CN114164190A - 一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，且公开了一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用，其氨基酸序列由烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及一个连接肽组合而成，具体是将烟酰胺磷酸核糖转移酶与核糖磷酸焦磷酸激酶通过连接肽组合成一个融合酶。该融合酶基因可以转化到大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中，以该菌作为菌种，烟酰胺为底物，发酵生产烟酰胺单核苷酸；或者在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中表达后，提取纯化该融合酶，在体外转化生产烟酰胺单核苷酸，本发明的融合酶能够显著提高烟酰胺单核苷酸的生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用。
背景技术
心血管疾病是现代社会对人类健康和生命威胁最大的一类疾病。同时，常见的老年疾病和症状，如阿尔茨海默病、骨质疏松、肌肉减少以及肝脏的功能减退都与毛细血管的减少有关。研究发现，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+，也称辅酶I)是一个关键的物质，在动物和人类中的正常年龄增长中，nad+在细胞中的生物可利用度及相关代谢程度是逐步下降的，进而造成生理衰老。
多项研究开始探索通过提升体内nad+的活力来延缓衰老。一个nad+的前体物质，烟酰胺单核苷酸(NMN)表现出非常好的前景。在动物模型试验中，口服补充烟酰胺单核苷酸(NMN),能够改善动物的多种生理功能，包括改善心血管功能。还有研究发现，中年小鼠口服烟酰胺单核苷酸作为抗衰老补充剂，能够延长寿命长达29％。除了在保健抗衰老方面的应用，研究也发现，NMN在一些具体疾病的治疗中也有良好表现。在这个老龄化日益严重的社会背景下，烟酰胺单核苷酸有难以估量的市场容量。
烟酰胺单核苷酸的一个体内合成途径是在烟酰胺磷酸核糖转移酶的作用下，烟酰胺和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)反应生成烟酰胺单核苷酸。5-磷酸核糖-1-焦磷酸则是在核糖磷酸焦磷酸激酶的作用下，由5-磷酸核糖和ATP反应而得。因此，构建一个烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶的融合酶，将有利于生成的PRPP进一步与烟酰胺反应得到烟酰胺单核苷酸。
目前，烟酰胺单核苷酸的来源主要为微生物发酵法和体外酶法转化来进行生产。体外酶法转化需要收集纯化所需的酶制剂，且需要使用酶转化反应的各种底物，底物成本较高；构建融合酶，能够简化酶制剂的收集纯化，提高反应效率。微生物发酵法只需使用烟酰胺作为反应底物，成本低，但目前所报道的大肠杆菌发酵法和和酵母发酵法获得的产品得率较低，只有不到16mg/L发酵液，达不到商业化生产要求。先前研究表明，与含烟酰胺磷酸核糖转移酶单顺反子的大肠杆菌相比，含烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶双顺反子的大肠杆菌并不能显著提高烟酰胺单核苷酸的表达量。因此，构建含融合酶的重组菌株有望提高利用微生物发酵法生产烟酰胺单核苷酸的产量。
本发明通过选择合适的连接肽构建烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶的融合酶，成功提高了重组菌株烟酰胺单核苷酸的表达量。融合酶在体外酶转化生产烟酰胺单核苷酸也有其优势。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用，利用优选的连接肽构建烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶的融合酶，将融合酶基因转入宿主细胞，利用重组宿主细胞发酵生产烟酰胺单核苷酸；或者利用宿主细胞发酵生产融合酶，然后利用融合酶在体外转化生产烟酰胺单核苷酸，解决了上述背景技术中所提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用，其氨基酸序列由烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及一个连接肽组合而成。
所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶来源于杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)，其序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的核糖磷酸焦磷酸激酶来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，其序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的连接肽为10-50个氨基酸的多肽，其中的优选序列如序列表SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
优选的，所述工艺步骤如下：
1)构建由常用的宿主启动子和编码权利要求书1所述的融合酶的基因构成的基因表达单元，并导入宿主细胞大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌；
2)在培养基中加入0.1％-2％烟酰胺，以常规的发酵工艺发酵生产烟酰胺单核苷酸。
优选的，所述工艺步骤如下：
1)构建由常用的宿主启动子和编码所述的融合酶的基因构成的基因表达单元，并导入宿主细胞大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌；
2)以常规的发酵及纯化工艺发酵生产所述的融合酶；
3)利用已公开的方法，以烟酰胺，核糖和ATP为原料，在上述的融合酶的催化作用下，反应制得烟酰胺单核苷酸。
有益效果如下：
该生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用，首次成功构建一个性能优良的烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶的融合酶，此融合酶在微生物法或体外合成法生产烟酰胺单核苷酸中都可以得到应用；与含烟酰胺磷酸核糖转移酶基因或者含烟酰胺磷酸核糖转移酶基因和核糖磷酸焦磷酸激酶基因双顺反子的宿主菌相比，含新构建的融合酶基因的宿主菌能够提高50％以上的烟酰胺单核苷酸产量。应用于体外酶转化生产烟酰胺单核苷酸中，融合酶也能简化酶生产纯化的工艺，提高酶转化效率。
具体实施方式
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实例将由来源于杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)的烟酰胺磷酸核糖转移酶基因、连接肽和来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的核糖磷酸焦磷酸激酶构成的融合酶表达元件克隆到大肠杆菌表达质粒pSE380。
构建重组质粒pSE380-NL1P
人工合成如下DNA片断：
将合成的DNA片段和质粒pSE380用限制性内切酶EcoR I和Pst I进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pSE380-NL1P。
2.构建重组质粒pSE380-NL2P
人工合成如下DNA片断：
将合成的DNA片段和质粒pSE380-NL1P用限制性内切酶Kpn I和Sal I进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pSE380-NL2P。
构建重组质粒pSE380-NL3P
人工合成如下DNA片断：
将合成的DNA片段和质粒pSE380-NL1P用限制性内切酶Kpn I和Sal I进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pSE380-NL3P。
构建重组质粒pSE380-N
将质粒pSE380-NL1P用Kpn I/Sac II酶切后，胶纯化5.6KB片段，用T4DNApolymerase将末端钝化后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pSE380-N。
实施例2
本实例将实施例1中的融合酶克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒pMLK83。
1.构建重组质粒pMLK83-amyM
根据Genbank中注释的启动子amyM序列，设计上游引物为5’cccaagcttctgtacacttgcgtcctcca 3’和下游引物为5’cgggatcctctcctcccctttcaa tgtg 3’。PCR反应体系100ul：DNA模板(Bacillus licheniformis ATCC 14580总DNA)1ul(约20ng)，5×PrimeSTAR Buffer 20ul，10pmol/ul dNTP2ul，10pmol/ul正反向引物各为2ul，2.5U/ulPrimeSTAR HS DNA聚合酶1ul，添加ddH2O至100ul。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR片段和质粒pMLK83用限制性内切酶BamHI、Hind III分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-amyM。
构建重组质粒pMLK83-amyM-NL1P，pMLK83-amyM-NL2P和pMLK83-amyM-NL3P
将质粒pSE380-NL1P和pMLK83-amyM用限制性内切酶BamH I和Sac II进行双酶切后，纯化相应所需的片段，用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-amyM-NL1P.
