KR102037958B1 - 합성조절 sRNA 기반 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법 - Google Patents

합성조절 sRNA 기반 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법 Download PDF

Info

Publication number
KR102037958B1
KR102037958B1 KR1020180073970A KR20180073970A KR102037958B1 KR 102037958 B1 KR102037958 B1 KR 102037958B1 KR 1020180073970 A KR1020180073970 A KR 1020180073970A KR 20180073970 A KR20180073970 A KR 20180073970A KR 102037958 B1 KR102037958 B1 KR 102037958B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
target gene
gene
expression
genes
srna
Prior art date
Application number
KR1020180073970A
Other languages
English (en)
Inventor
이상엽
유승민
양동수
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020180073970A priority Critical patent/KR102037958B1/ko
Priority to PCT/KR2019/007729 priority patent/WO2020004936A1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102037958B1 publication Critical patent/KR102037958B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 합성조절 sRNA 기반의 동시다중(multiplex) 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 다양한 항생제 내성 유전자, 복제원점 및 합성조절 sRNA를 포함하는 벡터의 조합 및 제법, 상기 벡터의 조합으로 구성된 sRNA 라이브러리 및 이를 이용한 유용물질 생산 균주의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템은 기존의 유전자 결실방법과는 달리 타겟 유전자의 서열을 변형하지 않으면서 특정 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 합성조절 sRNA 기반 유전자 발현조절 시스템으로서, 다양한 벡터를 포함하여 원핵생물에서 활용 가능한 다른 플라스미드들과 호환성 있게 사용될 수 있고 동시다중 도입이 가능하도록 설계하여 빠르고 효율적인 재조합 미생물 제조에 유용하다. 또한, 본 발명에서는 유전체 수준 합성 조절 sRNA 라이브러리를 간단하고 빠르게 새로운 플랫폼으로 이전할 수 있는 기술을 제공하며, 이는 유용물질을 고성능으로 생산하는 재조합 미생물 선별에 유용하다. 따라서, 본 발명은 산업적, 의학적으로 유용한 다양한 대사 산물의 생산 효율을 획기적으로 증가시킬 수 있는 재조합 균주의 제작에 유용하다.

Description

합성조절 sRNA 기반 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법{Multiplex Gene Expression Inhibition System based on Synthetic Regulatory Small RNA and Method of Preparing the Same}
본 발명은 합성조절 sRNA 기반의 동시다중(multiplex) 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 다양한 항생제 내성 유전자, 복제원점 및 합성조절 sRNA를 포함하는 벡터의 조합 및 제법, 상기 벡터의 조합으로 구성된 sRNA 라이브러리 및 이를 이용한 유용물질 생산 균주의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
전 세계적인 환경문제, 한정된 자원고갈, 친환경 에너지원에 대한 수요로 인해 재생산 가능한 생물체 기반의 세포 공장 구축에 대한 관심이 증가하고 있다. 이런 세포 공장은 세포 내의 대사회로 (metabolic network)를 목적대사산물 (바이오 에너지, 친환경 화학물질, 신약 제재 등) 생산에 최적화하여 제조할 수 있는데, 이 기술 과정에 다양한 분자생물학 기술이 요구되고 있다.
생물체가 목적대사산물을 높은 효율로 생산하기 위해서는 대사 흐름의 최적화가 필수적이며, 이는 결국 필요한 효소의 발현을 최적화를 통해 가능하다. 반응이 빠르고 다량으로 일어나야 하는 경우 효소의 양이 많아야 하고, 반응성이 떨어지는 효소의 경우 반응속도 향상을 위해서는 다량으로 발현이 이루어져야 하며, 세포의 생존에는 필수적이나 목적 산물의 생산을 저해하는 대사반응을 일으키는 효소의 발현은 낮은 수준으로 최적화를 해야 할 필요가 있다.
최근 합성조절 sRNA 시스템들이 개발되고 이를 다양한 종류의 미생물에 적용함으로써 시스템적으로 대사회로상의 유전자들을 손쉽게 낙다운시킬 수 있게 되어 효율적인 유전자 발현 조절이 가능하게 되었다(KR 10-1575587 B1, US 9388417, EP 13735942.8, CN 201380012767.X, KR 10-1690780 B1, KR 10-1750855 B1, US 15317939, CN 201480081132.X, D. Na et al., Nat. Biotechnol. (2013), 31(2), 170-174, S.M. Yoo et al., Nat. Protoc. (2013), 8(9), 1694-707, C. Cho et al., Biotechnol. Bioeng. (2017), 11(2), 374-383, M. Noh et al., Cell Systems (2017), 5, 1-9).
상기 기술은 낙아웃 기법을 포함한 기존의 게놈 기반 엔지니어링이 지닌 여러 단점 및 한계점들 (오랜 시간, 노동집약, 숙련된 기술 필요, 낮은 성공률 및 동시 다발 대용량 실험의 어려움)을 획기적으로 극복한 기술로서, 소요되는 시간, 효율 및 대용량 실험 가능성을 모두 획기적으로 개선할 수 있었다(Datsenko et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), 97(12), 6640-6645). 또한, 기존의 유전자 결실 엔지니어링에서는 불가능하거나 어려웠던 생존 필수 유전자 (essential gene)에 대한 낙다운도 가능하여 시스템적인 적용을 통해 예상치 않게 타겟 화합물의 생산성을 증가시킬 수 있는 낙다운 목표 유전자의 발견도 가능하였다.
이러한 장점들을 가지고 있는 합성조절 sRNA 시스템을 보다 다양한 균주 개발에 활용하기 위해서는 다양한 발현 플랫폼이 필수적이다. 만약, 합성조절 sRNA 발현 플랫폼내의 복제원점 또는 항생제 마커가 대사공학적으로 이미 개량된 균주 내에 존재하는 플라스미드의 복제원점 또는 항생제 마커와 동일하다면 sRNA 라이브러리 시스템을 바로 적용하기가 어렵기 때문이다. 따라서 기존의 합성 조절 sRNA 플랫폼 하에서는, 다양한 균주에 바로 적용이 어려웠고 상황에 따라 새롭게 클로닝을 진행해야 했다. 또한, 하나의 세포 내에 여러 유전자의 동시 낙다운 효과를 확인하기 위해서는 그에 해당하는 합성조절 sRNA 라이브러리를 한꺼번에 적용하는 것이 바람직하나, 이 라이브러리 내 복제원점과 항생제 마커가 모두 동일하기 때문에 이를 위해서는 하나의 플라스미드에 여러 합성조절 sRNA를 일일이 클로닝하는 추가적인 작업이 필요하다. 이 역시 상황에 따라 새로운 클로닝 작업이 필요하였으므로 경우에 따라 많은 시간이 소요되는 어려움이 있었다.
이러한 한계들은 1) 자주 사용되는 대부분의 플라스미드들과 호환성 있고 동시다중 도입 가능한 다양한 합성조절 sRNA 발현 플랫폼을 개발하고 2) 대장균 유전체 수준의 합성조절 sRNA 라이브러리를 다양한 합성조절 sRNA 발현 플랫폼에 쉽고 간편하게 이전하는 기술이 개발된다면 극복 가능할 것이다. 이러한 기술들이 개발이 된다면, 보다 다양한 환경에서의 유전자 발현 조절이 가능하고, 더 나아가 보다 손쉽고 간편하게 빠른 시일 내에 유용한 화학물질을 효율적으로 생산할 수 있는 미생물 세포 공장 개발 역시 가능할 것이며, 합성조절 sRNA의 활용성을 극대화시킬 수 있을 것이다. 본 발명에서는 다양한 복제 원점 및 항생제 마커들을 선별하고 이들을 조합하여 기존의 벡터 사용에 있어서 호환성이 있는 합성조절 sRNA 발현 플라스미드들을 구축하였다.
이에 본 발명자들은 다양한 합성조절 sRNA 발현 플랫폼을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 합성조절 sRNA 발현 벡터마다 항생제 내성 유전자 및 복제원점을 서로 달리하여 합성조절 sRNA 발현벡터를 깁슨 어셈블리(Gibson assembly), 골든게이트 어셈블리(golden gate assembly), 라이게이션(ligation), 상동재조합(homologous recombination), SLIC(sequence and ligation-independent cloning), SLiCE(seamless ligation cloning extract), CPEC(circular polymerase extension cloning) 또는 유전자 합성 방법을 이용하여 제조할 경우, 동시다중 표적유전자의 효율적인 발현억제가 가능할 뿐만 아니라, 대상 미생물의 성장에도 영향을 끼치지 않으며, 대상 미생물 내에서 안정성이 높은 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 합성조절 sRNA 기반의 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템, 그 제법 및 상기 시스템을 이용한 트레오닌, 프롤린, 인디고 또는 비올라세린 생산능이 향상된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1항생제 내성 유전자; 제1복제원점; 제1 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제1벡터; 및 제n항생제 내성 유전자; 제m복제원점; 제p 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화영역을 포함하는 제q벡터;를 포함하는 원핵생물의 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템으로, 상기 제1항생제 내성 유전자와 제n항생제 내성 유전자, 제1복제원점과 제m복제원점 및 제1표적유전자와 제p표적유전자는 서로 각각 상이하며, n은 2 내지 50의 정수인 것을 특징으로 하고, m은 2 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하며, q는 2 내지 500의 정수인 것을 특징으로 하고, p는 2 내지 20000의 정수인 것을 특징으로 하는 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템을 원핵생물 내로 도입하거나, 원핵생물 내에서 발현시키는 단계; 및 표적 유전자의 mRNA 발현을 억제하는 단계를 포함하는 표적유전자의 동시다중 발현억제 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템을 포함하는 표적유전자의 동시다중 발현억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 유용물질 생산균주의 개량방법을 제공한다:
(a) 20 염기 내지 50 염기를 가지는 임의의 염기서열을 제조하는 단계;
(b) 상기 염기서열을 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제1벡터의 표적유전자 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 삽입하여 제1 sRNA 라이브러리를 포함하는 제1벡터 라이브러리를 제조하는 단계;
(c) 상기 제1벡터 라이브러리를 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 도입하여, 유용물질 생산량이 향상되는 경우, 발현이 억제된 유전자 후보군을 동정하여, 2 내지 500개의 발현억제 대상 유전자로 결정하는 단계.
(d) 상기 결정된 2 내지 500개의 발현억제 대상 유전자를 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제q 벡터에 각각 삽입하는 단계; 및
(e) 상기 발현억제 대상 유전자를 포함하는 q개의 벡터가 도입된 재조합 균주를 제조하는 단계.
여기서, q는 2 내지 500의 정수임.
본 발명은 또한, 트레오닌(Threonine) 생합성 경로를 가지는 숙주세포에서, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제1 내지 제q벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 tktA, aroF, pta, ilvH, ilvE, glnA, fur 또는 chpA 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, tktA, aroF, pta, ilvH, ilvE, glnA, fur 및 chpA로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있는 것을 특징으로 하는 트레오닌 생산능력이 향상된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 프롤린(proline) 생합성 경로를 가지는 숙주세포에서, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제1 내지 제q벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 serC, murE, aspC, metB, fadR, fur 또는 chpA 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, serC, murE, aspC, metB, fadR, fur 및 chpA 로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있는 것을 특징으로 하는 프롤린 생산능력이 향상된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 트레이스 메탈 용액(trace metal solution)을 포함하는 배지에서 유가식 발효를 통해 배양하는 단계를 포함하는 프롤린 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 인디고(indigo) 생합성 경로를 가지는 숙주세포에서, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제1 내지 제q벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 asnA, hisJ, yneH, napG, kdsA, ygfA, ftsl, aceF 또는 ostB 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, asnA, hisJ, yneH, napG, kdsA, ygfA, ftsl, aceF 및 ostB 로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있는 것을 특징으로 하는 인디고 생산능력이 향상된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 비올라세인(violacein) 생합성 경로를 가지는 숙주세포에서, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제1 내지 제q벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 ytfR, hybG, ampG, potG, caiF, minD, ilvM, yfbR, rfe, atpH, tiaE 또는 murI 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, ytfR, hybG, ampG, potG, caiF, minD, ilvM, yfbR, rfe, atpH, tiaE 및 murI로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있는 것을 특징으로 하는 비올라세인 생산능력이 향상된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 재조합 미생물을 트레이스 메탈 용액(trace metal solution)을 포함하는 배지에서 유가식 발효를 통해 배양하는 단계를 포함하는 비올라세인/디옥시비올라세인 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템은 기존의 유전자 결실방법과는 달리 타겟 유전자의 서열을 변형하지 않으면서 특정 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 합성조절 sRNA 기반 유전자 발현조절 시스템으로서, 다양한 벡터를 포함하여 원핵생물에서 활용 가능한 다른 플라스미드들과 호환성 있게 사용될 수 있고 동시다중 도입이 가능하도록 설계하여 빠르고 효율적인 재조합 미생물 제조에 유용하다.
본 발명에 따른 미생물 대사 흐름 조절을 통해 개발된 프롤린 또는 트레오닌 고효율 생산용 재조합 미생물은 축산용 사료 및 산업용제 미생물로 유용하다. 또한, 본 발명에서 개발한 대장균 유전체 수준의 합성조절 sRNA 라이브러리 이전 기술을 고속 스크리닝 기법과 접목함으로써 기존 기술에서는 불가능했던 획기적인 생산능 증가를 이룩하였다. 본 발명에 따른 인디고 또는 비올라세인 고효율 생산 균주 역시 의약품 및 산업용제 미생물로 매우 유용하다. 따라서, 본 발명은 산업적, 의학적으로 유용한 다양한 대사 산물의 효율적 생산을 위한 재조합 균주의 제작 및 효율적 생산 방법 확립에 사용할 수 있어 유용하다.
도 1은 다양한 합성조절 sRNA 발현 플랫폼 제작을 위해 사용된 각 복제 원점 및 항생제 마커들과 이들의 조합을 나타낸다.
도 2는 (A) pACYC184-DsRed2 (pLac), (B) pTac15K-DsRed2 (pTrc), (C) pTrc99A-DsRed2 (pTac) 리포터 플라스미드에 대한 합성조절 sRNA 각 플랫폼의 DsRed2 형광단백질 낙다운 효율을 비교한 그래프들이다.
도 3은 형광단백질 리포터 플라스미드를 보유하고 있는 대장균 균주에 합성조절 sRNA 발현 플랫폼 플라스미드들을 (a) 1개씩, (b) 2개씩, (c) 3개씩 조합으로 도입시킨 후 측정한 시간별 성장 곡선 그래프들이다. 이 때 리포터 플라스미드들은 pTac표기: pTac15K-dsRed2, pTrc표기: pTrc99A-dsRed2, pACYC로 표기: pACYC184-dsRed2로 표기되었다. 각 그래프는 세 가지 부분으로 나누어져 있는데 (푸른색, 회색, 붉은색 박스), 각각 앞에서부터 1일차, 2일차 (첫 번째 계대배양), 3일차 (두 번째 계대배양)을 나타낸다.
도 4는 합성조절 sRNA 발편 플랫폼 플라스미드의 안정성 (stability)을 확인한 결과이다. 도 3의 실험에 사용된 균주들의 (a) 1일 차, (b) 2일 차, (c) 3일 차 계대 배양 후 colony PCR을 수행하여 균주내 sRNA 플랫폼 플라스미드들의 존재 유무를 확인하였다. 여기에서 A는 pACYC184-DsRed2 (pLac), R는 pTrc99A-DsRed2 (pTrc), T는 pTac15K-DsRed2 (pTac) 플라스미드를 나타내며, 1: ColA-Sm, 2: pBBR1-Am, 3: pBBR1-Tc, 4: pBBR1-Sm, 5: CDF-Tc, 6: CDF-Sm을 나타낸다. 대시로 연결된 조합은 해당 플라스미드들이 동시에 형질전환되었다는 것을 뜻한다. 또한, colony PCR은 각 플라스미드 상의 복제 원점을 타겟으로 수행되었으며, PCR 산물의 크기는 다음과 같다: pBBR1, 1 kb; ColA, 0.6 kb; CDF, 0.3 kb.
