CN111549012A

CN111549012A - 核糖激酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN111549012A
Application number: CN202010512230.1A
Authority: CN
Inventors: 周志辉; 刘德俊; 张晓红
Original assignee: Shijiazhuang Chuangzu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shijiazhuang Chuangzu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2040-06-08
Also published as: CN111549012B

Abstract

本发明提供了一种核糖激酶突变体及其应用，核糖激酶突变体的氨基酸序列如序列表中的序列1所示，其基因的序列如序列表中的序列2所示。所述的核糖激酶突变体在制备烟酰胺单核苷酸中的应用。所述应用为以D‑核糖为出发原料，应用固定化核糖激酶突变体、固定化核糖磷酸焦磷酸激酶以及固定化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶进行级联反应制备得到烟酰胺单核苷酸。本发明经过多轮突变筛选，获得了一个酶活力提高了4.7倍的优良突变体，该核糖激酶在酶法制备烟酰胺单核苷酸中展示了良好的应用前景。

Description

核糖激酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种核糖激酶突变体及其应用。

背景技术

NMN(烟酰胺单核苷酸)，是人体内能量辅因子NAD+的前体物质。NAD+又叫辅酶Ⅰ，全称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，在每一个细胞中参与上千项反应。NAD+是三羧酸循环的重要辅酶，促进糖、脂肪、氨基酸的代谢，参与能量的合成；NAD+参与人体的新陈代谢的方方面面，是关键性的辅酶，在人体抗衰老中起到重要作用。但是随着年龄的增长，人体内的NAD+水平是在逐渐下降的，导致线粒体活性降低，加速线粒体、细胞乃至整个机体的衰老，并且逐渐进入恶性循环，新陈代谢就会下降，进入衰老阶段。通过额外补充NAD+，理论上可以全面抗衰老。然而，现实情况是NAD+分子比较大，外部直接补充的NAD+很难透过细胞膜，进入细胞内部。于是，研究得重点转向补充合成NAD+的各类前体物质，比如烟酸、色氨酸、烟酰胺、NMN、NR等。这些前体物质均能很容易的进入细胞内部，是理想的替代选择。但进一步的研究发现，前述大部分物质都存在副作用过大或转化效率过低的问题。而NMN的补充则未发现任何不良反应，并且NMN在体内能高效率地转化为NAD+。该结论也使得NMN成为全球各大医药和食品公司争相开发的对象。

目前，NMN的制备方法主要分为生物法和化学法。其中化学法由于使用了有害原料，且在成品中很难全部除净，对人体存在潜在危险，并且化学方法的成本较高。酶法因为大部分反应均为水相，不含有毒有害有机溶剂，绿色环保的特征使其成为目前最理想的NMN制备方法。

目前已有一些专利申请涉及生物法制备NMN，如CN201310752930，该专利聚焦了生物法制备NMN过程中的其中一步反应，即烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶参与的反应，而对其他几步关键反应及其对应的关键酶并无描述。CN201810940729公布了固定化细胞进行NMN制备的方法，但该方案中起始原料采用的是D-5-磷酸核糖，该原料并非广泛可得且价格较高，制约了其应用及发展。

发明内容

本发明的目的就是提供一种核糖激酶突变体及其应用，以解决现有NMN制备方法原料成本较高且现有野生型核糖激酶活性不理性，难以实现工业化生产的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种核糖激酶突变体，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。

编码上述核糖激酶突变体的基因，所述基因的序列如序列表中的序列2所示。

上述的核糖激酶突变体在制备烟酰胺单核苷酸中的应用。

所述的应用是以D-核糖为出发原料，应用核糖激酶突变体、核糖磷酸焦磷酸激酶以及烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶进行级联反应制备得到烟酰胺单核苷酸。

所述的应用是以D-核糖为出发原料，应用固定化核糖激酶突变体、固定化核糖磷酸焦磷酸激酶以及固定化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶进行级联反应制备得到烟酰胺单核苷酸。