用类似方法可获得pMLK83-amyM-NL2P和pMLK83-amyM-NL3P。
构建重组质粒pMLK83-amyM-N
将质粒pMLK83-amyM-NL1P用Kpn I/Sac II酶切后，胶纯化10.2KB片段，用T4 DNApolymerase将末端钝化后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-amyM-N。
实施例3
重组枯草芽孢杆菌的构建及烟酰胺单核苷酸的表达
用常规转化方法，将pMLK83-amyM-NL1P转化枯草芽孢杆菌1A751，取菌液涂布新霉素(20ug/ml)LB平板，筛选淀粉酶缺失转化子即得枯草芽孢杆菌基因工程菌株1A751[amyM-NL1P]。
用同样方法可得1A751[amyM-NL2P]、1A751[amyM-NL3P]和1A751[amyM-N]。
将上述基因工程菌株分别接入基础盐培养基(含10ug/ml新霉素和0.5％烟酰胺)，培养30小时后，测定细胞中烟酰胺单核苷酸的含量。
同时，将含pSE380-N，pSE380-N1P，pSE380-N2P和pSE380-N3P的大肠杆菌DH5ɑ重组菌株接入基础盐培养基(含100mg/ml氨苄青霉素和0.5％烟酰胺)，培养15小时后，加入1mMIPTG,继续培养7小时后，测定细胞中烟酰胺单核苷酸的含量。
基础盐培养基的具体成分为：每升培养基包含7g磷酸氢二钾，2g磷酸二氢钾，0.5g柠檬酸钠，0.1g硫酸镁，1g硫酸铵，10g葡萄糖。
测得的烟酰胺单核苷酸最高表达量见表1。
表1
实施例4
利用融合酶体外转化生产烟酰胺单核苷酸
1、融合酶的制备：
1)利用大肠杆菌制备融合酶：将含pSE380-N1P的大肠杆菌DH5ɑ重组菌株接入LB培养基(含100mg/ml氨苄青霉素)，37℃、220rpm培养15小时后，加入1mM IPTG,继续培养7小时后，破胞可得含融合酶的细胞裂解液；
2)利用枯草芽孢杆菌制备融合酶：将菌株1A751[amyM-NL1P]接入LB液体培养基37℃、220rpm培养36小时，收集菌体破胞后可得含融合酶的细胞裂解液。
2、烟酰胺单核苷酸的制备：
在反应罐里加入50mM烟酰胺，50mM核糖，50mM ATP，100mM Tris-HCl(pH8.0)，50mMMgCl2，10mM KCl和1％步骤一制备的酶溶液。在37℃，50rpm，pH7.0-pH8.0的条件下搅拌反应8小时.反应后可得烟酰胺单核苷酸粗溶液(烟酰胺单核苷酸浓度为大约5mM)。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶，其特征在于：其氨基酸序列由烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及一个连接肽组合而成；
所述烟酰胺磷酸核糖转移酶来源于杜克雷嗜血杆菌；
所述的核糖磷酸焦磷酸激酶来源于解淀粉芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的一种生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：工艺步骤如下：
S1、构建由常用的宿主启动子和编码所述的融合酶的基因构成的基因表达单元，并导入宿主细胞大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌；
S2、在培养基中加入0.1％-2％烟酰胺，以常规的发酵工艺发酵生产烟酰胺单核苷酸。
3.根据权利要求1所述的一种生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：工艺步骤如下：
S1、构建由常用的宿主启动子和编码所述的融合酶的基因构成的基因表达单元，并导入宿主细胞大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌；
S2、以常规的发酵及纯化工艺发酵生产所述的融合酶；
S3、在上述的融合酶的催化作用下，反应制得烟酰胺单核苷酸。
4.根据权利要求1所述的一种生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述的连接肽为10-50个氨基酸的多肽。
5.根据权利要求3所述的一种生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述步骤S3中的反应原料为烟酰胺、核糖和ATP。
6.根据权利要求1所述的融合酶的应用，其特征在于：所述融合酶应用于体外酶转化生产烟酰胺单核苷酸中。
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