该核酸或该重组表达载体的转化体以及它们的应用。本发明还提供了一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法，该方法使用了上述融合蛋白或蛋白组合，具有酶的活性高、底物浓度高以及反应效率高的进步效果。

Description

一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法及融合蛋白

技术领域

本发明属于生物合成领域，具体涉及一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法及可用于制备烟酰胺单核苷酸的融合蛋白或蛋白组合，还涉及编码融合蛋白的分离的核酸、含其的载体和转化体。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，缩写成NMN)是生物体内存在的一种物质，它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成生物细胞所赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，又称辅酶I)。2017年3月David Scinclair研究团队发表在《Science》上的一项研究表明，NAD+在小鼠体内的增加，使得大龄小鼠的组织和肌肉衰老迹象被逆转，这表明人类返老还童不再是梦想。由于NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD+前体小分子物质NMN的研究发现，食用自NMN可以有效提升体内NAD+的含量升高，并显著抑制衰老引起的新陈代谢，使得自NMN成为了“不老神药”。截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、影响mRNA的表达等诸多医疗保健用途。

目前合成NMN的主要方法包括：化学合成、生物催化法。其中化学法成本高，同时造成严重的环境污染，己逐渐被生物催化法取代。相比较而言，生物酶法催化生产NMN更加高效、成本更低、节能环保。目前，有三种生物催化方法生产NMN，第一种是以烟酰胺核糖(NR)为原料，通过烟酰胺核糖激酶(Ribosylnicotinamide kinase，EC 2.7.1.22，简写NRK酶)在ATP供应下生成NMN。第二种是以烟酰胺、核糖和ATP为底物，经D-核糖激酶(Ribokinase，EC2.7.1.15)、核酸磷酸焦磷酸激酶(ribose phosphate pyrophosphokinase，EC 2.7.6.1)、和烟酰胺核糖磷酸转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12)催化反应生成NMN。第三种是以腺苷或AMP、ATP、烟酰胺为原料，经腺苷激酶(EC 2.7.1.20)(以AMP为原料时不需要此酶)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.7)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12)催化生成NMN。

上述第二种、第三种方法最后均以5-磷酸核糖基-1-焦磷酸(Phosphoribosylpyrophosphate，PRPP)和烟酰胺通过烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamidephosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12)制备NMN。因烟酰胺磷酸核糖转移酶催化为可逆反应，合成NMN的同时也能水解NMN，反应转化率较低。同时，中间体PRPP化合物的合成难以实现且PRPP不稳定，收率非常低，不利于反应进行，成为了反应的主要限制条件。

而上述第一种方法直接以烟酰胺核糖为原料，底物转化率高，收率高，产品纯度高，未来将成为NMN的主流生产方法。目前已经有专利公开了一种新的烟酰胺核糖激酶及其突变体作为工业酶在催化合成β-烟酰胺单核苷酸中的方法与应用(专利号：CN110373398A)。但在单一的NRK条件下，ATP使用量大，成本高，后提取难度大。

有研究表明，在某些细菌体内存在利用多聚磷酸或其盐再生ATP的酶系。该酶系包括多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1，Ppk)、腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3，Adk)和多聚磷酸腺苷酸磷酸转移酶(EC 2.7.4.-，Pap)，其中，Ppk催化ADP与多聚磷酸或其盐反应生成ATP，Adk催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，Pap则催化AMP与多聚磷酸或其盐反应生成ADP。它们均可以帮助酶促反应中消耗的ATP循环再生，大大降低生产过程中ATP的用量，本发明统称这三种酶为“ATP循环酶”。目前已经有专利公开建立了这几种ATP循环酶的回收体系，并证明适用于工业化大规模生产(专利号：CN105861598A)。

此外，目前已经公开了一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法(专利号：CN112795606A)，以腺苷、烟酰胺、ATP或其盐、多聚磷酸激酶、镁离子、多聚磷酸盐为原料，在EC编号为EC 2.4.2.1的嘌呤核苷磷酸化酶(purine-nucleoside phosphorylase，简写PNP)和烟酰胺核糖激酶NRK的催化作用下合成β-烟酰胺单核苷酸，并且反应过程生成的ADP在多聚磷酸激酶的作用下实现ATP循环再生，降低生产成本。

但本领域缺乏一种进一步提高NMN的生产效率的方法。

发明内容

本发明解决的技术问题是为了克服本领域缺乏一种高效生产β-烟酰胺单核苷酸(NMN)的缺陷，提供了一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法及融合蛋白。

本发明将烟酰胺核糖激酶(NRK)和ATP循环酶以linker连接成为融合蛋白，并发酵生产此融合蛋白，将发酵所得融合蛋白作为催化剂，不仅能够高效将烟酰胺核糖(NR)或其氯化物催化生成NMN，并且能够同步实现ATP的循环利用，大大降低了ATP的投料量，减轻了分离纯化的工作量，提高了NMN生产效率。

本发明的技术原理是，将烟酰胺核糖激酶(NRK)基因和ATP循环酶(多聚磷酸激酶，Ppk)基因用linker相连，形成一个融合蛋白基因，将该基因转化入一株表达菌体中，得到同时具备NRK和Ppk的功能的融合蛋白(酶)及含有此融合蛋白(酶)的菌体，以发酵所得菌体或者破碎菌体得到的酶为催化剂，能在极少ATP条件下，以更加廉价的六偏磷酸钠提供磷酸基团，完成NR至NMN的高效转化。

本发明的技术方案之一为：提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。

在一些优选的实施例中，所述ATP循环酶为Ppk。

较佳地，所述Ppk来源于大肠杆菌，所述NRK来源于流感嗜血杆菌。

更佳地，所述NRK的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Ppk的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

在一些更优选的实施例中，所述NRK与Ppk之间有或没有通过连接子L连接。

较佳地，所述融合蛋白的结构为NRK-L-Ppk或Ppk-L-NRK。

和/或，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的技术方案之二为：提供了一种蛋白组合，其包括上述任意一种融合蛋白中的烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。

本发明的技术方案之三为：提供了一种分离的核酸，所述核酸编码上述任意一种融合蛋白，或上述任意一种蛋白组合；优选地，当所述分离的核酸包括NRK、Ppk和/或L时，编码所述NRK的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；编码所述Ppk的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码所述L的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明的技术方案之四为：提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括上述的分离的核酸。

较佳地，所述NRK和Ppk在同一个重组表达载体上。

更佳地，所述重组表达载体的骨架质粒为pET28a(+)。

所述表达载体转化入合适的宿主菌株之后能够表达上述任意一种融合蛋白或上述任意一种蛋白组合。

本发明的技术方案之五为：提供了一种转化体，所述转化体包括上述的分离的核酸，或上述的重组表达载体。

其中所述转化体优选大肠杆菌为出发菌。

所述大肠杆菌优选E.coli BL21(DE3)。

所述转化体通过发酵可以制得含有上述任意一种融合蛋白或上述任意一种蛋白组合的菌泥以应用于高效制备烟酰胺单核苷酸。

本发明的技术方案之六为：提供了一种制备融合蛋白的方法，培养上述的转化体，使其表达所述融合蛋白，即得。

本发明的技术方案之七为：提供了一种制备NMN的方法，以烟酰胺核糖或其盐、ATP或其盐为原料，使用上述任意一种融合蛋白或上述任意一种蛋白组合来催化反应，以产生NMN。

较佳地，所述反应还包括镁离子、多聚磷酸盐。

更佳地，所述烟酰胺核糖为烟酰胺核糖氯化物，所述ATP或其盐为ATP二钠盐，所述镁离子来自MgCl₂，所述多聚磷酸盐为六偏磷酸钠；所述反应的时间为0.5-2小时；所述反应的pH为4.0-7.0，所述反应的温度为28-40℃。