도 5는 합성조절 sRNA 라이브러리 적용에 따른 트레오닌 생산량의 변화를 나타낸 그림이다.
도 6은 도 5에서 트레오닌 생산 증가를 보인 합성조절 sRNA들의 이중 조합 적용을 통해 트레오닌 생산량 변화를 나타낸 그림이다.
도 7은 도 6에서 트레오닌 생산 증가를 보인 합성조절 sRNA들의 삼중 조합 적용을 통해 트레오닌 생산량 변화를 나타낸 그림이다.
도 8은 합성조절 sRNA 라이브러리 적용에 따른 프롤린 생산량의 변화를 나타낸 그림이다.
도 9는 도 8에서 프롤린 생산 증가를 보인 합성조절 sRNA들의 이중 조합 적용을 통해 프롤린 생산량 변화를 나타낸 그림이다.
도 10은 도 9에서 프롤린 생산 증가를 보인 합성조절 sRNA들의 삼중 조합 적용을 통해 프롤린 생산량 변화를 나타낸 그림이다.
도 11은 프롤린 생산 균주의 유가식 발효 조건 최적화 과정을 통해 얻은 그래프들이다. NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fur 균주를 사용하여 (a)는 기존 특허 및 논문에서의 발효 조건에서 (10 g/L glucose, 3 g/L (NH4)2SO4 첨가 2 L R/2 배지), (b)는 기존 배지에 1.6 g/L yeast extract 첨가하였을 때, (c)는 기존 배지에 3 g/L yeast extract를 첨가 및 기존 feeding 용액에 6 mL trace metal solution 첨가한 발효 조건에서 각각 유가식 발효를 진행하였다. (d)는 컨트롤 실험으로서, 기반 균주인 NMH26 p15PP3533 균주를 (c)의 발효 조건에서 배양하였을 때의 결과를 나타낸다. 각 그래프들에서 붉은 색 원은 세포 성장(OD600)을, 푸른 색 삼각형은 프롤린 농도(g/L)를 나타낸다.
도 12는 도 8에서 가장 높은 생산능을 보인 4종의 균주들 (단일 낙다운 적용)을 최적화된 발효 조건하에서 발효한 결과이다. (a)는 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fur 균주, (b)는 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fadR 균주, (c)는 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-aspC 균주, (d)는 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-mazF 균주. 각 그래프들에서 붉은 색 원은 세포 성장을, 푸른 색 삼각형은 프롤린 농도를 나타낸다.
도 13은 도 9에서 가장 높은 생산능을 보인 4종의 균주들 (이중 낙다운 조합 적용)을 최적화된 발효 조건하에서 발효를 수행한 결과이다. (a)는 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fur pColASm-metB 균주, (b)는 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fur pColASm-murE 균주, (c)는 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-chpA pColASm-fur 균주, (d)는 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-chpA pColASm-fadR 균주. 각 그래프들에서 붉은 색 원은 세포 성장(OD600)을, 푸른 색 삼각형은 프롤린 농도(g/L)를 나타낸다.
도 14는 발효를 수행한 모든 프롤린 생산 균주들의 exponential phase (E)와 stationary phase (S) 상태일 때 sRNA 플라스미드들의 보유 상태를 확인하기 위한 colony PCR 결과를 나타낸다. 이 때 균주 1부터 9까지는 표 2의 균주 번호와 동일하다. 이 때 붉은색 삼각형으로 표현된 위쪽 DNA 밴드는 ColA-Sm 플랫폼 기반 sRNA의 존재를, 아랫쪽 DNA 밴드는 CDF-Tc 플랫폼 기반 sRNA의 존재를 나타낸다.
도 15는 대장균 유전체 수준의 합성조절 sRNA 라이브러리를 본 발명에서의 신규 sRNA 발현 플랫폼에 이전하고 이를 균주에 적용하여 스크리닝하는 방법을 나타낸 그림이다.
도 16은 ColA-Sm 플랫폼 기반의 대장균 유전체 수준의 합성조절 sRNA 라이브러리를 인디고 생산 균주에 도입하고 색깔 스크리닝을 거쳐 균주들을 선별한 후 테스트 튜브에서 배양한 결과이다.
도 17은 도 16에서 높은 생산량을 보인 9종의 균주들을 50 mL MR 배지가 담긴 플라스크에서 배양한 결과이다.
도 18은 ColA-Sm 플랫폼 기반의 대장균 유전체 수준의 합성조절 sRNA 라이브러리를 비올라세인 생산 균주에 도입하고 색깔 스크리닝을 거쳐 균주들을 선별한 후 테스트 튜브에서 배양한 결과이다.
도 19는 도 18에서 높은 생산량을 보인 12종의 균주들을 50 mL MR 배지가 담긴 플라스크에서 배양하고 (a) 는 각 균주들의 생산량을 측정한 그래프이다. (b) 는 배양 후 각 플라스크를 찍은 사진이다. 비올라세인/디옥시비올라세인을 고농도로 생산하는 균주일수록 더 짙은 색깔을 띠게 된다.
도 20은 도 19에서 높은 비올라세인/디옥시비올라세인 생산능을 보이는 균주들을 유가식 발효한 결과이다. (a)는 E. coli BL21 pSB1C3-vioABDE pTac15K-Jli-vioC 균주에 pColA-ytfR 플라스미드가 삽입된 균주, (b)는 E. coli BL21 pSB1C3-vioABDE pTac15K-Jli-vioC 균주에 pColA-minD 플라스미드가 삽입된 균주. 각 그래프들에서 붉은 색 원은 세포 성장을, 푸른 색 삼각형은 비올라세인 농도를, 보라색 삼각형은 디옥시비올라세인 농도를 나타낸다. (a)와 (b)에서 붉은색 화살표는 IPTG에 의해 유도된 시점을 나타낸다. (c)는 발효를 수행한 모든 비올라세인 생산 균주들의 exponential phase (E)와 stationary phase (S) 상태일 때 sRNA 플라스미드들의 보유 상태를 확인하기 위한 colony PCR 결과를 나타낸다. 이 때 균주 1: 대조군 균주, 균주 2: (a)의 균주, 균주 3: (b)의 균주. 이 때 붉은색 삼각형으로 표현된 DNA 밴드는 ColA-Sm 플랫폼 기반 sRNA의 존재를 나타낸다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "sRNA (small RNA)"란, 단백질로 번역되지 않으며 상보적 결합을 통해 특정 mRNA의 번역을 효과적으로 억제하는, 보통 염기 서열의 길이가 200개 이하의 짧은 길이의 RNA이다.
본원에서 "리보좀 결합 부위(ribosome binding site)"란, mRNA의 전사를 위하여 리보좀이 mRNA상에 결합하는 부위를 말한다.
본원에서 "유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 표적유전자는 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다.
본 발명에서는 다양한 종류의 원핵생물에 적용가능하고, 동시에 다수의 표적유전자 발현을 억제할 수 있는 합성조절 sRNA 기반의 발현 조절 시스템을 개발하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 서로 공존 가능한 세 가지 항생제 마커(아프라마이신, 스트렙토마이신(또는 스펙티도마이신) 및 테트라사이클린)와 서로 공존 가능한 세 가지 복제원점(CDF, pBBR1 및 ColA)을 각각 독립적으로 포함하고, DsRed2 mRNA의 RBS와 상보적으로 결합하도록 하는 sRNA를 깁슨 어셈블리(Gibson assembly), 골든게이트 어셈블리(golden gate assembly), 라이게이션(ligation), 상동재조합(homologous recombination), SLIC(sequence and ligation-independent cloning), SLiCE(seamless ligation cloning extract), CPEC(circular polymerase extension cloning) 또는 유전자 합성으로 조합하여 총 9가지 종류의 DsRed2 발현 억제용 합성조절 sRNA 발현 벡터를 제작한 다음(도 1), 대장균에 리포터 플라스미드와 함께 도입하여 배양할 경우, 3 종류의 합성조절 sRNA 발현 벡터가 도입되더라도, 대장균의 생장이나, 발현 벡터의 안정성에 아무런 문제가 없다는 것을 확인하였다(도 2 내지 도 4).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 제1항생제 내성 유전자; 제1복제원점; 제1 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제1벡터; 및 제n항생제 내성 유전자; 제m복제원점; 제p 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화영역을 포함하는 제q벡터;를 포함하는 원핵생물의 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템으로, 상기 제1항생제 내성 유전자와 제n항생제 내성 유전자, 제1복제원점과 제m복제원점 및 제1표적유전자와 제p표적유전자는 서로 각각 상이하며, n은 2 내지 50의 정수인 것을 특징으로 하고, m은 2 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하며, q는 2 내지 500의 정수인 것을 특징으로 하고, p는 2 내지 20000의 정수인 것을 특징으로 하는 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 p는 표적유전자의 개수를 의미하며, 표적유전자는 벡터의 종류와 상관없이 모든 유전자를 표적유전자로 할 수 있기 때문에 2 내지 20000의 정수 범위를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항생제는 원핵생물의 사멸을 유도하는 항생제이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 앰피실린(ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 클로로암페니콜(chloramphenicol), 아프라마이신(apramycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 스펙티도마이신(spectinomycin), 테트라사이클린(tetracyclin), 에리트로마이신(erythromycin), 네오마이신(neomycin), 페니실린(penicillin), 액시노마이신(actinomycin), 가베니실린(garbenicillin), 겐타미신(gentamicin), 블라스티시딘(blasticidin), 마이코페놀릭산(mycophenolic acid), 퓨로마이신(puromycin), 제오신(zeocin), 보렐리딘(borrelidin), 이오노마이신(ionomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 이버멕틴(ivermectin), 에버멕틴(avermectin), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 나리딕식산(nalidixic acid), 노보비오신(novobiocin), 니스타틴(nystatin), 옥시테트라라시클린(oxytetracycline), 팩리택셀(paclitaxel), 폴리마이신(polymyxin), 리팜피신(rifampicin), 살리노마이신(salinomycin), 타일로신(tylosin), 발리노마이신(valinomycin), 밴코마이신(vancomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 및 빈크리스틴(vincristine) 으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 복제원점은 원핵생물의 내부로 도입된 플라스미드의 복제를 시작할 수 있는 서열이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 CloDF13(CDF), pBBR1, ColA, ColE1, pUC, pBR322, SC101, RSF1030(RSF), 및 RK2 으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 원핵생물은 sRNA를 발현할 수 있는 원핵생물이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 합성 sRNA 암호화 영역은 프로모터; MicC, SgrS 및 MicF 중 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합 부위(Hfq binding site); 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역; 및 터미네이터를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 sRNA의 발현을 유도할 수 있는 모든 종류의 프로모터가 이용가능하며, 바람직하게는 tac, trc, T7, BAD, λPR 및 앤더슨 합성 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Hfq 결합부위는 바람직하게는 MicC 유래인 것을 특징으로 할 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 터미네이터는 sRNA의 전사를 종료할 수 있는 모든 종류의 터미네이터가 이용가능하며, 바람직하게는 T1/TE 터미네이터일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역은 표적유전자에 따라 상보적 결합을 형성할 수 있는 최소한의 길이이면 족하며, 예시로서 20 염기 이상 50 염기 이하, 바람직하게는 19 염기 이상 37 염기 이하인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역은 표적 유전자 mRNA의 리보좀 결합 부위 (Ribosome binding site) 또는 개시 코돈으로 시작하는 단백질 코딩 서열과 전체적으로 또는 부분적으로 상보적 결합을 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에서 "상보적 결합"이란, 핵산서열간 서로 염기짝짓기(basepairing)하는 것을 의미하며, 표적유전자의 mRNA의 일부 영역과 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역의 서열이 약 70-80% 이상, 바람직하게는 약 80-90% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95-99% 이상 서로 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 원점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단 부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 sRNA의 발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.