所述的应用包括以下步骤：

(a)分别制备固定化核糖激酶突变体、固定化核糖磷酸焦磷酸激酶以及固定化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶；

(b)配制反应体系，所述反应体系包含：40mM D-核糖、40mM ATP、10mM氯化镁、5mM氯化锰、10g/L固定化核糖激酶、10g/L固定化核糖磷酸焦磷酸激酶、15g/L固定化烟酰胺磷酸核糖转移酶；反应体系pH控制在8.0，温度控制在37℃，进行搅拌反应；

(c)反应完成后，将反应物过滤，滤除的三种固定化酶进行循环使用，滤液经纯化、冻干后即为烟酰胺单核苷酸固体。

本发明经过长期大量实验探索，得到了一种来源于汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)菌株的核糖激酶。以该酶为基础，经过多轮突变筛选，获得了一个酶活力提高了4.7倍的优良突变体，该核糖激酶在酶法制备烟酰胺单核苷酸中展示了良好的应用前景。

与现有的烟酰胺单核苷酸制备方法相比，本发明提供的方法避免了使用昂贵的起始原料，如D-5-磷酸核糖或者PRPP；且本发明所涉及使用的酶全部采用固定化，固定化多酶级联反应更加有利于产物的分离纯化，具有很强的工业应用前景。

附图说明

图1是实施例2野生型核糖激酶基因的凝胶电泳图。其中，右侧为mark，左侧为样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。本发明中涉及的DNA序列均采用常规的方法合成，本发明实施例中未提到的试验条件和操作均按本领域常规方法或制造商建议的条件进行。

实施例1来源于Debaryomyces hansenii的野生型核糖激酶基因克隆

设计一对引物rk-dha-F:5’-AATACATATGACATATAGTACG-3’和rk-dha-R:5’-AATCTCGAGTCATATGTATTTATT-3’，以Debaryomyces hansenii菌种为出发菌株模板，进行聚合酶链式反应(PCR反应)，反应体系：重蒸水18微升，2.5微升PCR缓冲液(PCR buffer)，1微升氯化镁(25mM浓度)，1.5微升dNTP(2.5mM浓度)，0.5微升上述两条引物，上述模板20纳克，2个单位的Taq酶(上海sangon公司)。

PCR条件：94℃变性10分钟后；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环；最后72℃充分延伸10分钟。野生型核糖激酶基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示，其氨基酸序列如序列表的序列4所示。克隆核糖激酶基因来源于Debaryomyceshansenii，购买自American type culture collection(美国ATCC公司,www.atcc.org)。

实施例2含野生型核糖激酶基因的重组质粒构建

PCR扩增反应结束后，使用1％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳，待条带清晰出现后，对大小为1000bp左右的目标条带进行胶条割胶，使用胶回收试剂盒(宝生物公司)回收目标DNA片段，并接着按照宝生物公司(网址：www.takara.com.cn)2009版产品目录说明书描述的方法，将所获得的DN片段和载体pET28b+(Novagen公司)用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切。

酶切产物再次进行电压为100伏的DNA电泳，回收相应大小为1000bp和5300bp左右的片段和载体，最后将片段和载体按照3:1的比例混合后，加入1.5单位的T4连接酶，16℃连接12小时。

连接反应结束后，将连接产物取10微升转化大肠杆菌DH5alpha感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，经过NdeI和XhoI双酶切和DNA测序验证，获得包含有大小为1kb的目标DNA序列的阳性克隆及其重组质粒。

实施例3表达野生型核糖激酶的基因工程菌构建

用氯化钙转化法(郝福英等编著，《分子生物学实验技术》，北京大学出版社，1998年，第12-15页)将1.2中最终得到的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中(Novagen公司)，即获得野生型核糖激酶大肠杆菌表达菌株。