进一步更佳地，所述反应中，ATP或其盐8mM，镁盐50mM，纯品烟酰胺核糖或烟酰胺核糖氯化物80mM，六偏磷酸钠8mM，加入占反应体积10％～20％的含有上述任意一种融合蛋白或上述任意一种蛋白组合的菌泥，所述反应的时间为1.5-2小时。

和/或，所述pH为5.5，所述反应的温度为40℃。

本发明的技术方案之八为：提供了一种上述任意一种融合蛋白或上述任意一种蛋白组合在制备生产烟酰胺单核苷酸的催化剂中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1、本发明所构筑的融合蛋白或使用的蛋白组合的活性高，直接用粗品NR或其氯化物(纯度为40-50％)就可以完成89％以上的转化。

2、根据公开文献的报道，现有技术中大多数底物浓度不超过50mM，本发明中的底物浓度可以达到80mM，生产效率至少提高了60％。

3、本发明所构筑的融合蛋白不仅实现了将NRK酶和Ppk酶同时以1：1的比例表达得到，而且两个酶的功能亚基间隔不远，即当ATP循环酶将ATP重新再生后，可以立刻用于转化酶将NR催化生成NMN，使得反应效率更高。

4、将NRK酶和Ppk酶的核苷酸序列按照大肠杆菌的最优密码子进行优化，优化后酶的表达效果更好。

附图说明

图1为本发明中利用NRK酶催化NR反应得到NMN，以及在该过程中利用Ppk酶实现ATP循环再生的反应途径示意图。

图2为本发明构建的酶的表达质粒图谱。其中，图2的A为NRK酶表达质粒图谱，图2的B为Ppk酶表达质粒图谱，图2的C为NRK和Ppk融合蛋白表达质粒图谱。

图3为验证所构建的各表达质粒所携带的目的基因能够在细菌体内正常表达的蛋白质胶图。其中，融合蛋白为含有质粒pET28a-融合蛋白的BL21(DE3)菌株表达所得；Ppk为含有质粒pET28a-Ppk的BL21(DE3)菌株表达所得；NRK为含有质粒pET28a-NRK的BL21(DE3)菌株表达所得。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1融合蛋白基因表达菌株的构建

1.先从NCBI上通过功能基因查找的方式获得NRK、Ppk和linker三个蛋白的氨基酸序列：NRK氨基酸序列(SEQ ID NO:1)、Ppk氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和柔性linker的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。

NRK氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

MGFTTGREFHPALRMRAKYNAKYLGTKSEREKYFHLAYNKHTQFLRYQEQIMSKTKEKKVGVIFGKFYPVHTGHINMIYEAFSKVDELHVIVCSDTVRDLKLFYDSKMKRMPTVQDRLRWMQQIFKYQKNQIFIHHLVEDGIPSYPNGWQSWSEAVKTLFHEKHFEPSIVFSSEPQDKAPYEKYLGLEVSLVDPDRTFFNVSATKIRTTPFQYWKFIPKEARPFFAKTVAILGGESSGKSVLVNKLAAVFNTTSAWEYGREFVFEKLGGDEQAMQYSDYPQMALGHQRYIDYAVRHSHKIAFIDTDFITTQAFCIQYEGKAHPFLDSMIKEYPFDVTILLKNNTEWVDDGLRSLGSQKQRQQFQQLLKKLLDKYKVPYIEIESPSYLDRYNQVKAVIEKVLNEEEISELQNTTFPIKGTSQ

Ppk氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

MGQEKLYIEKELSWLSFNERVLQEAADKSNPLIERMRFLGIYSNNLDEFYKVRFAELKRRIIISEEQGSNSHSRHLLGKIQSRVLKADQEFDGLYNELLLEMARNQIFLINERQLSVNQQNWLRHYFKQYLRQHITPILINPDTDLVQFLKDDYTYLAVEIIRGDTIRYALLEIPSDKVPRFVNLPPEAPRRRKPMILLDNILRYCLDDIFKGFFDYDALNAYSMKMTRDAEYDLVHEMEASLMELMSSSLKQRLTAEPVRFVYQRDMPNALVEVLREKLTISRYDSIVPGGRYHNFKDFINFPNVGKANLVNKPLPRLRHIWFDKAQFRNGFDAIRERDVLLYYPYHTFEHVLELLRQASFDPSVLAIKINIYRVAKDSRIIDSMIHAAHNGKKVTVVVELQARFDEEANIHWAKRLTEAGVHVIFSAPGLKIHAKLFLISRKENGEVVRYAHIGTGNFNEKTARLYTDYSLLTADARITNEVRRVFNFIENPYRPVTFDYLMVSPQNSRRLLYEMVDREIANAQQGLPSGITLKLNNLVDKGLVDRLYAASSSGVPVNLLVRGMCSLIPNLEGISDNIRAISIVDRYLEHDRVYIFENGGDKKVYLSSADWMTRNIDYRIEVATPLLDPRLKQRVLDIIDILFSDTVKARYIDKELSNRYVPRGNRRKVRAQLAIYDYIKSLEQPE

柔性linker的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

KESGSVSSEQLAQFRSLD

然后将氨基酸序列翻译成DNA序列，并按照大肠杆菌最优密码子进行优化：获得编码NRK的DNA序列(SEQ ID NO:4)、编码Ppk的DNA序列(SEQ ID NO:5)、编码柔性linker的DNA序列(SEQ ID NO:6)。

编码NRK的DNA序列(SEQ ID NO:4)：

ATGGGTTTTACCACAGGACGGGAGTTCCATCCGGCTCTTAGGATGCGTGCGAAGTATAACGCCAAGTATTTGGGTACCAAGTCAGAACGAGAGAAATACTTTCACCTTGCCTATAACAAGCATACACAATTCCTTCGCTACCAGGAACAGATAATGTCGAAGACAAAGGAAAAAAAGGTGGGCGTGATCTTCGGCAAATTTTACCCGGTTCATACAGGTCACATCAACATGATCTATGAGGCGTTTTCGAAAGTCGATGAATTGCACGTTATTGTGTGCTCGGATACAGTGCGAGATCTCAAGCTGTTTTATGACTCGAAAATGAAACGAATGCCAACCGTACAGGATCGGTTGAGATGGATGCAACAAATCTTCAAATATCAAAAAAATCAGATTTTCATCCATCATCTTGTTGAGGACGGGATACCTTCGTATCCAAACGGCTGGCAGTCATGGAGCGAGGCTGTTAAAACGCTTTTTCACGAGAAACACTTTGAACCATCAATTGTTTTTAGCTCAGAGCCGCAAGACAAGGCTCCTTATGAGAAGTACTTAGGCCTTGAGGTGAGCCTAGTAGATCCAGATAGAACCTTTTTCAATGTTAGTGCGACGAAAATAAGAACTACGCCATTTCAATATTGGAAATTCATTCCTAAAGAAGCTCGTCCTTTTTTCGCGAAGACGGTCGCTATCCTCGGCGGAGAATCATCTGGCAAGTCCGTCTTGGTGAACAAACTTGCAGCAGTATTTAATACAACGTCGGCATGGGAGTATGGGAGAGAGTTTGTGTTCGAGAAACTGGGAGGCGATGAGCAAGCAATGCAATATTCCGACTACCCGCAAATGGCTTTGGGGCACCAAAGGTACATCGACTATGCAGTTCGGCACTCCCATAAAATCGCTTTTATAGATACGGACTTTATTACGACTCAGGCGTTCTGCATACAGTACGAGGGTAAAGCACACCCATTTCTTGATAGCATGATTAAAGAGTATCCCTTCGACGTGACAATACTTTTAAAGAACAACACAGAATGGGTCGATGACGGCTTGCGTTCTCTAGGCTCGCAAAAACAGCGGCAACAGTTTCAACAGCTACTGAAGAAACTACTGGATAAATATAAGGTGCCATATATAGAAATCGAGTCGCCATCGTACCTGGATCGTTATAATCAGGTGAAGGCCGTAATAGAGAAAGTCTTGAACGAAGAGGAAATCTCGGAGCTTCAGAATACCACTTTTCCAATAAAAGGCACCTCCCAA