본 발명에서 염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명에 있어서, 상기 표적유전자는 원핵생물 내에 존재하거나, 도입될 수 있으면 제한없이 이용가능하며, 바람직하게는 DsRed2, LuxR, AraC, KanR (kanamycin resistance gene), tyrR(tyrosine regulator), ppc (phosphoenolpyruvate carboxylase), csrA (carbon storage regulator), pgi (glucose-6-phosphate isomerase), glt (citrate synthase), accA (acetyl-CoA carboxyltransferase, alpha-subunit), accB (biotinylated biotin-carboxyl carrier protein), accC (acetyl-CoA carboxylase), accD (acetyl-CoA carboxyltransferase, beta-subunit), aceE (subunit of E1p component of pyruvate dehydrogenase complex), aceF (pyruvate dehydrogenase), ackA (propionate kinase / acetate kinase activity), adiY (AdiY is a positive DNA-binding transcriptional regulator that controls the arginine) decarboxylase (adi) system), argB (acetylglutamate kinase), argC (N-acetylglutamylphosphate reductase), argG (argininosuccinate synthase), argH (argininosuccinate lyase), asnC (transcriptional regulator that activates the expression of asnA, a gene involved in the synthesis of asparagine), aspA (aspartate ammonia-lyase), crp (CRP transcriptional dual regulator), csiD (predicted protein. CsiD is the product of a gene induced by carbon starvation), csiR (DNA-binding transcriptional repressor), cytR (transcription factor required for transport and utilization of ribonucleosides and deoxyribonucleosides), dcuA (The DcuA transporter is one of three transporters known to be responsible for the uptake of C4-dicarboxylates such as fumarate under anaerobic conditions), deoB (phosphopentomutase), deoC (deoxyribose-phosphate aldolase), deoR (The transcriptional repressor DeoR, for "Deoxyribose Regulator," is involved in the negative expression of genes related to transport and catabolism of deoxyribonucleoside nucleotides), fabH (KASIII, -ketoacyl-ACP synthases), fadD (fatty acyl-CoA synthetase), fadR (FadR Fatty acid degradation Regulon, is a multifunctional dual regulator that exerts negative control over the fatty acid degradative regulon [Simons80, Simons80a] and acetate metabolism), fbp (fructose-1,6-bisphosphatase), fnr (FNR is the primary transcriptional regulator that mediates the transition from aerobic to anaerobic growth), fruR (FruR is a dual transcriptional regulator that plays a pleiotropic role to modulate the direction of carbon flow through the different metabolic pathways of energy metabolism, but independently of the CRP regulator) , ftsL (essential cell division protein FtsL), ftsQ (essential cell division protein FtsQ), ftsW (essential cell division protein FtsW), ftsZ (essential cell division protein FtsZ), fur (Fur-Fe+2 DNA-binding transcriptional dual regulator), gabD (succinate semialdehyde dehydrogenase, NADP+-dependent), gabP (APC transporter), gabT (4-aminobutyrate aminotransferase), gadA (glutamate decarboxylase A subunit), gadB (glutamate decarboxylase B subunit), gadC (GABA APC transporter), glcC (GntR family transcriptional regulator, glc operon transcriptional activator), glpK (glycerol kinase), glpR (sn-Glycerol-3-phosphate repressor), glpX (fructose 1,6-bisphosphatase II), gltA (citrate synthase), hflD (lysogenization regulator), ihfA (IHF, Integration host factor, is a global regulatory protein), ihfB (IHF, Integration host factor, is a global regulatory protein), ilvB (acetohydroxybutanoate synthase/acetolactate synthase), ilvC (acetohydroxy acid isomeroreductase), ilvD (dihydroxy acid dehydratase), ilvG_1 (acetolactate synthase II, large subunit, N-ter fragment (pseudogene)), ilvG_2 (acetolactate synthase II, large subunit, C-ter fragment (pseudogene)), ilvH (acetolactate synthase/acetohydroxybutanoate synthase), ilvL (ilvGEDA operon leader peptide), ilvM (acetohydroxybutanoate synthase/acetolactate synthase), ilvN (acetohydroxybutanoate synthase / acetolactate synthase), ilvX (Predicted small protein), lexA (LexA represses the transcription of several genes involved in the cellular response to DNA damage), lpxC (UDP-3-O-acyl-N-acetylglucosamine deacetylase), marA (MarA participates in controlling several genes involved in resistance to antibiotics, oxidative stress, organic solvents and heavy metals.), metJ (MetJ transcriptional repressor), modE (ModE is the principal regulator that controls the transcription of operons involved in the transport of molybdenum and synthesis of molybdoenzymes and molybdate-related functions), nadB (L-aspartate oxidase), narL(nitrate/nitrite response regulator), pck (phosphoenolpyruvate carboxykinase), PdhR (PdhR, "pyruvate dehydrogenase complex regulator," regulates genes involved in the pyruvate dehydrogenase complex), phoP (PhoP-Phosphorylated DNA-binding transcriptional dual regulator. Member of the two-component regulatory system phoQ/phoP involved in adaptation to low Mg2+ environments and the control of acid resistance genes), pnuC (PnuC NMN transporter), ppsA (phosphoenolpyruvate synthetase), pta (Phosphate acetyltransferase), purA (adenylosuccinate synthetase), purB (adenylosuccinate lyase), purR (PurRHypoxanthine DNA-binding transcriptional repressor. PurR dimer controls several genes involved in purine nucleotide biosynthesis and its own synthesis), puuE (4-aminobutyrate aminotransferase), rbsA (ribose ABC transporter), rbsB (ribose ABC transporter), rbsD (ribose pyranase), rbsK (ribokinase), rbsR (The transcription factor RbsR, for "Ribose Repressor," is negatively autoregulated and controls the transcription of the operon involved in ribose catabolism and transport), rcsB (RcsB-BglJ DNAbinding transcriptional activator. RcsB protein for "Regulator capsule synthesis B," is a response regulator that belongs to the multicomponent RcsF/RcsC/RcsD/RcsA-RcsB phosphorelay system and is involved in the regulation of the synthesis of colanic acid capsule, cell division, periplasmic proteins, motility, and a small RNA) , rutR (RutR regulates genes directly or indirectly involved in the complex pathway of pyrimidine metabolism), serA (alpha-ketoglutarate reductase / D-3-phosphoglycerate dehydrogenase), serC (phosphohydroxythreonine aminotransferase / 3-phosphoserine aminotransferase), soxS (dual transcriptional activator and participates in the removal of superoxide and nitric oxide), sroD (SroD small RNA), zwf (glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase), asnA (asparagine synthetase A), asnB (asparagine synthetase B), carA (carbamoyl phosphate synthetase), carB (carbamoyl phosphate synthetase), ddlB (D-alanine-D-alanine ligase B), deoA (thymidine phosphorylase / uracil phosphorylase), deoD (purine nucleoside phosphorylase deoD-type), dpiA (dual transcriptional regulator involved in anaerobic citrate catabolism), fis (Fis, "factor for inversion stimulation", is a small DNA-binding and bending protein whose main role appears to be the organization and maintenance of nucleoid structure), gadE (GadE controls the transcription of genes involved in glutamate dependent system), gadW (GadW controls the transcription of genes involved in glutamate dependent system), gadX (GadX controls the transcription of genes involved in glutamate dependent system), glpF (GlpF glycerol MIP channel), ilvY (IlvY DNA-binding transcriptional dual regulator), ivbL (The ilvB operon leader peptide (IvbL)), lhgO (L-2-hydroxyglutarate oxidase), lpd (Lipoamide dehydrogenase), lrp (Lrp is a dual transcriptional regulator for at least 10% of the genes in Escherichia coli. These genes are involved in amino acid biosynthesis and catabolism, nutrient) transport, pili synthesis, and other cellular functions, including 1-carbon metabolism), metB (O-succinylhomoserine lyase / Osuccinylhomoserine(thiol)-lyase), metL (aspartate kinase / homoserine dehydrogenase), mraY (phospho-Nacetylmuramoyl-pentapeptide transferase), mraZ (Unknown function), murE (UDP-N-acetylmuramoylalanyl-Dglutamate 2,6-diaminopimelate ligase), murF (D-alanyl-D-alanine-adding enzyme), murG (Nacetylglucosaminyl transferase), nac (Nacregulates, without a coeffector, genes involved in nitrogen metabolism under nitrogen-limiting conditions), nadA (quinolinate synthase), nsrR (NsrR, the "nitritesensitive repressor" regulates genes involved in cell protection against nitric oxide (NO) ), panC (pantothenate synthetase), panD (Aspartate 1-decarboxylase), pgl (6-phosphogluconolactonase), pyrB (aspartate carbamoyltransferase, PyrB subunit), pyrC (dihydroorotase), pyrL (aspartate carbamoyltransferase, PyrI subunit), rob (Rob is a transcriptional dual regulator. Its N-terminal domain shares 49% identity with MarA and SoxS. These proteins activate a common set of about 50 target genes, the marA/soxS/rob regulon, involved in antibiotic resistance, superoxide resistance, and tolerance to organic solvents and heavy metals.) , rpe (ribulose phosphate 3-epimerase), talA (transaldolase A), thrA (aspartate kinase / homoserine dehydrogenase), thrB (homoserine kinase), thrC (threonine synthase), thrL (thr operon leader peptide), tktA (transketolase I), tktB (transketolase II), torR (two-component system, OmpR family, torCAD operon response regulator TorR), aroF (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase, tyrosine-repressible), aroA (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase), aroC (Chorismate synthase), pheA (chorismate mutase and prephenate dehydratase, P-protein), trpD (fused glutamine amidotransferase (component II) of anthranilate synthase/anthranilate phosphoribosyl transferase), dapA (4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase), ilvE (Branched-chain-amino-acid aminotransferase), lysA (Diaminopimelate decarboxylase), gltA (cistrate synthase), fumA (Fumarate hydratase class I, aerobic), glnA (glutamine synthetase), mdh (malate dehydrogenase), gdhA (NADP-specific glutamate dehydrogenase), argA (amino acid N-acetyltransferase and inactive acetylglutamate kinase), metA (Homoserine O-succinyltransferase), tdh (L-threonine dehydrogenase), livJ (branched-chain amino acid ABC transporter periplasmic binding protein), rhtC (Threonine efflux protein), yohJ (UPF0299 membrane protein), chpA (antitoxin of the ChpA-ChpR toxin-antitoxin system), aspC (aspartate aminotransferase), pfkA (ATP-dependent 6-phosphofructokinase isozyme 1), parE (DNA topoisomerase 4 subunit B), ytfR (predicted sugar transporter subunit), ilvA (L-threonine dehydratase, biosynthetic; also known as threonine deaminase), ilvG(Acetolactate synthase), minD (inhibitor of FtsZ ring polymerization; chromosome-membrane tethering protein; membrane ATPase of the MinCDEE system), hisJ(histidine transport system substrate-binding protein), yneH(Glutaminase), napG(Ferredoxin-type protein NapG), kdsA(2-dehydro-3-deoxyphosphooctonate aldolase), ygfA(5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase), ftsI(cell division protein FtsI (penicillin-binding protein 3)), ostB(trehalose 6-phosphate phosphatase), hybG(hydrogenase expression/formation protein HypC), ampG(MFS transporter, PAT family, beta-lactamase induction signal transducer AmpG), potG(spermidine/putrescine transport system permease protein), caiF(transcriptional activator CaiF), yfbR(5'-deoxynucleotidase YfbR), rfe(UDP-GlcNAc:undecaprenyl-phosphate/decaprenyl-phosphate GlcNAc-1-phosphate transferase), atpH(F-type H+-transporting ATPase subunit delta), tiaE(glyoxylate/hydroxypyruvate/2-ketogluconate reductase) 및 murI(Glutamate racemase)로 구성된 군에서 선택될 수 있으며,
더욱 바람직하게는 zwf (glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase), tktA (transketolase I), tktB (transketolase II), pgi (glucose-6-phosphate isomerase, fbp (fructose-1,6-bisphosphatase), serC (phosphohydroxythreonine aminotransferase / 3-phosphoserine aminotransferase), murE (UDP-N-acetylmuramoylalanyl-Dglutamate 2,6-diaminopimelate ligase), pps (phosphoenolpyruvate synthetase), aceE (subunit of E1p component of pyruvate dehydrogenase complex), pta (Phosphate acetyltransferase), purA (adenylosuccinate synthetase), ackA (propionate kinase / acetate kinase activity), pck (phosphoenolpyruvate carboxykinase), ppc (phosphoenolpyruvate carboxylase), accA (acetyl-CoA carboxyltransferase, alpha-subunit), fadD (fatty acyl-CoA synthetase), fabH (KASIII, -ketoacyl-ACP synthases), aspA (aspartate ammonia-lyase), carB (carbamoyl phosphate synthetase), ilvH (acetolactate synthase/acetohydroxybutanoate synthase), ilvM (acetohydroxybutanoate synthase/acetolactate synthase), ilvN (acetohydroxybutanoate synthase / acetolactate synthase), ilvC (acetohydroxy acid isomeroreductase), asnA (asparagine synthetase A), asnB (asparagine synthetase B), argH (argininosuccinate lyase), deoA (thymidine phosphorylase / uracil phosphorylase), thrA (aspartate kinase / homoserine dehydrogenase), metB (O-succinylhomoserine lyase / Osuccinylhomoserine(thiol)-lyase), metA, tdh, ilvL (ilvGEDA operon leader peptide), crp (CRP transcriptional dual regulator), fadR (FadR Fatty acid degradation Regulon, is a multifunctional dual regulator that exerts negative control over the fatty acid degradative regulon [Simons80, Simons80a] and acetate metabolism), fur (Fur-Fe+2 DNA-binding transcriptional dual regulator), lrp (Lrp is a dual transcriptional regulator for at least 10% of the genes in Escherichia coli. These genes are involved in amino acid biosynthesis and catabolism, nutrient) transport, pili synthesis, and other cellular functions, including 1-carbon metabolism), gltA (citrate synthase), pdhR (PdhR, "pyruvate dehydrogenase complex regulator," regulates genes involved in the pyruvate dehydrogenase complex), tyrR(tyrosine regulator), csrA (carbon storage regulator), lexA (LexA represses the transcription of several genes involved in the cellular response to DNA damage), aroF (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase, tyrosine-repressible), aroA (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase), aroC (Chorismate synthase), pheA (chorismate mutase and prephenate dehydratase, P-protein), trpD (fused glutamine amidotransferase (component II) of anthranilate synthase/anthranilate phosphoribosyl transferase), dapA (4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase), ilvE (Branched-chain-amino-acid aminotransferase), lysA (Diaminopimelate decarboxylase), gltA (cistrate synthase), fumA (Fumarate hydratase class I, aerobic), glnA (glutamine synthetase), mdh (malate dehydrogenase), gdhA (NADP-specific glutamate dehydrogenase), argA (amino acid N-acetyltransferase and inactive acetylglutamate kinase), metA (Homoserine O-succinyltransferase), tdh (L-threonine dehydrogenase), livJ (branched-chain amino acid ABC transporter periplasmic binding protein), rhtC (Threonine efflux protein), yohJ (UPF0299 membrane protein), chpA (antitoxin of the ChpA-ChpR toxin-antitoxin system), aspC (aspartate aminotransferase), pfkA (ATP-dependent 6-phosphofructokinase isozyme 1), parE (DNA topoisomerase 4 subunit B), ytfR (predicted sugar transporter subunit), ilvA (L-threonine dehydratase, biosynthetic; also known as threonine deaminase), ilvG(Acetolactate synthase), minD (inhibitor of FtsZ ring polymerization; chromosome-membrane tethering protein; membrane ATPase of the MinCDEE system), hisJ(histidine transport system substrate-binding protein), yneH(Glutaminase), napG(Ferredoxin-type protein NapG), kdsA(2-dehydro-3-deoxyphosphooctonate aldolase), ygfA(5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase), ftsI(cell division protein FtsI (penicillin-binding protein 3)), ostB(trehalose 6-phosphate phosphatase), hybG(hydrogenase expression/formation protein HypC), ampG(MFS transporter, PAT family, beta-lactamase induction signal transducer AmpG), potG(spermidine/putrescine transport system permease protein), caiF(transcriptional activator CaiF), yfbR(5'-deoxynucleotidase YfbR), rfe(UDP-GlcNAc:undecaprenyl-phosphate/decaprenyl-phosphate GlcNAc-1-phosphate transferase), atpH(F-type H+-transporting ATPase subunit delta), tiaE(glyoxylate/hydroxypyruvate/2-ketogluconate reductase) 및 murI(Glutamate racemase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 제1항생제 내성 유전자를 코딩하는 제1핵산 조각; 제1복제원점를 코딩하는 제2핵산 조각; 및 제1 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 코딩하는 제3핵산 조각을 깁슨 어셈블리(Gibson assembly), 골든게이트 어셈블리(golden gate assembly), 라이게이션(ligation), 상동재조합(homologous recombination), SLIC(sequence and ligation-independent cloning), SLiCE(seamless ligation cloning extract), CPEC(circular polymerase extension cloning) 또는 유전자 합성으로 연결하는 단계를 포함하는 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
본 발명은 또한, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템을 원핵생물 내로 도입하거나, 원핵생물 내에서 발현시키는 단계; 및 표적 유전자의 mRNA 발현을 억제하는 단계를 포함하는 표적유전자의 동시다중 발현억제 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템을 포함하는 표적유전자의 동시다중 발현억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 20 염기 내지 50 염기를 가지는 임의의 염기서열을 제조하는 단계; (b) 상기 염기서열을 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제1벡터의 표적유전자 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 삽입하여 제1 sRNA 라이브러리를 포함하는 제1벡터 라이브러리를 제조하는 단계; (c) 상기 제1벡터 라이브러리를 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 도입하여, 유용물질 생산량이 향상되는 경우, 발현이 억제된 유전자 후보군을 동정하여, 2 내지 500개의 발현억제 대상 유전자로 결정하는 단계; (d) 상기 결정된 2 내지 500개의 발현억제 대상 유전자를 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제q 벡터에 각각 삽입하는 단계; 및 (e) 상기 발현억제 대상 유전자를 포함하는 q개의 벡터가 도입된 재조합 균주를 제조하는 단계; 여기서, q는 2 내지 500의 정수인 것을 특징으로 하는 유용물질 생산 균주의 개량방법에 관한 것이다.
또한, 당업자는 본 발명의 방법을 통해, (a) 20 염기 내지 50 염기를 가지는 임의의 염기서열을 제조하는 단계; (b) 상기 임의의 염기서열을 상기 동시다중 표적유적자 발현억제 시스템의 제1벡터 내지 제q벡터의 표적유전자 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 삽입하여 제1 내지 제r sRNA 라이브러리를 포함하는 제1 내지 제r벡터 라이브러리를 제조하는 단계; (c) 상기 제1 내지 제r벡터 라이브러리를 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 도입하여 유용물질 생산량이 향상되는 경우, 발현이 억제된 유전자 후보군을 동정하여 s 개의 발현억제 대상 유전자 조합을 결정하는 단계를 포함하는 유용물질 생산 균주의 개량방법 역시 자명하게 도출할 수 있으며, 이를 기반으로 한 유용물질 생산 균주의 개량방법 역시 자명하게 도출할 수 있다.
여기서, q, r 및 s는 2 내지 500의 정수인 것을 특징으로 할 수 있다.