实施例4核糖激酶基因的随机突变

设计一对引物rk-dha-F:5’-AATACATATGACATATAGTACG-3’和rk-dha-R:5’-AATCTCGAGTCATATGTATTTATT-3’。易错PCR体系为：20ng模版DNA(实施例2中获得的重组质粒)，各30pmoL的上述一对引物，7mM氯化镁，50mM氯化钾，10mM Tris-HCl(pH8.2),0.2mM dGTP,0.2mM dATP,1mM dCTP,1mM dTTP,0.05mM氯化锰和5个单位的Taq酶(NEB公司)。

PCR反应条件：94℃变性10分钟后；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸60秒，共进行30个循环；最后72℃充分延伸10分钟。

PCR扩增结束后，先使用0.9％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳。用胶回收试剂盒(上海生工)回收大小为1kb左右的DNA目的片段。

以此回收的DNA片段作为引物，重组质粒作为模板，进行PCR扩增，具体反应体系为：20ng的DNA模板，引物10微升，2.5mM dNTP 10微升，和2个单位的KOD聚合酶(toyobo公司)。PCR反应条件为：95℃变性8分钟后；95℃变性45秒，57℃退火45秒，68℃延伸5.5分钟，共进行25个循环；最后68℃充分延伸10min。最终的PCR产物用DpnI酶于37度消化1小时去除DNA模板，经过65℃10分钟处理使DpnI失活，以供转化使用。

实施例5突变体库的构建及筛选

5.1突变体库的构建

通过电击的方法将实施例4中构建得到的突变载体转化到感受态细胞E.coliDH10B(美国Invitrogen公司)中。转化细胞涂布含卡那霉素的LB平板(蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂2％)上，37℃过夜培养。

用该方法能得到超过3×10⁴个克隆的突变体库。

5.2突变体筛选与鉴定

菌体生长12小时后，挑取单菌落接种于含有300微升LB培养基的96孔细菌培养板中，37℃，220rpm摇床培养，2小时候对菌体进行0.9mMIPTG诱导。诱导后培养温度降为30℃，继续培养16小时。

取100微升/孔上述培养后菌液至96孔酶标板中，将其整体置于零下70℃环境中2小时后，转至37℃环境中复苏，复苏时间30分钟左右。

将复苏后的菌液与反应液混合于96孔酶标板中，反应液配比为：30mM D-核糖，15mM氯化钾，20mM ATP,7.5mM氯化镁，0.1M Tris-HCl缓冲液pH7.0。37℃下220rpm震荡反应2小时后，利用高效液相色谱检测产物的生成。色谱分析条件为：使用色谱柱Shodex SugarSH1011(8.0mmLDX 300mm)，流动相为5mM稀硫酸溶液，流速0.6mL/min，检测器为示差检测器，柱温50℃，进样量为10微升。

5.3筛选结果

通过上述步骤，从突变体库中筛选得到两株能明显提高产物生成量的突变体。命名为B26和G19。

5.4突变体测序

对B26和G19两个突变体进行测序，并将得到的氨基酸序列与出发序列相比。结果发现，由于对应位置的基因序列的突变，引起了分别在第116位和285位的氨基酸发生了改变。如下表所示：

表1：核糖激酶突变体序列改变结果

突变体	核苷酸位置	核苷酸变化	氨基酸位置	氨基酸变化
					B26	346-348	TTA-TCA	116	亮氨酸-丝氨酸
G19	853-855	GAC-TAC	285	天冬氨酸-酪氨酸

实施例6野生型及突变型核糖激酶表达菌株发酵

将实施例3中获得的野生型核糖激酶大肠杆菌表达菌株及实施例5获得的两株突变型核糖激酶的单个微生物菌落接种于含有100μg/mL卡那霉素的50毫升LB培养基(蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％)中。细胞在37℃培养箱中于250rpm振荡生长过夜(至少12小时)。在1升培养瓶中装入250毫升TB培养基(12g/L胰蛋白胨、24g/L酵母提取物、4mL/L甘油、65mM pH7.0磷酸钾、1mM硫酸镁、100μg/mL卡那霉素)，按照10％的接种量将上述过夜培养物接种于其中，然后在37℃下振荡培养。当培养物的OD600为0.7至0.8时，降温至28℃，用1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导核糖激酶基因的表达，继续培养至少12小时。