编码Ppk的DNA序列(SEQ ID NO:5)：

ATGGGACAGGAGAAATTGTATATAGAAAAAGAACTGAGTTGGCTATCGTTCAATGAAAGGGTCCTGCAGGAGGCAGCGGACAAATCTAACCCGCTCATCGAACGCATGCGATTTCTAGGCATCTATTCCAATAATCTAGACGAGTTCTACAAGGTTCGGTTCGCGGAGTTAAAGAGGCGCATCATAATAAGTGAGGAACAAGGAAGCAATTCACACTCCAGGCACCTACTAGGTAAGATCCAATCGAGGGTCCTCAAAGCTGACCAAGAATTCGACGGCTTGTACAACGAATTACTCTTGGAAATGGCCCGTAACCAGATTTTCCTTATTAACGAGAGACAGCTATCCGTTAACCAGCAGAACTGGCTTCGTCATTATTTTAAGCAATATCTGCGTCAGCATATCACGCCTATTTTAATTAACCCCGATACAGACCTGGTGCAGTTCTTGAAGGACGACTACACGTATCTAGCTGTCGAGATAATTAGGGGAGATACTATCAGATACGCCCTTCTCGAGATTCCATCGGATAAGGTGCCACGATTCGTAAATCTTCCCCCGGAGGCCCCACGACGCAGAAAACCGATGATCTTACTGGACAACATTTTGCGATATTGTTTAGACGATATCTTCAAGGGCTTCTTTGACTACGATGCCCTGAATGCTTATTCCATGAAAATGACACGTGATGCTGAGTACGACTTGGTACACGAGATGGAGGCTAGTCTGATGGAACTAATGTCGTCGTCCCTAAAGCAGCGGCTCACAGCGGAGCCCGTCCGATTTGTCTATCAACGTGACATGCCCAATGCACTGGTTGAGGTGCTACGCGAGAAACTGACAATATCTAGATATGATAGTATCGTGCCAGGCGGACGGTATCACAACTTCAAGGACTTCATCAATTTCCCAAATGTTGGAAAGGCCAATTTGGTTAATAAACCCTTACCGCGATTGCGTCACATCTGGTTCGACAAAGCACAGTTCAGAAATGGGTTTGATGCTATACGAGAACGAGACGTTCTTCTATATTACCCATACCACACTTTCGAGCATGTGCTTGAGCTCCTACGGCAAGCATCATTCGACCCTTCTGTATTAGCCATAAAGATAAATATTTACCGAGTCGCTAAGGATTCCCGAATAATCGATAGCATGATACACGCAGCTCATAACGGAAAGAAAGTTACAGTTGTAGTCGAGTTGCAGGCCAGATTTGATGAAGAAGCAAACATACATTGGGCCAAGCGTCTAACTGAAGCAGGCGTACACGTCATCTTTAGCGCACCGGGCCTTAAAATACACGCAAAGCTTTTCTTGATCAGCCGAAAGGAAAATGGGGAGGTAGTGCGTTACGCACATATCGGAACAGGTAACTTCAATGAGAAAACGGCTCGTCTTTATACTGATTACTCGCTATTGACGGCCGATGCGAGGATTACTAATGAAGTTCGCCGAGTTTTCAACTTCATTGAGAATCCTTACCGACCAGTCACCTTCGACTACCTTATGGTTTCTCCACAAAACAGTAGACGTTTGCTTTATGAGATGGTCGATCGGGAGATCGCTAATGCACAACAGGGTCTCCCTAGTGGAATAACTTTAAAACTGAACAACTTGGTTGACAAAGGCTTGGTAGATCGGCTATATGCGGCCTCCAGCAGCGGCGTGCCTGTAAACCTATTGGTACGTGGAATGTGCTCCTTGATACCGAACTTGGAAGGCATCAGCGATAACATTCGGGCTATATCGATTGTAGACCGGTATCTCGAACACGACCGGGTTTATATCTTCGAGAACGGGGGAGACAAGAAGGTATATCTCAGCAGCGCTGACTGGATGACCAGGAATATTGATTACCGTATTGAGGTAGCAACCCCATTATTAGATCCAAGGTTGAAGCAACGGGTTCTAGACATTATTGACATATTGTTTTCGGACACCGTGAAGGCGAGGTATATCGATAAAGAGCTGTCTAACCGATATGTGCCCCGCGGTAATCGAAGGAAGGTGCGTGCTCAACTCGCAATTTACGATTACATTAAATCGTTGGAACAGCCAGAG

编码柔性linker的DNA序列(SEQ ID NO:6)：

AAGGAAAGCGGGAGTGTTTCGAGTGAACAGCTGGCGCAGTTTAGAAGTTTGGAT

将NRK基因(SEQ ID NO:4)通过PCR的方式，首位分别连接上酶切位点BamHI和EcoRI，然后通过酶切连接的方式连接在质粒pET28a上，设计引物如下：

NRK-BamHI-F：cgcGGATCCATGGGTTTTACCACAGGACG(SEQ ID NO:7)

NRK-EcoRI-R：ggccttaagAATTTGGGAGGTGCCTTTTATTGGAA(SEQ ID NO:8)

得到质粒如图2的A所示。

将Ppk基因(SEQ ID NO:5)通过PCR的方式，首位分别连接上酶切位点EcoRI和HindIII，然后通过酶切连接的方式连接在质粒pET28a上，设计引物如下：

Ppk-EcoRI-F：CCGGAATTCATGGGACAGGAGAAATTG(SEQ ID NO:9)

Ppk-HindIII-R：CCCAAGCTTCTCTGGCTGTTCCAACG(SEQ ID NO:10)

得到质粒如图2的B所示。

2.将NRK和Ppk基因序列之间连接上特定的柔性linker(SEQ ID NO:6)，NRK基因和Ppk基因与linker的连接方式为通过overlap PCR(OEPCR)进行连接，其中NRK+linker及linker+Ppk的引物设计如下：

NRK-BamHI-F：cgcGGATCCATGGGTTTTACCACAGGACG(SEQ ID NO:11)

NRK-linker-R：CTCCCGCTTTCCTTTTGGGAGGTGCC(SEQ ID NO:12)

Linker-Ppk-F：GTTTAGAAGTTTGGATGGACAGGAGAAATTG(SEQ ID NO:13)

Ppk-HindIII-R：CCCAAGCTTCTCTGGCTGTTCCAACG(SEQ ID NO:14)

经过OEPCR后，得到首尾分别带有BamHI和HindIII的酶切点位的融合蛋白基因。

3.将重新组合的基因通过酶切连接的方式连接至到表达质粒pET28a(+)上，构建所得表达融合蛋白的质粒图谱如图2的C所示。

4.将表达质粒通过转化入具有外源基因功能表达的细菌大肠杆菌BL21(DE3)体内；

5.通过蛋白质电泳验证所构建的各表达质粒所携带的目的基因能够在细菌体内正常表达，蛋白质胶图如图3所示。

实施例2发酵生产融合蛋白

1、发酵过程：

1)将单菌落接种于在含有酵母粉、蛋白胨及氯化钠的培养基中，摇瓶培养37℃培养8h。

2)将一级摇瓶扩大培养至二级摇瓶，37℃培养3～7h。

3)二级摇瓶接种于含有蛋白胨、酵母粉、甘油、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化铵、无水硫酸钠、硫酸镁、消泡剂的培养基中，37℃发酵培养6-10h，过程补充氨水和甘油。