이는 동시에 다수의 라이브러리를 스크리닝하여 가장 효과가 좋은 유전자 조합을 복잡한 단계 없이 한 번의 스크리닝으로 바로 도출할 수 있어 기존의 유전자 회로 개선방법을 획기적으로 개량할 수 있다는 것을 의미한다.
한편 본 발명에서는 기존의 대사공학적으로 개량되어 플라스미드가 도입된 개조된 원핵생물에 본 발명에 따른 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템을 추가로 도입하여, 목적 물질의 생산량을 더욱 향상시킬 수 있을지를 확인하고자 하였다.
즉 본 발명의 다른 실시예에서는 기존 트레오닌 생산 연구에서 트레오닌 생산 경로를 강화시키고, 트레오닌 생산 경로상의 효소들이 생산물에 의한 활성 저해를 받지 않도록 피드백 저항성 효소로 개량을 함과 더불어 트레오닌 트랜스포터를 과발현한 균주(TH28C-pBRThrABCR3, KH Lee et al., Mol. Syst. Biol. 2007, 3(149))에, 본 발명에서 제작한 sRNA 라이브러리를 처리한 결과, 트레오닌 생산량을 추가로 증가시키는 8개의 유전자를 발굴하였으며(도 5), 이들의 조합을 통해 가장 트레오닌 생산능의 향상이 뛰어난 유전자 조합을 발굴하여, 30% 이상의 트레오닌 증산이 가능한 것을 확인하였다(도 6).
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 트레오닌(Threonine) 생합성 경로를 가지는 숙주세포에서, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제1 내지 제q벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 tktA, aroF, pta, ilvH, ilvE, glnA, fur 또는 chpA 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, tktA, aroF, pta, ilvH, ilvE, glnA fur 및 chpA로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있는 것을 특징으로 하는 트레오닌 생산능력이 향상된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 lacI(lactose operon repressor), metA(Homoserine O-succinyltransferase), lysA(Diaminopimelate decarboxylase), tdh(L-threonine dehydrogenase), iclR(AceBAK operon repressor) 및 tdcC(Threonine/serine transporter)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 결실된 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 상기 재조합 미생물은 thrA(Bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 1)의 1034번째 염기 서열이 C에서 T로 바뀐 돌연변이, lysC(lysine-sensitive aspartokinase 3)의 1055번째 염기 서열이 C에서 T로 바뀐 돌연변이, ilvA(l-threonine dehydratase, biosynthetic; also known as threonine deaminase)의 290번째 염기 서열이 C에서 T로 바뀐 돌연변이로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 조작된 것을 특징으로 하며, thrABC 오페론, ppc(phosphoenolpyruvate carboxylase), acs(acetyl-CoA synthetase)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 프로모터가 trc 프로모터로 치환된 것을 특징으로 하며, 또한 rhtA(threonine and homoserine efflux system), rhtB(homoserine, homoserine lactone and S-methyl-methionine efflux pump), rhtC(threonine efflux pump), thrAC1034T, thrB(homoserine kinase), thrC(L-threonine synthase)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 플라스미드 기반 과발현된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 기존의 합성조절 sRNA를 도입하여 프롤린 생산량을 증가시킨 대장균 균주(NMH26-p15PP3533, pKKtrcSargF-trcSglnA, M. Noh et al., Cell Systems (2017), 5, 1-9)에 본 발명에 따른 sRNA 라이브러리를 처리하여, 7개의 후보 유전자 군을 도출하였으며(도 8), 이들의 조합을 통해 프롤린 생산을 추가로 향상시키는 유전자 조합을 발굴하여 30%이상의 프롤린 증산이 추가로 가능한 것을 확인하였다(도 9).
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 프롤린(proline) 생합성 경로를 가지는 숙주세포에서, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제1 내지 제q벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 serC, murE, aspC, metB, fadR, fur 또는 chpA 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, serC, murE, aspC, metB, fadR, fur 및 chpA 로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있는 것을 특징으로 하는 프롤린 생산능력이 향상된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 lacI, speE, speG, argI, puuP, puuA, putA, putP, proP, speC, potE, 및 speF로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 결실된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 argECBH 오페론, speF-potE, 및 argD로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 프로모터가 trc 프로모터로 치환된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 PP3533 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 argF 및 glnA 유전자의 발현이 추가로 억제되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 유전자의 발현 억제는 합성조절 sRNA를 통해 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 프롤린 생산능이 향상된 재조합 미생물을 트레이스 메탈 용액(trace metal solution)을 포함하는 배지에서 유가식 발효를 통해 배양하는 단계를 포함하는 프롤린 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시예에서는 기존의 구축된 sRNA 라이브러리를 본 발명에 따른 sRNA 발현 벡터로 깁슨 어셈블리를 이용하여 빠르고 정확하며 효율적으로 이전한 다음, 인디고 및 비올라세인 생산 균주에 대하여 라이브러리 스크리닝을 통하여 인디고 또는 비올라세인 생산능을 향상시킬 수 있는 유전자 조합을 발굴하여, 인디고 또는 비올라세인의 생산능이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 16 내지 도 19).
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 인디고(indigo) 생합성 경로를 가지는 숙주세포에서, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제1 내지 제q벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 asnA, hisJ, yneH, napG, kdsA, ygfA, ftsl, aceF 또는 ostB 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, asnA, hisJ, yneH, napG, kdsA, ygfA, ftsl, aceF 및 ostB 로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있는 것을 특징으로 하는 인디고 생산능력이 향상된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 trpR, pykF 및 pykA로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 결실되고, tktA의 프로모터가 trc 프로모터로 치환되어 있으며, tnaA, fmo, aroGfbr, trpEfbr, 및 aroL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 fbr은 피드백 저항을 받지 않는다는 것을 뜻한다(feedback resistance).
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 비올라세인(violacein) 생합성 경로를 가지는 숙주세포에서, 상기 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 제1 내지 제q벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 ytfR, hybG, ampG, potG, caiF, minD, ilvM, yfbR, rfe, atpH, tiaE 또는 murI 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, ytfR, hybG, ampG, potG, caiF, minD, ilvM, yfbR, rfe, atpH, tiaE 및 murI로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있는 것을 특징으로 하는 비올라세인/디옥시비올라세인 생산능력이 향상된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 vioA, vioB, vioC, vioD 및 vioE로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 재조합 미생물을 트레이스 메탈 용액(trace metal solution)을 포함하는 배지에서 유가식 발효를 통해 배양하는 단계를 포함하는 비올라세인/디옥시비올라세인 생산 방법에 관한 것이다.
실시예
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
실시예 1. 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템의 성능 확인
1.1. 다양한 합성조절 sRNA 플랫폼 제작
본 발명에서는 다양한 합성조절 sRNA 플랫폼들을 구축하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다. 유용한 화합물의 생산을 위한 여러 종류의 플라스미드들과 동시에 사용될 수 있도록 설계하였는데, 보다 구체적으로 서로 공존 가능한 세 가지 항생제 마커 (Apramycin, Am로 표기; streptomycin 또는 spectinomycin, Sm으로 표기; tetracycline, Tc로 표기)를 사용하였고, 서로 공존 가능한 세 가지 복제원점 (CDF, pBBR1, ColA)을 이용하여 총 아홉 가지 벡터 (CDF-Am, CDF-Sm, CDF-Tc, pBBR1-Am, pBBR1-Sm, pBBR1-Tc, ColA-Am, ColA-Sm, ColA-Tc) 를 구축하였다(도 1). 이 때 [서열번호1]은 CDF 복제원점, [서열번호2]는 pBBR1 복제원점, [서열번호3]은 ColA 복제원점, [서열번호4]는 Am 항생제 마커, [서열번호5]는 Sm 항생제 마커, [서열번호6]은 Tc 항생제 마커 DNA 서열들을 의미한다.
본 발명에서 사용된 합성조절 sRNA는 PR 프로모터(서열번호7)를 기반으로 micC scaffold(서열번호8)와 T1/TE 터미네이터(서열번호9)를 활용하였다. 상기 아홉 개의 합성조절 sRNA 플랫폼 플라스미드들을 sRNA 조각, 항생제 마커(항생제 내성 유전자) 조각 및 복제원점 조각으로 구성된 세 개의 DNA 조각을 깁슨 어셈블리(gibson assembly)를 통해 제작하였다(D.G.Gibson et al., Nature Methods (2009), 6(5), 343-345).
sRNA 조각은 기존 특허(KR 10-1575587 B1)에서의 pWAS 플라스미드를 템플릿으로 삼아 [서열번호10/서열번호11]을 이용하여 PCR을 통해 수득하였다. 항생제 마커 조각들 중 Am 조각은 [서열번호12/서열번호13]를 통해, Sm 조각은 [서열번호14/서열번호15]을 통해, 그리고 Tc 조각은 [서열번호16/서열번호17]를 통해 수득하였다. 복제원점 조각들 중 CDF 조각은 [서열번호18/서열번호19]을 통해, pBBR1 조각은 [서열번호20/서열번호21]을 통해, 그리고 ColA 조각은 [서열번호22/서열번호23]를 통해 수득하였다.
[서열번호1] 5'- gatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatcttttgccctgtaaacgaaaaaaccacctggggaggtggtttgatcgaaggttaagtcagttggggaactgcttaaccgtggtaactggctttcgcagagcacagcaaccaaatctgtccttccagtgtagccggactttggcgcacacttcaagagcaaccgcgtgtttagctaaacaaatcctctgcgaactcccagttaccaatggctgctgccagtggcgttttaccgtgcttttccgggttggactcaagtgaacagttaccggataaggcgcagcagtcgggctgaacggggagttcttgcttacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgagccgagataccagtgtgtgagctatgagaaagcgccacacttcccgtaagggagaaaggcggaacaggtatccggtaaacggcagggtcggaacaggagagcgcaagagggagcgacccgccggaaacggtggggatctttaagtcctgtcgggtttcgcccgtactgtcagattcatggttgagcctcacggctcccacagatgcaccggaaaagcgtctgtttatgtgaactctggcaggagggcggagcctatggaaaaacgccaccggcgcggccctgctgttttgcctcacatgttagtcccctgcttatccacggaatctgtgggtaactttgtatgtgtccgcagcgc-3'
[서열번호2] 5'- tatgatcatttattctgcctcccagagcctgataaaaacggtgaatccgttagcgaggtgccgccggcttccattcaggtcgaggtggcccggctccatgcaccgcgacgcaacgcggggaggcagacaaggtatagggcggcgaggcggctacagccgatagtctggaacagcgcacttacgggttgctgcgcaacccaagtgctaccggcgcggcagcgtgacccgtgtcggcggctccaacggctcgccatcgtccagaaaacacggctcatcgggcatcggcaggcgctgctgcccgcgccgttcccattcctccgtttcggtcaaggctggcaggtctggttccatgcccggaatgccgggctggctgggcggctcctcgccggggccggtcggtagttgctgctcgcccggatacagggtcgggatgcggcgcaggtcgccatgccccaacagcgattcgtcctggtcgtcgtgatcaaccaccacggcggcactgaacaccgacaggcgcaactggtcgcggggctggccccacgccacgcggtcattgaccacgtaggccgacacggtgccggggccgttgagcttcacgacggagatccagcgctcggccaccaagtccttgactgcgtattggaccgtccgcaaagaacgtccgatgagcttggaaagtgtcttctggctgaccaccacggcgttctggtggcccatctgcgccacgaggtgatgcagcagcattgccgccgtgggtttcctcgcaataagcccggcccacgcctcatgcgctttgcgttccgtttgcacccagtgaccgggcttgttcttggcttgaatgccgatttctctggactgcgtggccatgcttatctccatgcggtaggggtgccgcacggttgcggcaccatgcgcaatcagctgcaacttttcggcagcgcgacaacaattatgcgttgcgtaaaagtggcagtcaattacagattttctttaacctacgcaatgagctattgcggggggtgccgcaatgagctgttgcgtaccccccttttttaagttgttgatttttaagtctttcgcatttcgccctatatctagttctttggtgcccaaagaagggcacccctgcggggttcccccacgccttcggcgcggctccccctccggcaaaaagtggcccctccggggcttgttgatcgactgcgcggccttcggccttgcccaaggtggcgctgcccccttggaacccccgcactcgccgccgtgaggctcggggggcaggcgggcgggcttcgcccttcgactgcccccactcgcataggcttgggtcgttccaggcgcgtcaaggccaagccgctgcgcggtcgctgcgcgagccttgacccgccttccacttggtgtccaaccggcaagcgaagcgcgcaggccgcaggccggaggcttttccccagagaaaattaaaaaaattgatggggcaaggccgcaggccgcgcagttggagccggtgggtatgtggtcgaaggctgggtagccggtgggcaatccctgtggtcaagctcgtgggcaggcgcagcctgtccatcagcttgtccagcagggttgtccacgggccgagcgaagcgagccagccggtggccgctcgcggccatcgtccacatatccacgggctggcaagggagcgcagcgaccgcgcagggcgaagcccggagagcaagcccgtagggcgccgcagccgccgtaggcggtcacgactttgcgaagcaaagtctagtgagtatactcaagcattgagtggcccgccggaggcaccgccttgcgctgcccccgtcgagccggttggacaccaaaagggaggggcaggcatggcggcatacgcgatcatgcgatgcaagaagctggcgaaaatgggcaacgtggcggccagtctcaagcacgcctaccgcgagcgcgagacgcccaacgctgacgccagcaggacgccagagaacgagcactgggcggccagcagcaccgatgaagcgatgggccgactgcgcgagttgctgccagagaagcggcgcaaggacgctgtgttggcggtcgagtacgtcatgacggccagcccggaatggtggaagtcggccagccaagaacagcaggcggcgttcttcgagaaggcgcacaagtggctggcggacaagtacggggcggatcgcatcgtgacggccagcatccaccgtgacgaaaccagcccgcacatgaccgcgttcgtggtgccgctgacgcaggacggcaggctgtcggccaaggagttcatcggcaacaaagcgcagatgacccgcgaccagaccacgtttgcggccgctgtggccgatctagggctgcaacggggcatcgagggcagcaaggcacgtcacacgcgcattcaggcgttctacgaggccctggagcggccaccagtgggccacgtcaccatcagcccgcaagcggtcgagccacgcgcctatgcaccgcagggattggccgaaaagctgggaatctcaaagcgcgttgagacgccggaagccgtggccgaccggctgacaaaagcggttcggcaggggtatgagcctgccctacaggccgccgcaggagcgcgtgagatgcgcaagaaggccgatcaagcccaagagacggcccgagaccttcgggagcgcctgaagcccgttctggacgccctggggccgttgaatcgggatatgcaggccaaggccgccgcgatcatcaaggccgtgggcgaaaagctgctgacggaacagcgggaagtccagcgccagaaacaggcccagcgccagcaggaacgcgggcgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcgaataaatacctgtgacggaagatcacttcgcagaataaataaatcctggtgtccctgttgatacc-3'