实施例7野生型及突变型核糖激酶的纯化

培养结束后，使用离心机在4℃，5000rpm条件下离心15分钟，收集细胞并弃去上清液。细胞沉淀物在相等体积的4℃100mM pH7.0三乙醇胺(氯化物)缓冲液中重悬，5000rpm条件下离心15分钟后，收集细胞。洗涤的细胞在2倍体积的4℃100mM pH7.0三乙醇胺(氯化物)缓冲液中重悬，以12000psi在高压匀浆机(ATS公司)中机械破胞两次，全程保持温度为4℃。细胞碎片通过冷冻高速离心机在4℃，10000rpm条件下离心40分钟去除，上清液为所获得的可溶性核糖激酶粗酶液。

按照IDA HisBind树脂纯化标准操作流程(Novagen公司)进行树脂柱准备与平衡：第一步：3倍柱体积去离子水；第二步：5倍体积离子化缓冲液(50mM NiSO4)；第三步：3倍体积结合缓冲液(配方为0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM imidazole，pH 7.9)。待结合缓冲液下降至层析介质表面，小心加入制备好的核糖激酶粗酶液，控制流速为每小时10倍床体积。加入10倍床体积结合缓冲液洗，再次加入6倍体积漂洗缓冲液(配方为0.5M NaCl，60mMimidazole，20mM Tris-HCl，pH 7.9)，最后加入6倍体积洗脱缓冲液(配方为1M imidazole，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH 7.9)洗脱结合蛋白。洗脱液可按需要分段收集，每1ml收集为一管。至此，分别得到了野生型及突变型核糖激酶的纯化酶液。

实施例8野生型和突变型核糖激酶活力比较

将实施例7所获得的野生型及突变型纯化核糖激酶在下列反应体系中进行酶活力测定：30mM D-核糖，15mM氯化钾，20mM ATP,7.5mM氯化镁，0.1M Tris-HCl缓冲液pH7.0，酶加量为总体积的20％，37℃下220转/分钟震荡反应30分钟后，加入等体积的10％盐酸中止反应。反应液稀释5倍后，12000转/分钟高速离心5分钟，取上清进行高效液相色谱测定产物的生成。色谱分析条件为：使用色谱柱Shodex Sugar SH1011(8.0mmLDX 300mm)，流动相为5mM稀硫酸溶液，流速0.6mL/min，检测器为示差检测器，柱温50℃，进样量为10微升。1个单位酶活力定义为每分钟产生1微摩尔5-磷酸-D-核糖所需的酶量。酶活力计算公式为＝A*5*2*5*1000/(230.11*30)，其中A为高效液相色谱测定的数值(单位为g/L)。

表2：

项目	野生型(U/ml)	突变体B26	突变体G19
				酶活	2.49	5.25	8.98
倍率	1	2.11	3.6

由上表可以看出，突变体B26、G19相比野生型酶，其活力分别提高了2.1倍和3.6倍。

实施例9 116位及285位双位点组合突变

本实施例的目的是将实施例8中获得的两个有益突变进行叠加，以考察双突变体在酶活力方面的表现。

使用

Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒(Stratagen,Agilient公司)将116位和285位同时分别突变为丝氨酸和酪氨酸。操作方法按试剂盒说明书进行(www.agilent.com)，组合突变后所得的突变体氨基酸序列如序列表中序列1所示，其基因序列如序列表中序列2所示。在获得116和285位叠加突变后(该叠加突变体命名为L116S/D285Y)，按照实施例6、