4)发酵液菌体OD600＝20～30时加入IPTG(IPTG终浓度在1mM)，25℃培养，培养过程保持溶氧在25～40％，甘油浓度在2g/L左右，至发酵结束。

2、发酵结束后，将发酵液在7000×g的离心力下，离心10min，收集沉淀，并将沉淀于-20℃冰箱中冷藏24小时以上，室温化冻后得到菌泥，当直接用新鲜发酵的细菌时，则需要对细菌进行超声或均质等破壁处理，得到破壁后的菌泥。

实施例3NR纯品制备NMN

分别使用如下六种反应体系(反应体系a，b，c，d，e和f)，催化NR纯品制备NMN。反应如图1所示。

反应体系a(单独使用NRK酶的反应体系，SEQ ID NO:4):

ATP或其盐8mM，镁盐50mM，纯品NR 80mM，六偏磷酸或其盐8mM，将其配置成溶液后，调节溶液pH为5.5，加入反应体积的10％的来源于流感嗜血杆菌的NRK酶的菌泥，保持反应温度为40℃，进行反应，以HPLC监控NMN的产量，由此计算NR至NMN的转化率。转化2h后，将反应液通过离心去除酶，依次经阴离子树脂和阳离子树脂脱除反应液中残留的ATP及其系列物(ADP、AMP)，脱除过程中，用HPLC监控经过树脂后液体中ATP及其系列物的残留情况，HPLC中ATP及其系列物残留量≤0.05％，视为脱除完成，计算所使用的树脂体积。

反应体系b(使用一菌双酶的反应体系，SEQ ID NO:4+SEQ ID NO:

5):

本反应体系加入的酶为反应体积的10％的含有NRK酶和Ppk酶的菌泥，其他反应条件与反应体系a完全相同。

反应体系c(使用融合蛋白酶的反应体系，SEQ ID NO:4+SEQ ID NO:6+SEQ ID NO:5):

本反应体系加入的酶为反应体积的10％的融合蛋白的菌泥，其他反应条件与反应体系a完全相同。

反应体系d(使用来源于马克斯克鲁维酵母的NRK酶和来源于大肠杆菌的Ppk酶组合的反应体系，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:5):

本反应体系加入的酶为反应体积的10％的来源于马克斯克鲁维酵母的含有NRK酶的菌泥，和反应体积的10％的来源于大肠杆菌的含有Ppk酶的菌泥，其他反应条件与反应体系a完全相同。

反应体系e(使用来源于马克斯克鲁维酵母的NRK酶和来源于铜绿假单杆菌的Ppk酶组合的反应体系，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17):

本反应体系加入的酶为反应体积的10％的来源于马克斯克鲁维酵母的NRK酶的菌泥，和反应体积的10％的来源于铜绿假单杆菌Ppk酶的菌泥，其他反应条件与反应体系a完全相同。

反应体系f(使用来源于流感嗜血杆菌的NRK酶和来源于大肠杆菌的Ppk酶组合的反应体系，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5):

本反应体系加入的酶为反应体积的10％的来源于流感嗜血杆菌的NRK酶的菌泥，和反应体积的10％的来源于大肠杆菌Ppk酶的菌泥，其他反应条件与反应体系a完全相同。

在单一变量下，测定并计算六种反应体系的NR的转化率、每100g脱除ATP后的产品需要的阴离子树脂和阳离子树脂的使用量，结果如下表所示：

由实施例3可以看出，当以纯品NR为底物，单独使用NRK酶时，NR的催化转化率过低(a体系，11.2％)，本发明构筑的双菌双酶体系(f体系)的蛋白组合的催化转化率可达92.3％，优于其他的蛋白组合(d体系的72.4％和e体系的82.5％)，而当将该组合构筑成非融合蛋白的一菌双酶体系(b体系)后催化转化率更佳(95.5％)，当将该组合构筑成融合蛋白的一菌双酶体系(c体系)后催化转化率最佳(99.8％)。此外，相比于本实施例中的其他反应体系，融合蛋白(c体系)的阴阳离子树脂使用量最低，降低了生产过程的成本。同样可以看出，在底物浓度为80mM的条件下，仅来源于流感嗜血杆菌的NRK酶和来源于大肠杆菌的Ppk酶组合，其转化效率能够达到90％以上，其他来源的酶催化效率及活性均不及来源于流感嗜血杆菌的NRK酶和来源于大肠杆菌的Ppk酶组合。另外，通过转化率和阴离子和阳离子树脂的用量对比，我们可以发现，转化率越高，纯化所需要的树脂用量更低。

实施例4含量为40％NR氯化物粗品制备NMN

分别使用如下六种反应体系(反应体系a1，b1，c1，d1，e1和f1)，催化含量为40％NR氯化物制备NMN。反应体系中加入的物质的量，均按粗品NR中实际包含的纯品NR的物质的量计算。

反应体系a1(单独使用NRK酶的反应体系，SEQ ID NO:4):

ATP或其盐80mM，镁盐50mM，含量为40％NR氯化物80mM，将其配置成溶液后，调节溶液pH为5.5，加入反应体积的20％的源于流感嗜血杆菌的NRK酶的菌泥，保持反应温度为40℃，进行反应，以HPLC监控NMN的产量，由此计算NR至NMN的转化率。转化2h后，将反应液通过超滤去除酶，依次经阴离子树脂和阳离子树脂脱除反应液中残留的ATP及其系列物(ADP、AMP)，脱除过程中，用HPLC监控经过树脂后液体中ATP及其系列物的残留情况，HPLC中ATP及其系列物残留量≤0.05％，视为脱除完成，计算所使用的树脂体积。

反应体系b1(使用一菌双酶的反应体系，SEQ ID NO:4+SEQ ID NO:5):

本反应体系加入的ATP或其盐为8mM，加入的酶为反应体积的20％的含有NRK酶和Ppk酶的菌泥，其他反应条件与反应体系a1完全相同。

反应体系c1(使用融合蛋白酶的反应体系，SEQ ID NO:4+SEQ ID NO:6+SEQ IDNO:5):

本反应体系加入的ATP或其盐为8mM，加入的酶为反应体积的20％的融合蛋白的菌泥，其他反应条件与反应体系a1完全相同。

反应体系d1(使用来源于马克斯克鲁维酵母的NRK酶和来源于大肠杆菌的Ppk酶组合的反应体系，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:5)：

本反应体系加入的ATP或其盐为8mM，加入的酶为反应体积的20％的来源于马克斯克鲁维酵母的含有NRK酶的菌泥，和反应体积的20％的来源于大肠杆菌的含有Ppk酶的菌泥，其他反应条件与反应体系a1完全相同。

反应体系e1(使用来源于马克斯克鲁维酵母的NRK酶和来源于铜绿假单杆菌的Ppk酶组合的反应体系，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17):

本反应体系加入的ATP或其盐为8mM，加入的酶为反应体积的20％的来源于马克斯克鲁维酵母的NRK酶的菌泥，和反应体积的20％的来源于铜绿假单杆菌Ppk酶的菌泥，其他反应条件与反应体系a1完全相同。

反应体系f1(使用来源于流感嗜血杆菌的NRK酶和来源于大肠杆菌的Ppk酶组合的反应体系，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5):

本反应体系加入的ATP或其盐为8mM，加入的酶为反应体积的20％的来源于流感嗜血杆菌的NRK酶的菌泥，和反应体积的20％的来源于大肠杆菌Ppk酶的菌泥，其他反应条件与反应体系a1完全相同。