[서열번호3] 5'- aaacgtcctagaagatgccaggaggatacttagcagagagacaataaggccggagcgaagccgtttttccataggctccgcccccctgacgaacatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctgatggctccctcttgcgctctcctgttcccgtcctgcggcgtccgtgttgtggtggaggctttacccaaatcaccacgtcccgttccgtgtagacagttcgctccaagctgggctgtgtgcaagaaccccccgttcagcccgactgctgcgccttatccggtaactatcatcttgagtccaacccggaaagacacgacaaaacgccactggcagcagccattggtaactgagaattagtggatttagatatcgagagtcttgaagtggtggcctaacagaggctacactgaaaggacagtatttggtatctgcgctccactaaagccagttaccaggttaagcagttccccaactgacttaaccttcgatcaaaccgcctccccaggcggttttttcgtttacagagcaggagattacgacgatcgtaaaaggatctcaagaagatcctttacggattcccgacacca-3'
[서열번호4] 5'- atgtcatcagcggtggagtgcaatgtcgtgcaatacgaatggcgaaaagccgagctcatcggtcagcttctcaaccttggggttacccccggcggtgtgctgctggtccacagctccttccgtagcgtccggcccctcgaagatgggccacttggactgatcgaggccctgcgtgctgcgctgggtccgggagggacgctcgtcatgccctcgtggtcaggtctggacgacgagccgttcgatcctgccacgtcgcccgttacaccggaccttggagttgtctctgactcattctggcgcctgccaaatgtaaagcgcagcgcccatccatttgcctttgcggcagcggggccacaggcagagcagatcatctctgatccattgcccctgccacctcactcgcctgcaagcccggtcgcccgtgtccatgaactcgatgggcaggtacttctcctcggcgtgggacacgatgccaacacgacgctgcatcttgccgagttgttggcaaaggttccctatggggtgccgagacactgcaccattcttcaggatggcaagttggtacgcgtcgattatctcgagaatgaccactgctgtgagcgctttgccttggcggacaggtggctcaaggagaagagccttcagaaggaaggtccagtcggtcatgcctttgctcggttgatccgctcccgcgacattgtggcgacagccctgggtcaactgggccgagatccgttgatcttcctgcatccgccagaggcgggatgcgaagaatgcgatgccgctcgccagtcgattggctga-3'
[서열번호5] 5'- atgagggaagcggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatcgagcgccatctcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggcggcctgaagccacacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaaacaacgcggcgagctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagcgagattctccgcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgttatccagctaagcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggtatcttcgagccagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaacatagcgttgccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcctgaacaggatctatttgaggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggctggcgatgagcgaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggcaaaatcgcgccgaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaataa-3'
[서열번호6] 5'- atgaaaattattaatattggagttttagctcatgttgatgcaggaaaaactaccttaacagaaagcttattatataacagtggagcgattacagaattaggaagcgtggacaaaggtacaacgaggacggataatacgcttttagaacgtcagagaggaattacaattcagacaggaataacctcttttcagtgggaaaatacgaaggtgaacatcatagacacgccaggacatatggatttcttagcagaagtatatcgttcattatcagttttagatggggcaattctactgatttctacaaaagatggcgtacaagcacaaactcgtatattatttcatgcacttaggaaaatggggattcccacaatcttttttatcaataagattgaccaaaatggaattgatttatcaacggtttatcaggatattaaagagaaactttctgccgaaattgtaatcaaacagaaggtagaactgtatcctaatgtgtgtgtgacgaactttaccgaatctgaacaatgggatacggtaatagagggaaacgatgaccttttagagaaatatatgtccggtaaatcattagaagcattggaactcgaacaagaggaaagcataagatttcagaattgttctctgttccctctttatcatggaagtgcaaaaagtaatatagggattgataaccttatagaagttattactaataaattttattcatcaacacatcgaggtccgtctgaactttgcggaaatgttttcaaaattgaatatacaaaaaaaagacaacgtcttgcatatatacgcctttatagtggagtactacatttacgagattcggttagagtatcagaaaaagaaaaaataaaagttacagaaatgtatacttcaataaatggtgaattatgtaagattgatagagcttattctggagaaattgttattttgcaaaatgagtttttgaagttaaatagtgttcttggagatacaaaactattgccacagagaaaaaagattgaaaatccgcaccctctactacaaacaactgttgaaccgagtaaacctgaacagagagaaatgttgcttgatgcccttttggaaatctcagatagtgatccgcttctacgatattacgtggattctacgacacatgaaattatactttctttcttagggaaagtacaaatggaagtgattagtgcactgttgcaagaaaagtatcatgtggagatagaactaaaagagcctacagtcatttatatggagagaccgttaaaaaatgcagaatataccattcacatcgaagtgccgccaaatcctttctgggcttccattggtttatctgtatcaccgcttccgttgggaagtggaatgcagtatgagagctcggtttctcttggatacttaaatcaatcatttcaaaatgcagttatggaagggatacgctatggttgtgaacaaggattgtatggttggaatgtgacggactgtaaaatctgttttaagtatggcttatactatagccctgttagtaccccagcagattttcggatgcttgctcctattgtattggaacaagtcttaaaaaaagctggaacagaattgttagagccatatcttagttttaaaatttatgcgccacaggaatatctttcacgagcatacaacgatgctcctaaatattgtgcgaacatcgtagacactcaattgaaaaataatgaggtcattcttagtggagaaatccctgctcggtgtattcaagaatatcgtagtgatttaactttctttacaaatggacgtagtgtttgtttaacagagttaaaagggtaccatgttactaccggtgaacctgtttgccagccccgtcgtccaaatagtcggatagataaagtacgatatatgttcaataaaataact-3'
[서열번호7] 5'- taacaccgtgcgtgttgactattttacctctggcggtgataatggttgc-3'
[서열번호8]
5'- tttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggcttttttt-3'
[서열번호9]
5'- ccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttata-3'
[서열번호10] 5'-GGTAAACCCAGGAGGTATAG-3'
[서열번호11] 5'-GTGCCACCTAAATTGTAAGC-3'
[서열번호12] 5'-GCTTACAATTTAGGTGGCAC ACGGTAACTGATGCCGTATTTG-3'
[서열번호13] 5'-CATTGTAACCTATGATTATC GAAGAACTCCAGCATGAGATCC-3'
[서열번호14] 5'-GCTTACAATTTAGGTGGCAC GACCGAGTGAGCTAGCTATTTG-3'
[서열번호15] 5'-CATTGTAACCTATGATTATC CTGAGCAATAACTAGCATAAC-3'
[서열번호16] 5'-GCTTACAATTTAGGTGGCAC GACAGTGGAGTATATCGACCAG-3'
[서열번호17] 5'-CATTGTAACCTATGATTATC GCTCACATGTAGTTTATAATAAC-3'
[서열번호18] 5'-CTATACCTCCTGGGTTTACC AAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3'
[서열번호19] 5'-GATAATCATAGGTTACAATG TTTATCAGGGTTATTGTCTC-3'
[서열번호20] 5'-CTATACCTCCTGGGTTTACC GGTATCAACAGGGACACCAGG-3'
[서열번호21] 5'-GATAATCATAGGTTACAATG TATGATCATTTATTCTGCCTCC-3'
[서열번호22] 5'-CTATACCTCCTGGGTTTACC TATCAGGGTTATTGTCTCATG-3'
[서열번호23] 5'-GATAATCATAGGTTACAATG CGCAACGCAATTAATGTAAG-3'
1.2. 다양한 합성조절 sRNA 효율 테스트를 위한 리포터 플라스미드 제작
다양한 플랫폼 sRNA들의 유전자 발현 억제능을 확인하기 위해서 우선 DsRed2 유전자를 포함하고 있는 리포터 플라스미드들을 제작하였다. 리포터 플라스미드들 중 pACYC184-DsRed2는 기존 문헌에서 제작된 바와 동일한 플라스미드를 활용하였다(M. Noh et al., Cell Systems (2017), 5, 1-9).
pTac15K-DsRed2 (p15A 복제원점, kanamycin -Km으로 표기- 항생제 마커), pTrc99A-DsRed2 (ColE1 복제원점, ampicilin -Ap로 표기- 항생제 마커) 리포터 플라스미드 구축은 먼저 pTac15K와 pTrc99A를 템플릿으로 하여 [서열번호24/서열번호25]를 통하여 PCR을 통해 깁슨 어셈블리(gibson assembly)를 위한 플라스미드 조각을 제조한 다음, DsRed2 유전자를 [서열번호26/서열번호27]을 통하여 PCR 반응으로 수득한 다음, 상기 두 조각을 깁슨 어셈블리를 통해 조립함으로써 pTac15K-DsRed2, pTrc99A-DsRed2 리포터 플라스미드를 구축하였다.
[서열번호24] 5'-GGATGAGAGAAGATTTTCAG-3'
[서열번호25] 5'-TTTTTTTTTTTGTGTGAAATTGTTATCCGC-3'
[서열번호26] 5'-ATTAACTTTATTAATTAAAGGAGGACAAATATATGGCGAGCAGTGAGAACGTC-3'
[서열번호27]
5'-CTGAAAATCTTCTCTCATCC ATTACGCCACCAGGGCATAGTTTTC-3'
1.3. 다양한 합성조절 sRNA의 DsRed2 형광 단백질에 대한 낙다운 효율 테스트 및 성능 조사
실시예 1-1에서 구축한 다양한 합성조절 sRNA 플랫폼 플라스미드와 DsRed2 형광단백질 발현 리포터 플라스미드를 이용하여 합성조절 sRNA의 DsRed2 형광 단백질에 대한 낙다운 테스트 및 각 플랫폼의 성능 조사를 아래와 같이 진행하였다.
기반 균주는 Escherichia coli W3110을 사용하였다. 우선 DsRed2 형광단백질의 발현을 낙다운 하기 위한 합성조절 sRNA를 구축함에 있어, 다양한 합성조절 sRNA 플랫폼 플라스미드들을 템플릿으로 삼아 [서열번호28/서열번호29]를 이용한 inverse PCR 반응을 이용하였다. PCR을 통해 생성된 DNA 중 DpnI 제한효소 (엔지노믹스, 대한민국)로 템플릿을 제거하였으며, 뒤따른 T4 polynucleotide kinase (엔지노믹스, 대한민국)와 T4 ligase (엘피스 바이오텍, 대한민국)에 의한 반응을 통해 완성된 anti-DsRed2-sRNA 플라스미드를 제작하였다.
모든 클로닝 상의 DNA 서열 확인 작업은 Cosmogenetech사 (대한민국)를 통하여 진행하였다. 상기에서 명시한 바와 같이 구축된 9개의 anti-DsRed2-sRNA 플라스미드들과 세 가지 DsRed2- 리포터 플라스미드들을 이용하여 대사공학에서 자주 사용되는 세 가지 리포터 플라스미드들 - 각각 세 가지 다른 항생제 마커를 지니고 있는 - 에 대한 다양한 합성조절 sRNA의 낙다운 성능을 판단하고자 하였다.
구축한 9개의 anti-DsRed2-sRNA - 각각 CDF-Am, CDF-Sm, CDF-Tc, pBBR1-Am, pBBR1-Sm, pBBR1-Tc, ColA-Am, ColA-Sm, ColA-Tc 플랫폼 플라스미드에 삽입 - 를 pACYC184-DsRed2 리포터 플라스미드와 함께 E. coli W3110 균주에 형질전환하였으며, 5 mL의 LB (Luria-Bertani) 배지가 담긴 테스트 튜브에 접종된 채로 24시간 동안 섭씨 37도씨에서 200 RPM으로 배양한 다음, OD600이 보정된 채로 (OD600=2) 96 well standard opaque 마이크로플레이트에 옮긴 후, microplate reader을 통해 형광 세기를 측정하였다. DsRed2 형광 단백질의 excitation 파장은 562 nm, emission 파장은 603 nm, 그리고 cutoff 값은 590 nm로 설정하고 측정하였다.
또한, 상기 9개의 anti-DsRed2-sRNA를 pTac15K-DsRed2 리포터 플라스미드와 함께 E. coli W3110 균주에 형질전환 한 뒤 배양하여, 상기와 동일하게 형광 세기를 측정한 하였다
또한, 상기 9개의 anti-DsRed2-sRNA를 pTrc15K-DsRed2 리포터 플라스미드와 함께 E. coli W3110 균주에 형질전환 한 뒤 배양하여, 상기와 동일하게 형광세기를 측정하였다.
그 결과, 총 6가지의 플랫폼 (CDF-Sm, CDF-Tc, pBBR1-Am, pBBR1-Sm, pBBR1-Tc, ColA-Sm) 들을 실제 대사공학에서 사용될 수 있는 플랫폼 후보로 선정하였다. 선정된 플랫폼들은 다양한 환경의 DsRed2 발현 균주들에서 모두 효과적인 목표 유전자 발현 억제능을 보여주었다 (도2). ColA-Tc, ColA-Am 플랫폼은 클로닝과정에서 리포터 플라스미드와 함께 형질전환하였을 경우 안정성이 떨어졌고, CDF-Am 플랫폼은 액체 배지에서 성장 저해 문제를 나타내고 pTrc99A-DsRed2 리포터에 대한 낙다운 성능이 떨어졌기에 플랫폼 후보에서 제외하였다.
본 발명은 균주내의 3가지 유전자를 동시에 낙다운 하기 위해 ColA-Sm, CDF-Tc, pBBR1-Am 3가지 플랫폼을 선정하여 추후 대사공학적 실시예에서 사용하였다. 이들 중 하나의 플랫폼을 일차 라이브러리 제작 대상으로 선정하였다. 이 때 일차 스크리닝 플랫폼이라 함은 일반적으로 사용에 편리하도록 본 발명자들이 지정한 것이지, 본 발명의 용법에 한정을 주는 것이 아님은 자명할 것이다.
[서열번호28] 5'-GAGAACGTCATC GCAACCATTATCACCGCCAG-3'
[서열번호29] 5'-ACTGCTCGCCAT TTTCTGTTGGGCCATTG CATTG-3'
1.4. 다양한 조합의 합성조절 sRNA 플랫폼이 숙주 대장균의 성장에 미치는 영향
1) 단일 sRNA 플랫폼
실시예 1-3에서 제조한 합성조절 sRNA 플랫폼 플라스미드가 여러 조합으로 대장균 균주에 도입되었을 때, 숙주 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보고자하였다. 먼저 단일 sRNA 플랫폼 도입 후 균주 생장 테스트를 하였는데, 대사공학적으로 사용되는 실제 환경과 최대한 유사한 환경에서 테스트하고자 리포터 플라스미드 각각 한 종이 이미 도입된 대장균 균주에 각 sRNA 플랫폼을 도입하였다. 따라서 상기 실시예에서 언급된 pTac15K-dsRed2, pTrc99A-dsRed2, pACYC184-dsRed2 리포터 플라스미드를 각각 보유하고 있는 E. coli W3110 균주 세 종에 실시예 1.3에서 선정한 6가지 sRNA 플랫폼을 각각 도입하여 다음과 같은 18종의 균주를 제작하였다: Tac-pBBR1Am, Tac-pBBR1Tc, Tac-pBBR1Sm, Tac-ColASm, Tac-CDFTc, Tac-CDFSm, Trc-pBBR1Am, Trc-pBBR1Tc, Trc-pBBR1Sm, Trc-ColASm, Trc-CDFTc, Trc-CDFSm, ACYC-pBBR1Am, ACYC-pBBR1Tc, ACYC-pBBR1Sm, ACYC-ColASm, ACYC-CDFTc, ACYC-CDFSm.
제작한 균주들과 각 대조군 균주들 (Ctrl로 표기; sRNA 플랫폼이 도입되지 않고 각각의 리포터 플라스미드만 도입된 균주)을 각기 5 mL의 LB 배지가 들어있는 테스트 튜브에 접종하여 16시간동안 37°C, 200 RPM에서 배양하였으며, 모든 균주들은 세 종씩 접종하여 테스트하였다. 그 후, 각 well에 200 μL의 LB 배지가 유입된 microplate에 모든 균주들을 24 시간동안 계대 배양을 진행하였는데 (1일 차), 이 때 Bioscreen C를 이용하여 교반이 이루어짐과 동시에 모든 균주들의 OD600을 1시간마다 측정하도록 하였다. 이렇게 24 시간동안의 배양이 종료된 후, 다시 동일한 조건의 microplate 상에 모든 균주들을 24 시간동안 계대 배양을 진행하였다 (2일 차). 이 때 역시 Bioscreen C를 이용하여 균주 생장을 측정하였다. 3일 차 계대 배양 또한 동일하게 수행하였다.