实施例7、实施例8中所述的相同方法分别进行叠加突变体酶的发酵、纯化及酶活测定，结果如下：

表3：三种突变体与野生型酶活比较

由上表可以看出，116位和285位的氨基酸叠加突变使酶活得到了进一步提高，达到野生型的4.7倍。

实施例10核糖激酶突变体参与多酶级联反应制备烟酰胺单核苷酸

10.1核糖激酶的固定化

按照固定化树脂提供商(西安蓝晓公司)的方法进行材料准备和固定化：LX-1000HA树脂活化操作流程准备固定化载体，第一步：100g载体加入400mL，0.1M pH8.0的磷酸盐缓冲液，搅拌15分钟后，测pH，维持pH7.8-8.2，1小时后过滤抽干；第二步：配制2％的戊二醛磷酸缓冲液(1L)，40mL戊二醛(50％)，960mL水，磷酸氢二钾4.76g，溶解后用磷酸二氢钾调节pH至7.8-8.2；第三步：戊二醛活化，将抽干的100g载体，加入400mL2％的戊二醛磷酸缓冲液，25℃下，搅拌1小时，过滤，用去离子水洗涤载体至水清。得到活化好的固定化载体备用。

在四口烧瓶中，加入活化好的固定化载体，4倍体积的核糖激酶突变体纯化酶液，50rpm搅拌，控制水浴温度25℃，搅拌20小时后，静置10小时，负压抽干洗净。至此，得到核糖激酶的固定化酶。

10.2核糖磷酸焦磷酸激酶基因克隆

设计一对引物PRPPs_ba-F:5’-CATATGTCTAATGAATATGGCGAT-3’和PRPPs_ba-R:5’-CTCGAGTCAAGAAAACAGATAGCT-3’，以Bacillus amyloliquefaciens菌种为出发菌株模板，进行聚合酶链式反应(PCR反应)，反应体系：重蒸水18微升，2.5微升PCR缓冲液(PCR buffer)，1微升氯化镁(25mM浓度)，1.5微升dNTP(2.5mM浓度)，0.5微升上述两条引物，上述模板20纳克，2个单位的Taq酶(上海sangon公司)。

PCR条件：94℃变性10分钟后；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸55秒，共进行30个循环；最后72℃充分延伸10分钟。核糖磷酸焦磷酸激酶基因来源于Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)，购买来自“中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC”。

10.3核糖磷酸焦磷酸激酶的表达、纯化、固定化

核糖磷酸焦磷酸激酶在BL21(DE3)菌种中的表达及纯化、固定化操作方法与核糖激酶相同。至此，我们得到了固定化核糖磷酸焦磷酸激酶。

10.4烟酰胺磷酸核糖转移酶基因克隆

设计一对引物NAMPT_Mru-F:5’-CATATGAAAACCCTCAACCCCCACAA-3’和NAMPT_Mru-R:5’-CTCGAGCTAAGCGTTGTTGCGCACCTCT-3’，以Meiothermus ruber DSM1279菌种为出发菌株模板，进行聚合酶链式反应(PCR反应)，反应体系：重蒸水18微升，2.5微升PCR缓冲液(PCRbuffer)，1微升氯化镁(25mM浓度)，1.5微升dNTP(2.5mM浓度)，0.5微升上述两条引物，上述模板20纳克，2个单位的Taq酶(上海sangon公司)。

PCR条件：94℃变性10分钟后；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共进行30个循环；最后72℃充分延伸12分钟。烟酰胺磷酸核糖转移酶基因来源于Meiothermusruber DSM1279，菌种购买自KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，日本京都大学生物信息学中心，www.kegg.jp)。

10.5烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达、纯化、固定化

烟酰胺磷酸核糖转移酶在BL21(DE3)菌种中的表达及纯化、固定化操作方法与核糖激酶相同，需要注意的是本实施例中目标DNA序列长度为1.4kb左右，目标蛋白质分子量为51千道尔顿(51KD)。