测定并计算六种反应体系的NR的转化率、每100g脱除ATP后的产品需要的阴离子树脂和阳离子树脂的使用量，结果如下表所示：

由实施例4可以看出，以含量为40％NR氯化物为底物时，同等条件下，仅加入NRK酶的体系中，即使加入1个当量的ATP，转化率也只能达到10.1％，而以现有技术中的酶组合(d1体系)，产率仅为67.2％，而以本发明所述的酶组合(f1体系)，产率可达89.3％，另外，若将本发明所述的酶组合，以linker相连，构成一个融合蛋白(c1体系)，产率则可以达到96.7％。此外，相比于本实施例中的其他反应体系，融合蛋白(c1体系)的阴阳离子树脂使用量最低，降低了生产过程的成本。

实施例5以融合蛋白酶(SEQ ID NO:4+SEQ ID NO:6+SEQ ID NO:5)或融合蛋白酶(SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:6+SEQ ID NO:17)催化含量为70％NR氯化物制备NMN，筛选最佳反应时间

分别使用如下五种反应体系(反应体系a2，b2，c2和d2、e2)，催化含量为70％NR氯化物制备NMN。反应体系中加入的物质的量，均按粗品NR氯化物中实际包含的纯品NR的物质的量计算。

反应体系a2：

以融合蛋白酶(SEQ ID NO:4+SEQ ID NO:6+SEQ ID NO:5)催化含量为70％NR氯化物制备NMN，ATP或其盐8mM，镁盐50mM，含量为70％NR氯化物80mM，六偏磷酸或其盐8mM，将其配置成溶液后，调节溶液pH为5.5，加入反应体积的10％的融合蛋白的菌泥，保持反应温度为40℃，进行反应，以HPLC监控NMN的产量，由此计算NR至NMN的转化率。转化30min后，将反应液通过超滤去除酶，依次经阴离子树脂和阳离子树脂脱除反应液中残留的ATP及其系列物(ADP、AMP)，脱除过程中，用HPLC监控经过树脂后液体中ATP及其系列物的残留情况，HPLC中ATP及其系列物残留量≤0.05％，视为脱除完成，计算所使用的树脂体积。

反应体系b2：

将反应体系a2中的转化时间设置为1h，其他条件完全相同。

反应体系c2：

将反应体系a2中的转化时间设置为90min，其他条件完全相同。

反应体系d2：

将反应体系a2中的转化时间设置为2h，其他条件完全相同。

反应体系e2：

以融合蛋白酶(SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:6+SEQ ID NO:17)催化含量为70％NR氯化物制备NMN，ATP或其盐8mM，镁盐50mM，含量为70％NR氯化物80mM，六偏磷酸或其盐8mM，将其配置成溶液后，调节溶液pH为5.5，加入反应体积的10％的融合蛋白的菌泥，保持反应温度为40℃，进行反应，以HPLC监控NMN的产量，由此计算NR至NMN的转化率。转化1.5h后，将反应液通过超滤去除酶，依次经阴离子树脂和阳离子树脂脱除反应液中残留的ATP及其系列物(ADP、AMP)，脱除过程中，用HPLC监控经过树脂后液体中ATP及其系列物的残留情况，HPLC中ATP及其系列物残留量≤0.05％，视为脱除完成，计算所使用的树脂体积。

测定并计算五种反应体系的NR的转化率、每100g脱除ATP后的产品需要的阴离子树脂和阳离子树脂的使用量，结果如下表所示：

由实施例5可以看出，融合蛋白的催化效率非常高，即使含量为70％NR氯化物为反应原料，仅需加入反应体积的10％的融合蛋白的菌泥，转化1.5个小时，原料就可以基本转化完毕(c2体系)。而其他的来源的蛋白，含量为70％NR氯化物为反应原料，其转化效率非常低，仅为36.7％，说明原料中杂质对酶活影响很大。

实施例6不同linker连接所得融合蛋白制备NMN

分别使用如下四种融合蛋白(其融合蛋白分别为a3，b3，c3和d3)，催化纯品NR氯化物制备NMN。

融合蛋白a3(酶的连接顺序为：来源于流感嗜血杆菌的NRK酶+柔性linker+来源于大肠杆菌的Ppk酶，即SEQ ID NO:4+SEQ ID NO:6+SEQ ID NO:5):

其反应体系为：ATP或其盐8mM，镁盐50mM，NR氯化物80mM，将其配置成溶液后，调节溶液pH为5.5，加入反应体积的20％的融合蛋白a3的菌泥，保持反应温度为40℃，进行反应，以HPLC监控NMN的产量，由此计算NR至NMN的转化率。转化2h后，将反应液通过超滤去除酶，依次经阴离子树脂和阳离子树脂脱除反应液中残留的ATP及其系列物(ADP、AMP)，脱除过程中，用HPLC监控经过树脂后液体中ATP及其系列物的残留情况，HPLC中ATP及其系列物残留量≤0.05％，视为脱除完成，计算所使用的树脂体积。

融合蛋白b3(酶的连接顺序为：来源于大肠杆菌的Ppk酶+柔性linker+来源于流感嗜血杆菌的NRK酶，即SEQ ID NO:5+SEQ ID NO:6+SEQ ID NO:4):

其反应体系中加入的酶为反应体积的20％的融合蛋白b3的菌泥，其他反应条件与本实施例中加入融合蛋白a3的反应体系完全相同。

融合蛋白c3(酶的连接顺序为：来源于流感嗜血杆菌的NRK酶+刚性linker+来源于大肠杆菌的Ppk酶，即SEQ ID NO:4+SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:5):

其中，编码刚性linker的DNA序列(SEQ ID NO:15)：

GAAGCGGCGGCAAAA

其反应体系中加入的酶为反应体积的20％的融合蛋白c3的菌泥，其他反应条件与本实施例中加入融合蛋白a3的反应体系完全相同。

融合蛋白d3(酶的连接顺序为：来源于大肠杆菌的Ppk酶+刚性linker+来源于流感嗜血杆菌的NRK酶，即SEQ ID NO:5+SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:4):

其反应体系中加入的酶为反应体积的20％的融合蛋白d3的菌泥，其他反应条件与本实施例中加入融合蛋白a3的反应体系完全相同。

测定并计算四种反应体系的NR的转化率、每100g脱除ATP后的产品需要的阴离子树脂和阳离子树脂的使用量，结果如下表所示：

由实施例6可以看出，同等条件下，不同linker连接，以及酶连接顺序不同的融合蛋白，其转化率也有较大的差异，以柔性linker将酶进行连接，两个酶功能不受到影响，且其转化效率最高，以刚性linker将酶进行连接，将导致酶活性亚基功能受到影响，导致酶活力下降。

实施例7反应温度和pH的研究

反应体系a4：

ATP或其盐8mM，镁盐50mM，NR氯化物80mM，将其配置成溶液后，调节溶液pH为5.5，加入反应体积的20％的融合蛋白a3(来源于流感嗜血杆菌的NRK酶+柔性linker+来源于大肠杆菌的Ppk酶，即SEQ ID NO:4+SEQ ID NO:6+SEQ ID NO:5)的菌泥，保持反应温度为40℃，进行反应，以HPLC监控NMN的产量，由此计算NR至NMN的转化率。转化2h后，将反应液通过超滤去除酶，依次经阴离子树脂和阳离子树脂脱除反应液中残留的ATP及其系列物(ADP、AMP)，脱除过程中，用HPLC监控经过树脂后液体中ATP及其系列物的残留情况，HPLC中ATP及其系列物残留量≤0.05％，视为脱除完成，计算所使用的树脂体积。

反应体系b4：

本反应体系调节溶液pH为7.0，反应温度为35℃，其他反应条件与反应体系a4完全相同。

反应体系c4：

本反应体系调节溶液pH为6.5，反应温度为30℃，其他反应条件与反应体系a4完全相同。

反应体系d4：

本反应体系调节溶液pH为4.0，反应温度为28℃，其他反应条件与反应体系a4完全相同。

实施例3-6中的酶催化反应，均在pH为5.5，反应温度为40℃条件下进行，在实施例7中我们也尝试了其他反应条件，由反应体系a4-d4结果来看，pH在4.0-7.0之间，温度在28-40℃之间，相应的酶催化反应也均能进行。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北远大生命科学与技术有限责任公司