그 결과, 도 3의 상단 세 개의 그래프 (a) 에 개시된 바와 같이 단일 sRNA 플랫폼의 도입은 숙주 대장균의 성장에 영향을 끼치지 않는 것을 확인하였다.
2) 이중 sRNA 플랫폼
본 연구진은 나아가 대장균 균주가 두 종의 sRNA 플랫폼을 동시에 보유하고 있을 때의 생장 곡선 또한 분석하고자 하였다. 따라서 상기에서 언급된 바와 같이 세 종의 리포터 플라스미드가 도입된 E. coli W3110 균주에 다음과 같은 조합으로 sRNA 플랫폼을 형질전환한 균주들 21종을 제작하였다: Tac-ColASm-pBBR1Am, Tac-ColASm-pBBR1Tc, Tac-ColASm-CDFTc, Tac-CDFSm-pBBR1Am, Tac-CDFSm-pBBR1Tc, Tac-CDFTc-pBBR1Am, Tac-CDFTc-pBBR1Sm, Trc-ColASm-pBBR1Am, Trc-ColASm-pBBR1Tc, Trc-ColASm-CDFTc, Trc-CDFSm-pBBR1Am, Trc-CDFSm-pBBR1Tc, Trc-CDFTc-pBBR1Am, Trc-CDFTc-pBBR1Sm, ACYC-ColASm-pBBR1Am, ACYC-ColASm-pBBR1Tc, ACYC-ColASm-CDFTc, ACYC-CDFSm-pBBR1Am, ACYC-CDFSm-pBBR1Tc, ACYC-CDFTc-pBBR1Am, ACYC-CDFTc-pBBR1Sm.
제작한 균주들에 대한 생장 테스트는 상기 단일 sRNA 플랫폼에 대한 테스트와 동일한 방식으로 수행하였다.
그 결과, 도 3의 중앙 세 개의 그래프 (b)에 개시된 바와 같이 두 종의 sRNA 플랫폼들의 도입은 숙주 대장균 균주의 생장에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
3) 삼중 sRNA 플랫폼
본 연구진은 마지막으로 세 종의 sRNA 플랫폼의 동시 도입이 숙주 대장균 균주의 생장에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 따라서 상기에서 언급된 바와 같이 세 종의 리포터 플라스미드가 도입된 E. coli W3110 균주에 다음과 같은 조합으로 sRNA 플랫폼을 형질전환한 균주들 3종을 제작하였다: Tac-ColASm-pBBR1Am-CDFTc, Trc-ColASm-pBBR1Am-CDFTc, ACYC-ColASm-pBBR1Am-CDFTc.
제작한 균주들에 대한 생장 테스트는 상기 단일 sRNA 플랫폼에 대한 테스트와 동일한 방식으로 수행하였다.
그 결과, 도 3의 하단 세 개의 그래프 (c)에 개시된 바와 같이 세 종의 sRNA 플랫폼들의 도입은 숙주 대장균 균주의 생장에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
1.5. 다양한 조합의 합성조절 sRNA 플랫폼들의 대장균 숙주 내에서의 안정성
실시예 1.4를 진행함에 있어서, 1일 차, 2일 차, 3일 차 배양이 종료될 때마다 각 세포를 일정량 수득하여 colony PCR을 진행하여 해당 균주에 sRNA 플랫폼들이 안정하게 존재하는지를 테스트하였다. 이 때, 보다 쉽게 각 플랫폼들을 구분하고자 서로 다른 복제 원점은 서로 다른 길이의 PCR 산물을 제작하도록 하는 아래의 프라이머들 6종을 사용하였다. 이 때 [서열번호30], [서열번호31]은 CDF 복제원점에 특이적인 것으로 0.34 kb의 PCR 산물을 생성하고, [서열번호 32], [서열번호 33]은 pBBR1 복제원점에 특이적인 것으로 1.08 kb의 PCR 산물을 생성하며, [서열번호 34], [서열번호 35]는 ColA 복제원점에 특이적인 것으로 0.65 kb의 PCR 산물을 생성하도록 설계하였다.
[서열번호30] 5'-CAACCATGAATCTGACAGTAC-3'
[서열번호31] 5'-CTCTGCGAACTCCCAGTTAC-3'
[서열번호32] 5'-CGTTGCGTAAAAGTGGCAGTC-3'
[서열번호33] 5'-GCTTCTTGCATCGCATGATC-3'
[서열번호34] 5'-TCCGTAAAGGATCTTCTTGAG-3'
[서열번호35] 5'-GTCCTAGAAGATGCCAGGAG-3'
PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 3일 차 계대 전까지는 모두 sRNA를 보유하고 있었지만 3일 차에는 몇 몇 균주에서 sRNA가 소실된다는 것을 알 수 있다. 하지만 대부분의 균주들은 sRNA 플랫폼들을 안정하게 지니고 있다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 주요 대사 회로 상의 유전자들에 대한 ColA-Sm 및 CDF-Tc 플랫폼을 이용한 sRNA 라이브러리 구축
실시예 1-3에서 선별한 합성조절 sRNA 발현 플랫폼의 실제 유용물질 생산 균주에의 활용 가능성을 확인하고자 대장균 내의 주요 대사회로상의 유전자들을 선별하고 이 유전자의 발현을 억제시키는 합성조절 sRNA 라이브러리를 구축하였다.
먼저, 라이브러리를 구축할 플랫폼 벡터는 ColA-Sm과 CDF-Tc 로 선정하였고, 이렇게 선정한 각각의 플랫폼에 총 61가지의 주요 유전자들의 발현을 억제시킬 합성조절 sRNA 를 구축하였다. 합성조절 sRNA 의 목표 유전자들은 1) 주요 대사 경로 (해당 경로 및 TCA 회로 상에서 파생되는 주요 경로), 2) 대사 물질 transporter, 3) 세포 사멸, 4) 대사 회로 조절에 관여되는 유전자들을 선별하였다 (표 1). sRNA 라이브러리 구축시에는 상기 실시예 1.3에서 anti-DsRed2 sRNA를 구축하였을 때와 동일한 방법을 사용하였다. 즉, 우선 inverse PCR을 통하여 promoter와 micC 사이에 target binding sequence 24mer를 삽입하고, 뒤따른 DpnI 제한 효소 및 T4 PNK와 T4 ligase에 의하여 ligation 된 후 시퀀싱을 통하여 올바른 클론을 선택할 수 있었다.
이렇게 구축한 61 종류의 sRNA에 해당하는 타겟 유전자와 그에 해당하는 target binding sequence는 하기 표 1에 개시하였다.
합성조절 sRNA 의 목표 유전자들 및 서열
서열번호 목표 유전자 타겟 유전자 상 결합 염기서열 (5'-3')
42 zwf ATGGCGGTAACGCAAACAGCCCAG
43 tktA ATGTCCTCACGTAAAGAGCTTGCC
44 pgi ATGAAAAACATCAATCCAACGCAG
45 pfkA ATGATTAAGAAAATCGGTGTGTTG
46 fbp ATGAAAACGTTAGGTGAATTTATT
47 serC ATGGCTCAAATCTTCAATTTTAGT
48 aroF ATGCAAAAAGACGCGCTGAATAAC
49 aroA ATGGAATCCCTGACGTTACAACCC
50 aroC ATGGCTGGAAACACAATTGGACAA
51 pheA ATGACATCGGAAAACCCGTTACTG
52 trpD ATGGCTGACATTCTGCTGCTCGAT
53 dapA ATGTTCACGGGAAGTATTGTCGCG
54 murE GTGGCAGATCGTAATTTGCGCGAC
55 lysA ATGCCACATTCACTGTTCAGCACC
56 pps ATGTCCAACAATGGCTCGTCACCG
57 aceE ATGTCAGAACGTTTCCCAAATGAC
58 pta GTGTCCCGTATTATTATGCTGATC
59 ackA ATGTCGAGTAAGTTAGTACTGGTT
60 pck ATGCGCGTTAACAATGGTTTGACC
61 ppc ATGAACGAACAATATTCCGCATTG
62 gltA ATGGCTGATACAAAAGCAAAACTC
63 fumA ATGTCAAACAAACCCTTTCATTAT
64 mdh ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCT
65 accA ATGAGTCTGAATTTCCTTGATTTT
66 fadD TTGAAGAAGGTTTGGCTTAACCGT
67 fabH ATGTATACGAAGATTATTGGTACT
68 aspC ATGTTTGAGAACATTACCGCCGCT
69 aspA ATGTCAAACAACATTCGTATCGAA
70 carB ATGCCAAAACGTACAGATATAAAA
71 ilvH ATGCGCCGGATATTATCAGTCTTA
72 ilvG ATGAATGGCGCACAGTGGGTGG
73 ilvM ATGATGCAACATCAGGTCAATGTA
74 ilvN ATGCAAAACACAACTCATGACAAC
75 ilvA ATGGCTGACTCGCAACCCCTGTCC
76 ilvC ATGGCTAACTACTTCAATACACTG
77 ilvE ATGACCACGAAGAAAGCTGATTAC
78 asnA ATGAAAACCGCTTACATTGCCAAA
79 asnB ATGTGTTCAATTTTTGGCGTATTC
80 argH ATGGCACTTTGGGGCGGGCGTTTT
81 deoA TTGTTTCTCGCACAAGAAATTATT
82 glnA ATGTCCGCTGAACACGTACTGACG
83 gdhA ATGGATCAGACATATTCTCTGGAG
84 argA GTGGTAAAGGAACGTAAAACCGAG
85 thrA ATGCGAGTGTTGAAGTTCGGCGGT
86 metB ATGACGCGTAAACAGGCCACCATC
87 metA ATGCCGATTCGTGTGCCGGACGAG
88 tdh ATGAAAGCGTTATCCAAACTGAAA
89 ilvL ATGACAGCCCTTCTACGAGTGATT
서열번호 Transporters 타겟 유전자 상 결합 염기서열 (5'-3')
90 livJ ATGAACATAAAGGGTAAAGCGTTA
91 rhtC ATGTTGATGTTATTTCTCACCGTC
서열번호 Cell regulation 타겟 유전자 상 결합 염기서열 (5'-3')
92 crp ATGGTGCTTGGCAAACCGCAAACA
93 fadR ATGGTCATTAAGGCGCAAAGCCCG
94 fur ATGACTGATAACAATACCGCCCTA
95 lrp ATGGTAGATAGCAAGAAGCGCCCT
96 pdhR ATGGCCTACAGCAAAATCCGCCAA
97 tyrR ATGCGTCTGGAAGTCTTTTGTGAA
98 csrA ATGCTGATTCTGACTCGTCGAGTT
서열번호 Cell death 타겟 유전자 상 결합 염기서열 (5'-3')
99 lexA ATGAAAGCGTTAACGGCCAGGCAA
100 yohJ ATGAGTAAGACACTGAACATTATC
101 chpA ATGGTAAGCCGATACGTACCCGAT
102 parE ATGACGCAAACTTATAACGCTGAT
실시예 3. 구축한 sRNA 라이브러리를 이용한 유용물질 생산 미생물 공장 생산능 향상
실시예 2에서 제조한 sRNA 라이브러리를 이용하여 기존의 pWAS 기반 sRNA 라이브러리를 이용하여 쉽게 엔지니어링하지 못하였던 생산 균주를 개발하였다. 기존의 sRNA 시스템을 적용하기 어렵다고 함은 배경기술에 개시된 바와 같이 1) 생산 균주가 포함하고 있는 플라스미드의 항생제 저항성 마커 또는 복제 원점이 중복되거나, 2) 여러 개의 낙다운 유전자 타겟을 여러 조합으로 쉽게 적용하고자 할 때를 뜻한다. 본 연구진은 새로운 sRNA 플랫폼을 이용하여 위와 같은 한계들을 해결하였다.
3.1. 다양한 합성조절 sRNA 플랫폼을 이용한 트레오닌 ( L -threonine) 증산
1) 단일 sRNA 플랫폼
기존에 개발되었던 균주들 중 트레오닌 (L-threonine) 생산 균주는 100% rational하게 대사공학적으로 개량된 균주임에도 불구하고 유가식 발효를 통해 82.4 g/L의 매우 높은 트레오닌 생산능을 보이는 균주이다. 100% rational한 방법으로 이미 트레오닌을 매우 고농도로 생산하는 균주에 random-rational한 방법의 합성조절 sRNA를 적용하였을 때의 생산능은 개선될 수 있을 것이라 예상하였다.
기존 트레오닌 생산 연구에서 트레오닌 생산 경로를 강화시키고, 트레오닌 생산 경로상의 효소들이 생산물에 의한 활성 저해를 받지 않도록 피드백 저항성 효소로 개량을 함과 더불어 트레오닌 트랜스포터 과발현등의 전략을 통하여 유가식 발효를 통하여 82.4 g/L의 고농도와 0.393 g/g (트레오닌/포도당)의 높은 수득률로 트레오닌 생산(TH28C - pBRThrABCR3 균주)에 성공한 바 있다 (K.H. Lee et a., Mol. Syst. Biol. (2007), 3(149)).
상기 트레오닌 생산 균주에 실시예 2에서 구축한 CDF-Tc 기반의 sRNA 라이브러리 중 트레오닌 과생산에 적용 가능한 55개의 합성조절 sRNA 라이브러리를 적용하여 플라스크 배양을 진행하였다. 트레오닌 플라스크 배양을 위하여 글리세롤 세포 스탁을 5 mL LB가 포함된 테스트 튜브에 접종하였고, 16시간 배양 후 플라스크로 계대 배양하였다. 플라스크 배양은 30 mL의 50 g/L glucose가 첨가된 TPM1 배지를 포함하고 있는 배플 플라스크에서 31°C, 250 rpm, 48 시간 동안 진행되었으며, TPM1 배지는 1L 당 다음의 성분들을 포함하고 있다: 2 g yeast extract, 4 g KH2PO4, 14 g (NH4)2SO4, 30 g CaCO3, 2 g MgSO4, 1 g betaine, 5 mL trace metal solution, 2 mM L-methionine, 2 mM L-lysine.
플라스크 배양 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 기존에 보고된 생산 균주(TH28C - pBRThrABCR3 균주)에 대하여 플라스크 배양을 수행함으로써 약 16.68 g/L의 트레오닌을 수득한 반면, 55개의 합성조절 sRNA 라이브러리를 적용할 경우, 트레오닌 생산량이 21.68 g/L 까지 증가할 수 있다는 것을 확인하였다.
가장 트레오닌을 증산시킬 수 있었던 낙다운 유전자 타겟은 aroF 이고 pheA 또한 상당한 증산을 이루어냈다는 것을 감안하였을 때, 방향족 생산물로의 대사 흐름을 억제함으로써 트레오닌으로의 대사 흐름을 상당히 증가시킬 수 있었다고 판단된다(도 5). 뿐만 아니라, 트레오닌으로부터 이소루신을 생산하는 대사 경로 상의 ilvH, 아세트산의 축적에 관여하는 pta 등의 발현을 억제하였을 때에도 괄목할 만한 트레오닌 증산을 관찰할 수 있었다.
2) 다중 sRNA 플랫폼
이렇게 단일 유전자 발현 억제를 통하여서도 상당한 증산을 관찰할 수 있었음에도, 본 연구진은 개발된 합성조절 sRNA 플랫폼을 최대한 활용하기 위하여 호환 가능한 두 가지 합성조절 sRNA 플라스미드를 이용하여 동시 이중 낙다운을 통한 트레오닌 증산을 관찰하고자 하였다.