至此，我们得到了固定化烟酰胺磷酸核糖转移酶。

10.6以D-核糖为底物进行多固定化酶级联反应制备烟酰胺单核苷酸

准备一种转化体系，内含40mM D-核糖，40mM ATP，10mM氯化镁，5mM氯化锰，调节pH至8.0，加入固定化核糖激酶10g/L、固定化核糖磷酸焦磷酸激酶10g/L、固定化烟酰胺磷酸核糖转移酶15g/L。再次确认pH 8.0后，控制温度37℃，搅拌转速100rpm，使用20％碳酸钠溶液控制反应体系pH为8.0。反应4小时候取样进行高效液相色谱分析，得到的烟酰胺单核苷酸浓度为12.11g/L。转化完成后，将反应物过滤，移除三种固定化酶供下一批次使用。溶液部分经过离子交换纯化和冻干后，即得烟酰胺单核苷酸固体，纯度可到98％。

由于本发明采用了全部固定化酶参与反应，通过简单的过滤即可将固定化酶分离，非常有利于目标产物的分离和提纯。并且，固定化酶的反复套用能进一步降低制备成本。

上述实施例只是为了说明本发明的思路及技术特点，其目的是为了让熟悉该领域的人员能了解本发明内容并据此实施，并不能以此来限制本发明的保护范围。凡根据本发明的思路所做的等效变化或一定程度的修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 核糖激酶突变体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 335

<212> PRT

<213> 汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)

<400> 1

Met Thr Tyr Ser Thr Ile Thr Val Ile Gly Ser Leu Asn Tyr Asp Leu

1 5 10 15

Val Thr Tyr Thr Lys Ala Val Pro Glu Gly Gly Glu Thr Tyr Gln Ala

20 25 30

Asn Ser Phe Glu Asn His Ile Gly Gly Lys Gly Leu Asn Glu Ala Ile

35 40 45

Ala Thr Ser Arg Leu Ser Gly Lys Gln Ser Lys Cys His Val Arg Met

50 55 60

Ile Gly Asn Val Gly Asn Asp Ser Phe Gly Lys Glu Leu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Gly Val Asp Thr Lys Tyr Val Lys Thr Leu Glu Lys

85 90 95

Gln Ser Ser Gly Val Ala Val Ile Ile Val Glu Glu Glu Ser Gly Glu

100 105 110

Asn Arg Ile Ser Ile Thr Ala Gly Ala Asn Gly Glu Leu Cys Pro Thr

115 120 125

Lys Glu Glu Tyr Glu Thr Tyr Phe Pro Lys Asp Val Asp Gly Ala Gln

130 135 140

Phe Val Ile Leu Gln Asn Glu Tyr Pro Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu

145 150 155 160

Trp Leu Lys Ala Asn Arg Gln Lys Ile Asn Ile Ala Tyr Asn Pro Ser

165 170 175

Pro Phe Lys Pro Glu Phe Ile Ser Gln Gln Phe Trp Ser Lys Ile Asp

180 185 190

Phe Leu Ile Ile Asn Glu Gly Glu Ala Leu Ser Val Ala Ser Lys Leu

195 200 205

Leu Thr Asp Glu Glu Asn Ala Lys Phe Asn Lys Thr Ile Lys Leu Asp

210 215 220

Lys Val Glu Gly Phe Ser Asp Leu Ala Asp Lys Leu Gln Glu Met Ile

225 230 235 240

Asn Pro Asp Asn Val Ser Thr Val Ile Ile Thr Met Gly Ser Lys Gly

245 250 255

Ser Ile Phe Thr Ser Arg Asn Ala Lys Ser Thr Phe Val Lys Ser His

260 265 270

Lys Val Glu Asn Val Val Asp Thr Thr Gly Ala Gly Tyr Thr Phe Phe

275 280 285

Gly Gly Val Val Ser Gln Leu Ala Asn Gly Ser Ser Ile Glu Lys Ala

290 295 300

Val Glu Phe Ala Thr Lys Ala Ser Ser Leu Val Ile Gln Lys Lys Gly

305 310 315 320

Ala Ala Glu Ser Ile Pro Thr Leu Glu Glu Ile Asn Lys Tyr Ile

325 330 335

<210> 2

<211> 1008

<212> DNA

<213> 汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)