<120> 一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法及融合蛋白

<130> P21016264C

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 421

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 1

Met Gly Phe Thr Thr Gly Arg Glu Phe His Pro Ala Leu Arg Met Arg

1 5 10 15

Ala Lys Tyr Asn Ala Lys Tyr Leu Gly Thr Lys Ser Glu Arg Glu Lys

20 25 30

Tyr Phe His Leu Ala Tyr Asn Lys His Thr Gln Phe Leu Arg Tyr Gln

35 40 45

Glu Gln Ile Met Ser Lys Thr Lys Glu Lys Lys Val Gly Val Ile Phe

50 55 60

Gly Lys Phe Tyr Pro Val His Thr Gly His Ile Asn Met Ile Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Phe Ser Lys Val Asp Glu Leu His Val Ile Val Cys Ser Asp Thr

85 90 95

Val Arg Asp Leu Lys Leu Phe Tyr Asp Ser Lys Met Lys Arg Met Pro

100 105 110

Thr Val Gln Asp Arg Leu Arg Trp Met Gln Gln Ile Phe Lys Tyr Gln

115 120 125

Lys Asn Gln Ile Phe Ile His His Leu Val Glu Asp Gly Ile Pro Ser

130 135 140

Tyr Pro Asn Gly Trp Gln Ser Trp Ser Glu Ala Val Lys Thr Leu Phe

145 150 155 160

His Glu Lys His Phe Glu Pro Ser Ile Val Phe Ser Ser Glu Pro Gln

165 170 175

Asp Lys Ala Pro Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Leu Glu Val Ser Leu Val

180 185 190

Asp Pro Asp Arg Thr Phe Phe Asn Val Ser Ala Thr Lys Ile Arg Thr

195 200 205

Thr Pro Phe Gln Tyr Trp Lys Phe Ile Pro Lys Glu Ala Arg Pro Phe

210 215 220

Phe Ala Lys Thr Val Ala Ile Leu Gly Gly Glu Ser Ser Gly Lys Ser

225 230 235 240

Val Leu Val Asn Lys Leu Ala Ala Val Phe Asn Thr Thr Ser Ala Trp

245 250 255

Glu Tyr Gly Arg Glu Phe Val Phe Glu Lys Leu Gly Gly Asp Glu Gln

260 265 270

Ala Met Gln Tyr Ser Asp Tyr Pro Gln Met Ala Leu Gly His Gln Arg

275 280 285

Tyr Ile Asp Tyr Ala Val Arg His Ser His Lys Ile Ala Phe Ile Asp

290 295 300

Thr Asp Phe Ile Thr Thr Gln Ala Phe Cys Ile Gln Tyr Glu Gly Lys

305 310 315 320

Ala His Pro Phe Leu Asp Ser Met Ile Lys Glu Tyr Pro Phe Asp Val

325 330 335

Thr Ile Leu Leu Lys Asn Asn Thr Glu Trp Val Asp Asp Gly Leu Arg

340 345 350

Ser Leu Gly Ser Gln Lys Gln Arg Gln Gln Phe Gln Gln Leu Leu Lys

355 360 365

Lys Leu Leu Asp Lys Tyr Lys Val Pro Tyr Ile Glu Ile Glu Ser Pro

370 375 380

Ser Tyr Leu Asp Arg Tyr Asn Gln Val Lys Ala Val Ile Glu Lys Val

385 390 395 400

Leu Asn Glu Glu Glu Ile Ser Glu Leu Gln Asn Thr Thr Phe Pro Ile

405 410 415

Lys Gly Thr Ser Gln

420

<210> 2

<211> 688

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

Met Gly Gln Glu Lys Leu Tyr Ile Glu Lys Glu Leu Ser Trp Leu Ser

1 5 10 15

Phe Asn Glu Arg Val Leu Gln Glu Ala Ala Asp Lys Ser Asn Pro Leu

20 25 30

Ile Glu Arg Met Arg Phe Leu Gly Ile Tyr Ser Asn Asn Leu Asp Glu

35 40 45

Phe Tyr Lys Val Arg Phe Ala Glu Leu Lys Arg Arg Ile Ile Ile Ser

50 55 60

Glu Glu Gln Gly Ser Asn Ser His Ser Arg His Leu Leu Gly Lys Ile

65 70 75 80

Gln Ser Arg Val Leu Lys Ala Asp Gln Glu Phe Asp Gly Leu Tyr Asn

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Met Ala Arg Asn Gln Ile Phe Leu Ile Asn Glu

100 105 110

Arg Gln Leu Ser Val Asn Gln Gln Asn Trp Leu Arg His Tyr Phe Lys

115 120 125

Gln Tyr Leu Arg Gln His Ile Thr Pro Ile Leu Ile Asn Pro Asp Thr

130 135 140

Asp Leu Val Gln Phe Leu Lys Asp Asp Tyr Thr Tyr Leu Ala Val Glu

145 150 155 160

Ile Ile Arg Gly Asp Thr Ile Arg Tyr Ala Leu Leu Glu Ile Pro Ser

165 170 175

Asp Lys Val Pro Arg Phe Val Asn Leu Pro Pro Glu Ala Pro Arg Arg

180 185 190

Arg Lys Pro Met Ile Leu Leu Asp Asn Ile Leu Arg Tyr Cys Leu Asp

195 200 205

Asp Ile Phe Lys Gly Phe Phe Asp Tyr Asp Ala Leu Asn Ala Tyr Ser

210 215 220

Met Lys Met Thr Arg Asp Ala Glu Tyr Asp Leu Val His Glu Met Glu

225 230 235 240

Ala Ser Leu Met Glu Leu Met Ser Ser Ser Leu Lys Gln Arg Leu Thr

245 250 255

Ala Glu Pro Val Arg Phe Val Tyr Gln Arg Asp Met Pro Asn Ala Leu

260 265 270

Val Glu Val Leu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Ser Arg Tyr Asp Ser Ile

275 280 285

Val Pro Gly Gly Arg Tyr His Asn Phe Lys Asp Phe Ile Asn Phe Pro

290 295 300

Asn Val Gly Lys Ala Asn Leu Val Asn Lys Pro Leu Pro Arg Leu Arg

305 310 315 320

His Ile Trp Phe Asp Lys Ala Gln Phe Arg Asn Gly Phe Asp Ala Ile

325 330 335

Arg Glu Arg Asp Val Leu Leu Tyr Tyr Pro Tyr His Thr Phe Glu His

340 345 350

Val Leu Glu Leu Leu Arg Gln Ala Ser Phe Asp Pro Ser Val Leu Ala

355 360 365

Ile Lys Ile Asn Ile Tyr Arg Val Ala Lys Asp Ser Arg Ile Ile Asp

370 375 380

Ser Met Ile His Ala Ala His Asn Gly Lys Lys Val Thr Val Val Val

385 390 395 400

Glu Leu Gln Ala Arg Phe Asp Glu Glu Ala Asn Ile His Trp Ala Lys

405 410 415

Arg Leu Thr Glu Ala Gly Val His Val Ile Phe Ser Ala Pro Gly Leu

420 425 430

Lys Ile His Ala Lys Leu Phe Leu Ile Ser Arg Lys Glu Asn Gly Glu

435 440 445

Val Val Arg Tyr Ala His Ile Gly Thr Gly Asn Phe Asn Glu Lys Thr

450 455 460

Ala Arg Leu Tyr Thr Asp Tyr Ser Leu Leu Thr Ala Asp Ala Arg Ile

465 470 475 480

Thr Asn Glu Val Arg Arg Val Phe Asn Phe Ile Glu Asn Pro Tyr Arg

485 490 495

Pro Val Thr Phe Asp Tyr Leu Met Val Ser Pro Gln Asn Ser Arg Arg

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Met Val Asp Arg Glu Ile Ala Asn Ala Gln Gln Gly