단일 유전자 발현 억제 실험을 통하여 총 55개의 유전자 타겟 중 트레오닌을 20% 이상 증산시키도록 하는 8개의 유전자 타겟을 선별할 수 있었다. 이 8개의 낙다운 타겟은 다음과 같다: tktA, aroF, pta, ilvH, ilvE, glnA, fur, chpA. 본 연구진이 구축한 합성조절 sRNA 플랫폼을 활용하면 언급된 8개의 낙다운 유전자 타겟들을 2개씩 조합하여 동시 이중 낙다운을 손쉽게 테스트할 수 있으며, 이를 통하여 트레오닌을 더욱 높은 수율로 생산해내는 균주를 선별할 수 있을 것으로 예상하였다.
기존의 합성조절 sRNA 플랫폼에서는 동시 다발적 낙다운을 위해서는 단일 벡터에 sRNA를 하나씩 새로이 재조합을 해야 하므로 시간이 오래 걸리며 여러 균주를 한 번에 제작하기 어려운 단점이 있었지만, 본 플랫폼을 활용하면 단순 형질전환을 통하여 유전자 재조합 없이 여러 균주를 한 번에 제작이 가능하다는 장점이 부각된다.
따라서 총 28개의 이중 유전자 낙다운 조합에 해당하는 균주들을 매우 손쉽게 제작하였으며, 이렇게 구축한 균주들에 대한 flask 배양 결과를 도 6에 개시하였다. 흥미롭게도, 동시 이중 유전자 발현 억제 실험을 통해서 총 28개의 균주들 중 3개의 균주에서 기존 모균주 대비 30% 이상 증산된 결과를 관찰할 수 있었다. 특히, glnA-tktA를 동시 낙다운한 균주에서는 약 37%의 증산된 트레오닌을 얻을 수 있었으며, 최대 22.94 g/L의 트레오닌을 수득하였다.
언급된 세 가지 유전자 낙다운 조합은 다음과 같다: ilvE-tktA, glnA-tktA, chpA-pta. 본 연구진은 더 나아가, 30% 이상의 트레오닌 증산을 가능케 한 세 가지의 유전자 낙다운 조합을 이용하여 동시 삼중 유전자 발현 억제 실험을 진행하기로 하였다. 하지만 동시 삼중 낙다운을 통한 트레오닌 생산에서는 기존 균주보다 증산된 균주를 얻을 수 없었다(도 7).
상기 실시예를 통해 서술한 바와 같이, CDF-Tc와 ColA-Sm 플랫폼 상에 미리 구축해둔 합성 조절 sRNA 라이브러리를 활용하여 이미 대사공학적으로 개량된 균주에 대한 다중 낙다운 테스트를 손쉽고 빠르며 효과적으로 진행할 수 있었다. 또한, 이미 rational하게, 산업 균주와 견줄 정도로 높은 농도의 트레오닌을 이미 생산하는 균주에 새로 구축한 sRNA를 적용하여 37% 가량 생산능을 끌어올린 것은 산업계에서도 가히 주목할 만하다고 할 수 있다.
3.2. 다양한 합성조절 sRNA 플랫폼을 이용한 프롤린 ( L -proline) 증산
1) 단일 sRNA 플랫폼
본 발명에서는 합성조절 sRNA 플랫폼을 이용하여 프롤린 증산 균주를 개발하는데 활용하고자 하였다. 최근 가축 사료, 식품 첨가제, 의약 및 화합물 시장 등에서 매우 유용하게 사용되고 있는 프롤린 (L-proline)을 대량으로 생산할 수 있는 대장균 균주(NMH26 - p15PP3533, pKKtrcSargF-trcSglnA 균주)를 합성조절 sRNA를 이용하여 개발된 보고가 있다(KR 10-1750855 B1, M. Noh et al., Cell Systems (2017), 5, 1-9).
이 균주는 2개의 플라스미드를 가지고 있는데 하나는 프롤린의 생산을 위한 pTac15K 기반의 벡터이고, 또 하나는 ColE1 복제원점과 Ap 항생제를 갖는 합성조절 sRNA 플랫폼 벡터이다. 따라서 본 연구진은 위의 균주에 새로 구축된 합성조절 sRNA 플랫폼을 도입하여 이미 합성조절 sRNA를 통하여 증산이 된 균주임에도 불구하고 더욱 생산능을 끌어올리고자 하였다. 기존에 보고된 균주(NMH26 - p15PP3533, pKKtrcSargF-trcSglnA 균주)는 플라스크 상에서 1.95 g/L, 유가식 발효를 통하여 32.7 g/L의 프롤린을 생산하였다(KR 10-1750855 B1, M. Noh et al., Cell Systems (2017), 5, 1-9).
이미 구축한 CDF-Tc 기반의 sRNA 라이브러리 중 프롤린 과생산에 적용 가능한 60개의 sRNA 라이브러리를 적용하여 플라스크 배양을 진행하였다. 플라스크 배양을 위하여 우선적으로 글리세롤 세포 스탁을 5 mL LB가 함유된 테스트 튜브에 접종하였고, 16시간 컬쳐 후, 플라스크에 계대하였다. 플라스크 배양은 10 g/L glucose, 3 g/L (NH4)2SO4가 첨가된 50 mL의 R/2 배지(pH 6.8)를 함유하는 배플 플라스크에서 37°C, 200 rpm에서 24 시간동안 진행하였으며, R/2 배지는 1L당 다음의 성분들을 포함하고 있다: 6.75 g KH2PO4, 2 g (NH4)2HPO4, 0.8 g MgSO4·7H2O, 0.85 g citric acid, and 5 mL trace metal solution.
플라스크 배양 결과, 도 8에 개시된 바와 같이 20% 이상 증산된 균주는 총 7종이었으며, 이 균주들에 해당하는 유전자 낙다운 타겟은 다음과 같다: serC, murE, aspC, metB, fadR, fur, chpA. 특히 fur이 낙다운된 균주는 기존 균주 대비 약 38.4% 정도 증가된 프롤린 생산능을 보여주었는데, 플라스크 상에서 최대 2.72 g/L까지 생산 가능한 것을 확인하였다(도 8).
2) 다중 sRNA 플랫폼
합성조절 sRNA 플랫폼을 활용하여 프롤린을 더욱 증산시키고자, 호환 가능한 두 가지 합성조절 sRNA 플라스미드를 이용하여 동시 이중 낙다운을 통한 프롤린 증산을 관찰하였다. 프롤린이 20% 이상 증산된 결과를 보인 7개의 유전자 타겟들을 2개씩 조합하여 동시 이중 낙다운을 테스트하였고, 이들 균주들에 대한 플라스크 배양 결과는 도 9에 개시되어 있다.
그 결과, fur-metB가 동시 낙다운된 균주가 플라스크 배양시 40.8% (2.90 g/L)의 프롤린 증산을 나타내는 것을 확인하였다(도 9).
종합적으로 보면, 총 21개의 균주들 중 5개의 균주에서 기존 모균주 대비 30% 이상 증산된 결과를 관찰할 수 있었다. 언급된 다섯 가지 유전자 낙다운 조합은 다음과 같다: fur-murE, fur-metB, fur-fadR, chpA-fadR, fur-chpA. 본 연구진은 더 나아가, 30% 이상의 프롤린 증산을 가능케 한 세 가지의 유전자 낙다운 조합을 이용하여 동시 삼중 유전자 발현 억제 실험을 진행하기로 하였다. 하지만 도10에 개시된 바와 같이 동시 삼중 유전자 발현 억제를 통해서 모균주보다 높은 생산능을 보인 균주는 없었다.
3.3. 합성조절 sRNA 플랫폼을 이용하여 증산된 프롤린 (L-proline) 생산 균주의 유가식 발효 공정 개발
1) 단일 sRNA 플랫폼
프롤린 생성능이 크게 향상된 균주들을 대상으로 유가식 발효를 진행하였다. 먼저 발효 공정을 최적화하기 위해 단일 유전자 발현 억제를 통해 가장 높은 증산을 이루어낸 fur 낙다운 균주를 사용하였다. 먼저 기존에 보고된 프롤린 균주 발효 조건을 활용하여 유가식 발효를 진행하였다(KR 10-1750855 B1).
NMH26 p15PP3533 균주(기존 특허 KR 10-1750855 B1에서의 프롤린 생산 균주)에 pCDFTc-fur 플라스미드(fur 낙다운을 위한 sRNA 벡터)가 삽입된 균주를 해당 항생제 (Km, Ap, Tc)가 함유된 5 mL LB가 들어있는 테스트 튜브에 접종한 후 37°C에서 16시간동안 배양하였다. 그 후, 10 g/L glucose, 3 g/L (NH4)2SO4가 첨가된 R/2 배지 (pH 6.8) 50 mL이 들어있는 배플 플라스크 2개에 OD600이 2에 도달할 때까지 계대 배양을 수행하였다. 이렇게 키운 균주 100 mL은 10 g/L glucose, 3 g/L (NH4)2SO4가 첨가된 1.9 L의 R/2 (pH 6.8) 배지가 들어있는 발효기에 접종하였다.
발효 시 28% (v/v) 암모니아 용액을 통하여 pH는 6.8로 고정하였고, DO (dissolved oxygen concentration)는 공기로 인한 포화도의 40%로 설정하였는데, 이 때 교반기의 속도와 발효기로 들어가는 공기 대 산소의 비율로써 DO를 일정하게 조절하였다. 또한, 유가식 발효에서의 feeding 용액은 pH-stat 전략에 따라 들어갔는데, 발효기 시스템 상 pH가 6.83 이상으로 올라갔을 시 일정량의 feeding 용액이 자동으로 유입되도록 설정하였다. 이 때 발효용 feeding 용액은 1 L당 다음의 성분들을 포함하고 있다: 650 g glucose, 85 g (NH4)2SO4, 8 g/L MgSO47H2O. 그 결과, 도11-a에 개시된 바와 같이 발효기에 접종한 균주는 거의 자라지 못하고 성장을 멈추었다. 이번에는 flask와 발효 배지에 각각 1.6 g/L의 yeast extract를 첨가해주었는데, 균주의 성장이 다소 회복이 되긴 했지만 아직은 상대적으로 낮은 수준인 것을 확인하였다(도 11-b). 추가적으로 발효 배지에 3 g/L yeast extract를 추가하였고 fur이 낙다운 될 시 세포 내 금속 이온 관련 대사 회로가 제대로 작동하지 않을 수 있으므로 feeding 용액에 6 mL trace metal solution을 첨가하였다.
그 결과, 도 11-c에 개시된 바와 같이 획기적으로 향상된 세포 생장을 관찰할 수 있었고, 프롤린의 농도 또한 51.6 g/L로 크게 증산되었다. 이는 기존에 보고된 프롤린 생산량 (33.8 g/L) 에 비교하여 52.7% 증산된 결과이다 (Noh et al., Cell Systems, 2017, KR 10-1750855 B1).
이렇게 최적화된 유가식 발효 조건에서 기존의 보고된 균주를 배양하였을 때도 기존에 보고된 농도와 비슷한 프롤린이 생산되는 것을 확인하였다(도11-d).
본 연구진은 최적화된 유가식 발효 조건에서 상기 실시예 3.2를 통하여 제작 프롤린 고생산능 균주들을 배양하고 프롤린 생산량을 측정하였다. 단일 낙다운 균주들 4종에 대하여 유가식 발효를 진행하였는데, 그 결과는 도12-a의 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fur 균주 (51.6 g/L), 도12-b의 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fadR 균주 (33.8 g/L), 도12-c의 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-aspC 균주 (41.4 g/L), 도12-d의 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-mazF 균주 (25.2 g/L) 와 같다.
2) 이중 sRNA 플랫폼
이중 낙다운 균주들에 대한 유가식 발효를 진행하였고, 그 결과는 도13-a의 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fur pColASm-metB 균주 (55.3 g/L), 도13-b의 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fur pColASm-murE 균주 (41.3 g/L), 도13-c의 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-chpA pColASm-fur 균주 (47.1 g/L), 도13-d의 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-chpA pColASm-fadR 균주 (38.6 g/L) 와 같다.
이 때 가장 프롤린 생산능이 좋은 균주는 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fur pColASm-metB 균주 (fur과 metB가 이중으로 낙다운 되어 있는 균주), 55.3 g/L의 높은 생산 농도, 1.053 g/L/h의 높은 생산능, 그리고 0.200 g proline/g glucose의 수율을 나타내었다. 생산 농도 면에서, 이는 기존에 보고된 프롤린 생산량 (33.8 g/L) 에 비교하여 63.6% 증산된 결과이다 (Noh et al., Cell Systems, 2017, KR 10-1750855 B1). 언급한 모든 균주들에 대한 유가식 발효들에 대한 결과를 하기 표 2에 정리하였다.
또한, 상기 프롤린 생산 균주들의 유가식 발효 과정 동안 exponential phase와 stationary phase 상태에 있는 세포들에 sRNA가 안정히 남아있는지 확인하기 위하여 colony PCR을 진행한 결과, 도 14에 개시된 바와 같이 모든 sRNA 벡터들이 안정적으로 유지된 것을 확인하였다.
상기 실시예를 통해 서술한 바와 같이, CDF-Tc와 ColA-Sm 플랫폼 상에 미리 구축해둔 합성 조절 sRNA 라이브러리를 활용하여 이미 대사공학적으로 개량된 균주에 대한 다중 낙다운 테스트를 손쉽고 빠르며 효과적으로 진행할 수 있었으며, 이렇게 구축된 균주는 유가식 발효에서도 매우 뛰어난 성능을 보임으로써 산업 균주로의 개발에 매우 큰 가능성을 보여주었다. 더욱이 기존 대사공학적 전략을 통하여 도입된 두 개의 합성 조절 sRNA와 새로이 도입된 두 개의 합성 조절 sRNA까지 총 네 개의 합성 조절 sRNA를 포함한 균주가 유가식 배양에서 매우 양호한 성장을 보이며 매우 높은 프롤린 생산능을 보여주었다는 점은 당업계에서도 매우 주목할 만 하며, 향후 산업 균주로의 활용성을 보여주는 단적인 예시라 할 수 있다.
sRNA 플랫폼들을 통하여 개량된 프롤린 생산 균주들에 대한 유가식 발효 결과.
No. Strains Titer
(g/L)		 Productivity
(g/L/h)		 Yield
(g/g)
1 NMH26 p15PP3533 (Noh et al., Cell Systems, 2017) 33.8
2 NMH26 p15PP3533 (with optimized condition) 34.3 1.16 0.172
3 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fur 51.6 0.860 0.258
4 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-fadR 33.7 0.748 0.257
5 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-mazF 25.2 0.525 0.294
6 NMH26 p15PP3533 pCDFTc-aspC 41.4 0.796 0.217
7 NMH26 p15PP3534 pCDFTc-fur pColASm-metB 55.3 1.053 0.200
8 NMH26 p15PP3535 pCDFTc-fur pColASm-murE 41.3 0.898 0.187
9 NMH26 p15PP3536 pCDFTc-chpA pColASm-fur 47.1 0.818 0.166
10 NMH26 p15PP3537 pCDFTc-chpA pColASm-fadR 38.6 0.988 0.172
실시예 4. 유전체 수준 sRNA 라이브러리의 플랫폼 이전 기술 및 이를 이용한 고속 스크리닝 기법
합성조절 sRNA를 다양한 환경 및 다양한 생산균주에 적용하기 위해서 유전체 수준의 sRNA 발현 플랫폼을 다른 플랫폼으로 손쉽게 이전할 수 있는 방법을 개발하였다(도15). 본 실시예에서는 ColE1 복제원점과 Ap 항생제 마커를 가지고 있는 플랫폼 플라스미드 (pWAS)로부터 본 발명에서 새로이 만든 ColA-Sm 플랫폼 플라스미드로 합성조절 sRNA 를 이전하는 것으로 예시로 사용하였다. 본 연구진은 기존 연구를 통하여 대장균 유전체 수준 합성 조절 sRNA 라이브러리 (1,858개의 타겟 유전자에 대한)를 구축한 바 있다 (D. Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA (2018), under review).