<400> 2

atgacatata gtacgattac agtcattgga tcattaaact atgatttagt tacttacacc 60

aaagcagttc cagaaggtgg tgagacctac caagcaaatt ctttcgagaa tcatatcggt 120

ggtaagggac ttaatgaagc aattgcaact tccaggttat caggcaaaca atcaaaatgc 180

catgttcgta tgatcggtaa tgtgggtaat gattcattcg gaaaggaatt aaagcaggca 240

ttggtgaatt ctggagttga tacgaaatat gttaaaactt tggaaaagca atcatctggg 300

gtagcggtaa ttattgtcga agaagaaagt ggagagaata gaatctcaat tacggcaggt 360

gccaatggag aattgtgtcc aactaaggag gaatatgaaa catacttccc aaaagacgtc 420

gatggagctc aatttgttat cttacagaat gaatatcctg atactgttaa atctattgaa 480

tggcttaaag cgaaccgtca aaaaattaat attgcttata atccttctcc atttaaacct 540

gagtttatca gtcagcaatt ctggtctaag attgactttc taattatcaa cgagggagaa 600

gcattgagtg ttgcatcaaa attactcacg gacgaagaaa atgctaaatt caataaaact 660

atcaaactcg acaaagtaga agggttcagc gacttagcag ataagttgca agaaatgatt 720

aacccagaca atgtaagtac ggtcataatc actatgggaa gtaaggggtc aatctttaca 780

tccaggaatg ctaaatctac atttgtcaaa tcccataaag ttgaaaatgt cgttgatact 840

acaggtgctg gctacacatt ttttggtggt gttgttctgc aattagcgaa tgggtcaagt 900

attgagaagg ccgttgaatt tgcaactaaa gcaagcagct tagttattca aaaaaaagga 960

gcagcagaaa gtattccaac tttggaagaa atcaataaat acatatga 1008

<210> 3

<211> 1008

<212> DNA

<213> 汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)

<400> 3

atgacatata gtacgattac agtcattgga tcattaaact atgatttagt tacttacacc 60

aaagcagttc cagaaggtgg tgagacctac caagcaaatt ctttcgagaa tcatatcggt 120

ggtaagggac ttaatgaagc aattgcaact tccaggttat caggcaaaca atcaaaatgc 180

catgttcgta tgatcggtaa tgtgggtaat gattcattcg gaaaggaatt aaagcaggca 240

ttggtgaatt ctggagttga tacgaaatat gttaaaactt tggaaaagca atcatctggg 300

gtagcggtaa ttattgtcga agaagaaagt ggagagaata gaatcttaat tacggcaggt 360

gccaatggag aattgtgtcc aactaaggag gaatatgaaa catacttccc aaaagacgtc 420

gatggagctc aatttgttat cttacagaat gaatatcctg atactgttaa atctattgaa 480

tggcttaaag cgaaccgtca aaaaattaat attgcttata atccttctcc atttaaacct 540

gagtttatca gtcagcaatt ctggtctaag attgactttc taattatcaa cgagggagaa 600

gcattgagtg ttgcatcaaa attactcacg gacgaagaaa atgctaaatt caataaaact 660

atcaaactcg acaaagtaga agggttcagc gacttagcag ataagttgca agaaatgatt 720

aacccagaca atgtaagtac ggtcataatc actatgggaa gtaaggggtc aatctttaca 780

tccaggaatg ctaaatctac atttgtcaaa tcccataaag ttgaaaatgt cgttgatact 840

acaggtgctg gcgacacatt ttttggtggt gttgttctgc aattagcgaa tgggtcaagt 900

attgagaagg ccgttgaatt tgcaactaaa gcaagcagct tagttattca aaaaaaagga 960

gcagcagaaa gtattccaac tttggaagaa atcaataaat acatatga 1008

<210> 4

<211> 335

<212> PRT

<213> 汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)