515 520 525

Leu Pro Ser Gly Ile Thr Leu Lys Leu Asn Asn Leu Val Asp Lys Gly

530 535 540

Leu Val Asp Arg Leu Tyr Ala Ala Ser Ser Ser Gly Val Pro Val Asn

545 550 555 560

Leu Leu Val Arg Gly Met Cys Ser Leu Ile Pro Asn Leu Glu Gly Ile

565 570 575

Ser Asp Asn Ile Arg Ala Ile Ser Ile Val Asp Arg Tyr Leu Glu His

580 585 590

Asp Arg Val Tyr Ile Phe Glu Asn Gly Gly Asp Lys Lys Val Tyr Leu

595 600 605

Ser Ser Ala Asp Trp Met Thr Arg Asn Ile Asp Tyr Arg Ile Glu Val

610 615 620

Ala Thr Pro Leu Leu Asp Pro Arg Leu Lys Gln Arg Val Leu Asp Ile

625 630 635 640

Ile Asp Ile Leu Phe Ser Asp Thr Val Lys Ala Arg Tyr Ile Asp Lys

645 650 655

Glu Leu Ser Asn Arg Tyr Val Pro Arg Gly Asn Arg Arg Lys Val Arg

660 665 670

Ala Gln Leu Ala Ile Tyr Asp Tyr Ile Lys Ser Leu Glu Gln Pro Glu

675 680 685

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 柔性linker的氨基酸序列

<400> 3

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser

1 5 10 15

Leu Asp

<210> 4

<211> 1263

<212> DNA

<213> Haemophilus influenzae

<400> 4

atgggtttta ccacaggacg ggagttccat ccggctctta ggatgcgtgc gaagtataac 60

gccaagtatt tgggtaccaa gtcagaacga gagaaatact ttcaccttgc ctataacaag 120

catacacaat tccttcgcta ccaggaacag ataatgtcga agacaaagga aaaaaaggtg 180

ggcgtgatct tcggcaaatt ttacccggtt catacaggtc acatcaacat gatctatgag 240

gcgttttcga aagtcgatga attgcacgtt attgtgtgct cggatacagt gcgagatctc 300

aagctgtttt atgactcgaa aatgaaacga atgccaaccg tacaggatcg gttgagatgg 360

atgcaacaaa tcttcaaata tcaaaaaaat cagattttca tccatcatct tgttgaggac 420

gggatacctt cgtatccaaa cggctggcag tcatggagcg aggctgttaa aacgcttttt 480

cacgagaaac actttgaacc atcaattgtt tttagctcag agccgcaaga caaggctcct 540

tatgagaagt acttaggcct tgaggtgagc ctagtagatc cagatagaac ctttttcaat 600

gttagtgcga cgaaaataag aactacgcca tttcaatatt ggaaattcat tcctaaagaa 660

gctcgtcctt ttttcgcgaa gacggtcgct atcctcggcg gagaatcatc tggcaagtcc 720

gtcttggtga acaaacttgc agcagtattt aatacaacgt cggcatggga gtatgggaga 780

gagtttgtgt tcgagaaact gggaggcgat gagcaagcaa tgcaatattc cgactacccg 840

caaatggctt tggggcacca aaggtacatc gactatgcag ttcggcactc ccataaaatc 900

gcttttatag atacggactt tattacgact caggcgttct gcatacagta cgagggtaaa 960

gcacacccat ttcttgatag catgattaaa gagtatccct tcgacgtgac aatactttta 1020

aagaacaaca cagaatgggt cgatgacggc ttgcgttctc taggctcgca aaaacagcgg 1080

caacagtttc aacagctact gaagaaacta ctggataaat ataaggtgcc atatatagaa 1140

atcgagtcgc catcgtacct ggatcgttat aatcaggtga aggccgtaat agagaaagtc 1200

ttgaacgaag aggaaatctc ggagcttcag aataccactt ttccaataaa aggcacctcc 1260

caa 1263

<210> 5

<211> 2064

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 5

atgggacagg agaaattgta tatagaaaaa gaactgagtt ggctatcgtt caatgaaagg 60

gtcctgcagg aggcagcgga caaatctaac ccgctcatcg aacgcatgcg atttctaggc 120

atctattcca ataatctaga cgagttctac aaggttcggt tcgcggagtt aaagaggcgc 180

atcataataa gtgaggaaca aggaagcaat tcacactcca ggcacctact aggtaagatc 240

caatcgaggg tcctcaaagc tgaccaagaa ttcgacggct tgtacaacga attactcttg 300

gaaatggccc gtaaccagat tttccttatt aacgagagac agctatccgt taaccagcag 360

aactggcttc gtcattattt taagcaatat ctgcgtcagc atatcacgcc tattttaatt 420

aaccccgata cagacctggt gcagttcttg aaggacgact acacgtatct agctgtcgag 480

ataattaggg gagatactat cagatacgcc cttctcgaga ttccatcgga taaggtgcca 540

cgattcgtaa atcttccccc ggaggcccca cgacgcagaa aaccgatgat cttactggac 600

aacattttgc gatattgttt agacgatatc ttcaagggct tctttgacta cgatgccctg 660

aatgcttatt ccatgaaaat gacacgtgat gctgagtacg acttggtaca cgagatggag 720

gctagtctga tggaactaat gtcgtcgtcc ctaaagcagc ggctcacagc ggagcccgtc 780

cgatttgtct atcaacgtga catgcccaat gcactggttg aggtgctacg cgagaaactg 840

acaatatcta gatatgatag tatcgtgcca ggcggacggt atcacaactt caaggacttc 900

atcaatttcc caaatgttgg aaaggccaat ttggttaata aacccttacc gcgattgcgt 960

cacatctggt tcgacaaagc acagttcaga aatgggtttg atgctatacg agaacgagac 1020

gttcttctat attacccata ccacactttc gagcatgtgc ttgagctcct acggcaagca 1080

tcattcgacc cttctgtatt agccataaag ataaatattt accgagtcgc taaggattcc 1140

cgaataatcg atagcatgat acacgcagct cataacggaa agaaagttac agttgtagtc 1200

gagttgcagg ccagatttga tgaagaagca aacatacatt gggccaagcg tctaactgaa 1260

gcaggcgtac acgtcatctt tagcgcaccg ggccttaaaa tacacgcaaa gcttttcttg 1320

atcagccgaa aggaaaatgg ggaggtagtg cgttacgcac atatcggaac aggtaacttc 1380

aatgagaaaa cggctcgtct ttatactgat tactcgctat tgacggccga tgcgaggatt 1440

actaatgaag ttcgccgagt tttcaacttc attgagaatc cttaccgacc agtcaccttc 1500

gactacctta tggtttctcc acaaaacagt agacgtttgc tttatgagat ggtcgatcgg 1560

gagatcgcta atgcacaaca gggtctccct agtggaataa ctttaaaact gaacaacttg 1620

gttgacaaag gcttggtaga tcggctatat gcggcctcca gcagcggcgt gcctgtaaac 1680

ctattggtac gtggaatgtg ctccttgata ccgaacttgg aaggcatcag cgataacatt 1740

cgggctatat cgattgtaga ccggtatctc gaacacgacc gggtttatat cttcgagaac 1800

gggggagaca agaaggtata tctcagcagc gctgactgga tgaccaggaa tattgattac 1860

cgtattgagg tagcaacccc attattagat ccaaggttga agcaacgggt tctagacatt 1920

attgacatat tgttttcgga caccgtgaag gcgaggtata tcgataaaga gctgtctaac 1980

cgatatgtgc cccgcggtaa tcgaaggaag gtgcgtgctc aactcgcaat ttacgattac 2040

attaaatcgt tggaacagcc agag 2064