<400> 4

Met Thr Tyr Ser Thr Ile Thr Val Ile Gly Ser Leu Asn Tyr Asp Leu

1 5 10 15

Val Thr Tyr Thr Lys Ala Val Pro Glu Gly Gly Glu Thr Tyr Gln Ala

20 25 30

Asn Ser Phe Glu Asn His Ile Gly Gly Lys Gly Leu Asn Glu Ala Ile

35 40 45

Ala Thr Ser Arg Leu Ser Gly Lys Gln Ser Lys Cys His Val Arg Met

50 55 60

Ile Gly Asn Val Gly Asn Asp Ser Phe Gly Lys Glu Leu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Gly Val Asp Thr Lys Tyr Val Lys Thr Leu Glu Lys

85 90 95

Gln Ser Ser Gly Val Ala Val Ile Ile Val Glu Glu Glu Ser Gly Glu

100 105 110

Asn Arg Ile Leu Ile Thr Ala Gly Ala Asn Gly Glu Leu Cys Pro Thr

115 120 125

Lys Glu Glu Tyr Glu Thr Tyr Phe Pro Lys Asp Val Asp Gly Ala Gln

130 135 140

Phe Val Ile Leu Gln Asn Glu Tyr Pro Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu

145 150 155 160

Trp Leu Lys Ala Asn Arg Gln Lys Ile Asn Ile Ala Tyr Asn Pro Ser

165 170 175

Pro Phe Lys Pro Glu Phe Ile Ser Gln Gln Phe Trp Ser Lys Ile Asp

180 185 190

Phe Leu Ile Ile Asn Glu Gly Glu Ala Leu Ser Val Ala Ser Lys Leu

195 200 205

Leu Thr Asp Glu Glu Asn Ala Lys Phe Asn Lys Thr Ile Lys Leu Asp

210 215 220

Lys Val Glu Gly Phe Ser Asp Leu Ala Asp Lys Leu Gln Glu Met Ile

225 230 235 240

Asn Pro Asp Asn Val Ser Thr Val Ile Ile Thr Met Gly Ser Lys Gly

245 250 255

Ser Ile Phe Thr Ser Arg Asn Ala Lys Ser Thr Phe Val Lys Ser His

260 265 270

Lys Val Glu Asn Val Val Asp Thr Thr Gly Ala Gly Asp Thr Phe Phe

275 280 285

Gly Gly Val Val Ser Gln Leu Ala Asn Gly Ser Ser Ile Glu Lys Ala

290 295 300

Val Glu Phe Ala Thr Lys Ala Ser Ser Leu Val Ile Gln Lys Lys Gly

305 310 315 320

Ala Ala Glu Ser Ile Pro Thr Leu Glu Glu Ile Asn Lys Tyr Ile

325 330 335

Claims

1.一种核糖激酶突变体，其特征是，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。

2.编码权利要求1所述核糖激酶突变体的基因，其特征是，所述基因的序列如序列表中的序列2所示。

3.权利要求1所述的核糖激酶突变体在制备烟酰胺单核苷酸中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，以D-核糖为出发原料，应用核糖激酶突变体、核糖磷酸焦磷酸激酶以及烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶进行级联反应制备得到烟酰胺单核苷酸。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征是，以D-核糖为出发原料，应用固定化核糖激酶突变体、固定化核糖磷酸焦磷酸激酶以及固定化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶进行级联反应制备得到烟酰胺单核苷酸。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，包括以下步骤：

（a）分别制备固定化核糖激酶突变体、固定化核糖磷酸焦磷酸激酶以及固定化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶；

（b）配制反应体系，所述反应体系包含：40mM D-核糖、40mM ATP、10mM 氯化镁、5mM 氯化锰、10g/L固定化核糖激酶、10g/L固定化核糖磷酸焦磷酸激酶、15g/L固定化烟酰胺磷酸核糖转移酶；反应体系pH控制在8.0，温度控制在37℃，进行搅拌反应；

（c）反应完成后，将反应物过滤，滤除的三种固定化酶进行循环使用，滤液经纯化、冻干后即为烟酰胺单核苷酸固体。