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码柔性linker的DNA序列

<400> 6

aaggaaagcg ggagtgtttc gagtgaacag ctggcgcagt ttagaagttt ggat 54

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物 NRK-BamHI-F

<400> 7

cgcggatcca tgggttttac cacaggacg 29

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物 NRK-EcoRI-R

<400> 8

ggccttaaga atttgggagg tgccttttat tggaa 35

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物 Ppk-EcoRI-F

<400> 9

ccggaattca tgggacagga gaaattg 27

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物 Ppk-HindIII-R

<400> 10

cccaagcttc tctggctgtt ccaacg 26

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物 NRK-BamHI-F

<400> 11

cgcggatcca tgggttttac cacaggacg 29

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物 NRK-linker-R

<400> 12

ctcccgcttt ccttttggga ggtgcc 26

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物 linker-Ppk-F

<400> 13

gtttagaagt ttggatggac aggagaaatt g 31

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物 Ppk-HindIII-R

<400> 14

cccaagcttc tctggctgtt ccaacg 26

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 刚性linker的DNA序列

<400> 15

gaagcggcgg caaaa 15

<210> 16

<211> 717

<212> DNA

<213> Kluyveromyces marxianus

<400> 16

atgaccacca ccaaagtgaa actgattgcg attagcggct gcagcagcag cggcaaaacc 60

accctggcga aatttctggc gaacgcgatt ccgggctgca ttctgattca tgaagatgat 120

ttttataaac cggatagcga aattccgatt aacgaaaaat atggcgtggc ggattgggat 180

tgcccggaag cgctggatct ggatgcgttt aaacgcgaac tggatctgat taaaaccacc 240

ggcagcatta aaaccaaact gattcataac gaaaacgtgg atgatattgg caaatttaac 300

attaaacagg aagattggga tgcgctgcgc gcgaaactga gcagcgtgat tgaaagcgat 360

ctgaaagtgg tgctggtgga tggctttatg atttttaacg atgaagaact gatgaaaaaa 420

tttgatattc gcatttttgt gcgcgcgccg tatgaagtgc tgagccgccg ccgccatgcg 480

cgcgcgggct ataaaaccct ggaatcgttt tgggtggatc cgccgtatta ttttgatgaa 540

tttgtgtatc gcgcgtatcg cgaagaacat aaacatctgt ttgtgaacga agatgtggaa 600

ggcagcctgc gcagcgatgc gggcctgttt gaactgatta acgatgatga aaccgaaatt 660

accaaagcgc tgaacaccat tgcggattat attgtgagcc atctggatgc gaactaa 717

<210> 17

<211> 1293

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 17

atggaaacat cggagcgcgg cttgggtttg cctagaactc atcgcgtcgc tctgagtgag 60

agaccacgcc cgcgaagcga gaggcctaga gggttaggac tgaatccccg cgccttagcg 120

gctcttgcag gattgaaccc acgcgcactt gccctttatt cccctagggc gctcgctgcg 180

cgagggccca gagcgctagc agcgctcgct gcgcggggtg cgcgtggggc acttgcacct 240

agagcccgag gtttgtacag tccaagggct cttgccacac accgagcccg gggagcgcgc 300

ggtccaaggg cgcgaggagt cgcactagct ctggcgtcag agcgccctcg tgcgctggcc 360

gggctaaacc tttacagcgc cctagccgcc aggggtgggc tcggcctgat attggaggga 420

ttaaacgcct tagccattct ggagtccgaa cgcggtctaa atctctattc ccctcgcgtc 480

gcccttgcgc tcgccttgga agggttaaac gtagctctcg ctttagcatc agaaagggcc 540

ctcgccccgc gtcatatcag cggtctatac tcggagcgaa gcgagcgagg actagcttcg 600

cccagcgagc ggacgcacag gtccgagcgc gcactagcga gtgaacgatt ggagccgcgc 660

gcgctagcag ccagcaatac atataggcca aggacatacc ggcacatcag tacccaccga 720

gcacggggga tggaaacagc gagaggtgct cggggcgcta gtaatgggct cacttaccgg 780

ggtctcctat attctgccct ggcgctatat tcccatatta gcgcgtctcc tctggaggga 840

ttaaacattc tagaaggcct gttggagctg gaactatatt cggtagcact gggtttgaac 900

tctgaacgga cacgccccgt agcactattg tatagcgggt taacacatcg tgggttgtac 960

ggcctaaatg cccgaggtgt agcactcgtc gcgctagtag ccttattgga accccatgaa 1020

gggctcgggt tatatgcccg cggggcaagt ccggcacttg ccgctttggc cggtttgtat 1080

ctgtattccg gcctgtacgg gttgtatacc catcggatcc tggaactata ctcagcgcgt 1140

ggaccccatg agatggagac tggtcttcat atcagtttag aggcatcaaa tcctagggcg 1200

cggggtggac tatatgctct ggcagcaagg ggcatattgg aggtagcttt ggcgctggcg 1260

ttagaagggt tattgtacag tccacggtcg gag 1293

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述ATP循环酶为多聚磷酸激酶Ppk；

较佳地，所述Ppk来源于大肠杆菌，所述NRK来源于流感嗜血杆菌；

更佳地，所述NRK的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Ppk的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述NRK与Ppk之间有或没有通过连接子L连接；

较佳地，所述融合蛋白的结构为NRK-L-Ppk或Ppk-L-NRK；

和/或，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.一种蛋白组合，其特征在于，其包括如权利要求2所述的融合蛋白中的烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。

5.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～3任一项所述的融合蛋白，或如权利要求4所述的蛋白组合；优选地，当所述分离的核酸包括NRK、Ppk和/或L时，编码所述NRK的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；编码所述Ppk的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码所述L的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求5所述的分离的核酸；

较佳地，所述NRK和Ppk在同一个重组表达载体上；更佳地，所述重组表达载体的骨架质粒为pET28a(+)。

7.一种转化体，其特征在于，所述转化体包括如权利要求5所述的分离的核酸，或如权利要求6所述的重组表达载体；其中所述转化体优选大肠杆菌为出发菌；所述大肠杆菌优选E.coliBL21(DE3)。

8.一种制备融合蛋白的方法，其特征在于，培养如权利要求7所述的转化体，使其表达所述融合蛋白，即得。

9.一种制备NMN的方法，其特征在于，以烟酰胺核糖或其盐、ATP或其盐为原料，使用如权利要求1～3任一项所述的融合蛋白，或如权利要求4所述的蛋白组合来催化反应，以产生NMN；

较佳地，所述反应还包括镁离子、多聚磷酸盐；

可选的，所述烟酰胺核糖还可以为烟酰胺核糖氯化物，所述ATP或其盐为ATP二钠盐，所述镁离子来自MgCl₂，所述多聚磷酸盐为六偏磷酸钠；所述反应的时间为0.5-2小时；所述反应的pH为4.0-7.0，所述反应的温度为28-40℃；

进一步更佳地，所述反应中，ATP或其盐8mM，镁盐50mM，烟酰胺核糖或烟酰胺核糖氯化物80mM，六偏磷酸钠8mM，加入占反应体积10％～20％的含有如权利要求1～3任一项所述的融合蛋白或如权利要求4所述的蛋白组合的菌泥，所述反应的时间为1.5-2小时；

和/或，所述pH为5.5，所述反应的温度为40℃。

10.如权利要求1～3任一项所述的融合蛋白，或如权利要求4所述的蛋白组合在制备生产烟酰胺单核苷酸的催化剂中的应用。