본 전략은 깁슨 어셈블리를 이용한 것으로 ColA-Sm 플랫폼 플라스미드를 [서열번호36]와 [서열번호37] 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. sRNA 라이브러리의 각 개체끼리 비교하였을 때, 서로 다른 sRNA 벡터들 사이에는 mRNA target binding sequence 24 bp를 제외한 모든 다른 DNA 서열이 동일하므로, pWAS sRNA library를 템플릿으로 하여 [서열번호38] / [서열번호39] 프라이머를 이용하여 1,858개의 서로 다른 mRNA target binding sequence를 포함하고 있는 sRNA 조각들을 PCR 증폭시켰다. 그 후, sRNA 라이브러리 조각들과 ColA-Sm 조각이 gibson assembly를 통하여 원형 벡터로 합친 후, E. coli DH5α 균주에 형질 전환하였다.
이 때 1,858개의 모든 sRNA를 새로운 플랫폼에 수용하기 위하여 약 25,000개 (library 사이즈의 약 13.5배)의 콜로니를 얻을 때까지 반복 수행하였고, 얻어진 모든 콜로니를 섞은 후 maxiprep을 통하여 새로운 ColA-Sm 플랫폼 기반의 sRNA 라이브러리를 얻는데 성공하였다 (도15). 이 때 유전체 수준 합성 조절 sRNA 라이브러리를 새로운 플랫폼으로 이전하는데 걸린 시간은 2일로, 이는 한정된 인력으로 새로이 유전체 수준 합성 조절 sRNA 라이브러리를 구축하게 된다면 걸리는 시간인 수 주 ~ 수 개월과 비교한다면 획기적으로 시간, 인력 및 자원을 절약할 수 있다는 점에서 주목할 만하다.
[서열번호36] 5'-AGTCAACACGCACGGTGTTAG-3'
[서열번호37] 5'-CAATTCGCCCTATACCTCCTG-3'
[서열번호38] 5'-TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTAC-3'
[서열번호39] 5'-CAGGAGGTATAGGGCGAATTG-3'
실시예 5. 플랫폼 이전된 sRNA 라이브러리와 고속 스크리닝을 활용한 인디고 (indigo) 증산
실시예 4에서 구축한 sRNA 라이브러리를 인디고 생산 균주에 도입하여 증가된 생성능을 갖는 인디고 생산 균주를 선별하고자 하였다. 인디고는 Indigofera 계통의 식물에서 생산되는 천연 염료로써 청바지 등의 염색에 주로 사용되는 방향족 아미노산 계통의 화합물이다. 기존에는 자연 추출법을 통해 생산되며, 현재는 화학적 합성법에 의해 거의 모든 수요가 충당된다.
기존에 보고된 인디고 생산 균주(IND5 - pTrc-TF1, pTac-GEL 균주)는 유가식 발효에서는 0.640 g/L의 농도 및 플라스크 수준에서는 0.108 g/L의 농도로 인디고를 생산하였다(J. Du et al., J Biotechnol., 2018, 267, 19-28). 기존에 보고된 인디고 생산 균주(IND5 - pTrc-TF1, pTac-GEL 균주)는 pWAS와 항생제 저항성 마커와 복제 원점이 동일한 벡터를 지니고 있어 바로 적용이 불가능하다. 또한, 콜로니가 푸른색을 띰으로써 손쉽게 생산능의 증감을 눈으로 확인할 수 있다는 장점을 지니고 있었다. 따라서 새로이 구축된 sRNA 라이브러리를 인디고 생산 균주에 도입하여 콜로니 스크리닝을 통하여 인디고 생산능이 향상된 개량 균주를 선별하였다.
먼저 실시예 4에서 구축한 플랫폼의 (ColA-Sm) sRNA 라이브러리를 인디고 생산 균주에 형질전환시켰고, 약 20,000개 이상의 콜로니를 얻을 수 있었다. 이들 중 더욱 진한 색을 띄는 84종의 콜로니를 선별할 수 있었고, 선별된 균주들을 3 mL LB 배지에서 37°C 200rpm에서 16시간동안 pre-cultivation, 그리고 잇따른 3 mL의 10 g/L glucose가 첨가된 MR 배지 small scale cultivation을 통하여 30°C에서 48시간동안 250 RPM에서 배양하였다. 세포들의 OD600이 약 0.6-0.8이 되었을 때 1 mM IPTG로 외래 유전자 발현을 유도시켰다. 이 때, MR 배지는 기존 논문 (J. Du et al., J Biotechnol., 2018, 267, 19-28) 에서 보고된 바와 같은 조성의 MR 배지를 사용하였으며, MR 배지는 1L당 다음의 성분들을 포함하고 있다: 6.67 g of KH2PO4, 4 g of (NH4)2HPO4, 0.8 g of MgSO4·7H2O, 0.8 g of citric acid, 5 mL of trace metal solution.
배양 결과는 도16에 개시된 바와 같으며, 이러한 초기 스크리닝을 통하여 최대 246% 증산된 균주를 선별할 수 있었다 (기존 균주 생산량인 33.3 mg/L 대비 81.9 mg/L까지 증산). 이 때, 가장 높은 인디고 생산능을 지닌 상위 9개의 균주들을 선정하여 10 g/L glucose가 첨가된 50 mL MR 배지에서 30°C, 200 rpm에서 72시간동안 배양을 수행한 다음, 세포들의 OD600이 약 0.6-0.8이 되었을 때 1 mM IPTG로 외래 유전자 발현을 유도시켰다.
그 결과, 도17에 개시된 바와 같이 asnA 낙다운 균주에서 134.84 mg/L까지 인디고 생산량이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 6. 플랫폼 이전된 sRNA 라이브러리와 고속 스크리닝을 활용한 비올라세인 (violacein) 증산
실시예 4에서 제작한 ColA-Sm 플랫폼으로 이전된 대장균 유전체 수준 sRNA 라이브러리를 다른 이차 대사 산물인 비올라세인에 적용하였다. 비올라세인(violacein)과 그 이성질체인 디옥시비올라세인(deoxyviolacein)은 항암 효과 등 많은 의학적 효능을 지니고 있으나, 그 동안 너무 낮은 생산량으로 인하여 연구의 동력이 부족한 실정이었다. 따라서 비올라세인과 디옥시비올라세인의 과량 생산을 통하여 위 문제를 해결하고자 하였다.
6.1. 플랫폼 이전된 sRNA 라이브러리와 고속 스크리닝을 활용한 비올라세인 (violacein) 증산
비올라세인의 생산을 위해서는 vioABCDE의 다섯가지 유전자가 필요한데, 우선적으로 vioABDE를 포함하고 있는 iGEM fragment를 활용하기로 하였다 (Part BBa_K598019; MIT Registry of Standard Biological Parts). 본 플라스미드는 pSB1C3 (chloramphenicol 저항 항생제 마커, pUC 기반 복제원점)를 기반 벡터로 삼고 있다. 따라서 나머지 필요한 vioC 유전자를 pTac15K 벡터에 클로닝하고자 다음과 같은 방법을 사용하였다. 우선 Janthonobacterium lividum의 genomic DNA를 추출 후, 이를 템플릿으로 활용하여 [서열번호 40], [서열번호 41]를 프라이머로 사용하여 vioC DNA 조각을 증폭하였다. 그 후 EcoRI, KpnI site를 통해 vioC 조각을 Gibson assembly를 활용하여 삽입하였다.
[서열번호 40] 5'-caatttcacacaggaaacaga ATGCATAAAATCATTATCGTCG-3'
[서열번호 41] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACC TCATTAATTTACCCTTCCAAG-3'
E. coli BL21 pSB1C3-vioABDE pTac15K-Jli-vioC 균주를 기반 균주로 활용하기로 하였고, 해당 균주에 실시예 4에서 제작한 ColA-Sm 기반 대장균 유전체 수준 sRNA 라이브러리를 형질전환한 후, 20,000개 이상의 콜로니를 얻었다. 이 후 향상된 비올라세인 생산능을 지닌 균주 선별 과정은 실시예 5와 동일하게 수행하였다. 보다 자세히는 이들 중 더욱 진한 보라색을 띄는 32종의 콜로니를 선별할 수 있었고, 선별된 균주들을 3 mL LB 배지에서 37°C 200rpm에서 16시간동안 pre-cultivation, 그리고 잇따른 3 mL의 10 g/L glucose가 첨가된 MR 배지 small scale cultivation을 통하여 30°C에서 48시간동안 250 RPM에서 배양하였다.
배양 결과는 도 18에 개시된 바와 같으며, 이러한 초기 스크리닝을 통하여 비올라세인이 최대 545%, 디옥시비올라세인이 최대 784% 증산된 균주를 선별할 수 있었다. 이 때, 가장 높은 비올라세인/디옥시비올라세인 생산능을 지닌 상위 12개의 균주들을 선정하여 10 g/L glucose가 첨가된 50 mL MR 배지에서 30°C, 200 rpm에서 48시간동안 배양한 다음, 세포들의 OD600이 약 0.6-0.8이 되었을 때 1 mM IPTG로 외래 유전자 발현을 유도하였다.
그 결과, 도 19에 개시된 바와 같이 비올라세인 생산량이 가장 많이 증가한 균주는 ytfR 낙다운 균주였으며 0.656 g/L까지 증산된 비올라세인 생산능을 나타내었다(기반 균주 0.116 g/L 생산). 또한, 가장 높은 디옥시비올라세인 생산능을 보인 균주는 minD 낙다운 균주였으며 52.1 mg/L까지 증산된 디옥시비올라세인 생산능을 나타내었다(기반 균주 21.7 mg/L 생산).
6.2. 합성조절 sRNA 플랫폼을 이용하여 증산된 비올라세인 (violacein) 생산 균주의 유가식 발효 공정 개발
비올라세인 생성능이 크게 향상된 균주들을 대상으로 유가식 발효를 진행하였다. 이 때 실시예 6.1에서 플라스크 배양 결과 비올라세인 생산능이 제일 좋았던 ytfR 낙다운 균주와 디옥시비올라세인 생산능이 제일 좋았던 minD 낙다운 균주에 대하여 각각 유가식 발효를 진행하고자 하였다. E. coli BL21 pSB1C3-vioABDE pTac15K-Jli-vioC 균주에 pColA-ytfR 플라스미드(ytfR 낙다운을 위한 sRNA 벡터)가 삽입된 균주와 E. coli BL21 pSB1C3-vioABDE pTac15K-Jli-vioC 균주에 pColA-minD 플라스미드(minD 낙다운을 위한 sRNA 벡터)가 삽입된 균주를 해당 항생제 (Cm, Km, Spc)가 함유된 5 mL LB가 들어있는 테스트 튜브에 접종한 후 30°C에서 16시간동안 배양하였다. 그 후, 20 g/L glucose, 3 g/L (NH4)2SO4가 첨가된 MR 배지 (pH 7.0) 50 mL이 들어있는 배플 플라스크 2개에 OD600이 4에 도달할 때까지 계대 배양을 수행하였다. 이렇게 키운 균주 100 mL은 20 g/L glucose, 3 g/L (NH4)2SO4가 첨가된 1.9 L의 MR (pH 7.0) 배지가 들어있는 발효기에 접종하였다.
발효 시 28% (v/v) 암모니아 용액을 통하여 pH는 7.0로 고정하였고, DO (dissolved oxygen concentration)는 공기로 인한 포화도의 40%로 설정하였는데, 이 때 교반기의 속도와 발효기로 들어가는 공기 대 산소의 비율로써 DO를 일정하게 조절하였다. 또한, 유가식 발효에서의 feeding 용액은 pH-stat 전략에 따라 들어갔는데, 발효기 시스템 상 pH가 7.05 이상으로 올라갔을 시 일정량의 feeding 용액이 자동으로 유입되도록 설정하였다. 이 때 발효용 feeding 용액은 1 L당 다음의 성분들을 포함하고 있다: 650 g glucose, 85 g (NH4)2SO4, 8 g/L MgSO4?7H2O, 6 mL trace metal solution.
E. coli BL21 pSB1C3-vioABDE pTac15K-Jli-vioC 균주에 pColA-ytfR 플라스미드가 삽입된 균주의 유가식 발효 결과, 도 20-a에 개시된 바와 같이 1.80 g/L의 비올라세인과 0.55 g/L의 디옥시비올라세인이 생산되었다. 또한, E. coli BL21 pSB1C3-vioABDE pTac15K-Jli-vioC 균주에 pColA-minD 플라스미드가 삽입된 균주의 유가식 발효 결과, 도 20-b에 개시된 바와 같이 1.10 g/L의 비올라세인과 0.78 g/L의 디옥시비올라세인이 생산되었다.
또한, 상기 비올라세인 생산 균주들의 유가식 발효 과정 동안 exponential phase와 stationary phase 상태에 있는 세포들에 sRNA가 안정히 남아있는지 확인하기 위하여 colony PCR을 진행한 결과, 도 20-c에 개시된 바와 같이 모든 sRNA 벡터들이 안정적으로 유지된 것을 확인하였다.
상기 실시예에서 서술한 바와 같이, 매우 빠른 시일 내에 유전체 수준 합성 조절 sRNA 라이브러리를 새로운 플랫폼으로 이전할 수 있었으며, 이는 인디고와 비올라세인의 증산에 매우 효과적임이 증명되었다. 더욱이, 비올라세인 생산 균주의 경우, 스크리닝된 합성 조절 sRNA를 포함하고 있는 균주의 유가식 발효를 통하여 본 스크리닝 방법이 매우 효과적이라는 점이 증명되었으며, 기존 대사공학적 균주 개발법을 통하여 수 개월 ~ 수 년동안 실험을 수행하여 얻을 수 있는 비올라세인/디옥시비올라세인 생산 농도를 수 일만에 얻을 수 있었다는 점은 당업계에서는 가히 주목할 만하다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Multiplex Gene Expression Inhibition System based on Synthetic Regulatory Small RNA and Method of Preparing the Same <130> P18-B014 <160> 102 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 739 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atcttttgcc ctgtaaacga 60 aaaaaccacc tggggaggtg gtttgatcga aggttaagtc agttggggaa ctgcttaacc 120 gtggtaactg gctttcgcag agcacagcaa ccaaatctgt ccttccagtg tagccggact 180 ttggcgcaca cttcaagagc aaccgcgtgt ttagctaaac aaatcctctg cgaactccca 240 gttaccaatg gctgctgcca gtggcgtttt accgtgcttt tccgggttgg actcaagtga 300 acagttaccg gataaggcgc agcagtcggg ctgaacgggg agttcttgct tacagcccag 360 cttggagcga acgacctaca ccgagccgag ataccagtgt gtgagctatg agaaagcgcc 420 acacttcccg taagggagaa aggcggaaca ggtatccggt aaacggcagg gtcggaacag 480 gagagcgcaa gagggagcga cccgccggaa acggtgggga tctttaagtc ctgtcgggtt 540 tcgcccgtac tgtcagattc atggttgagc ctcacggctc ccacagatgc accggaaaag 600 cgtctgttta tgtgaactct ggcaggaggg cggagcctat ggaaaaacgc caccggcgcg 660 gccctgctgt tttgcctcac atgttagtcc cctgcttatc cacggaatct gtgggtaact 720 ttgtatgtgt ccgcagcgc 739 <210> 2 <211> 2993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 tatgatcatt tattctgcct cccagagcct gataaaaacg gtgaatccgt tagcgaggtg 60 ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg caacgcgggg 120 aggcagacaa ggtatagggc ggcgaggcgg ctacagccga tagtctggaa cagcgcactt 180 acgggttgct gcgcaaccca agtgctaccg gcgcggcagc gtgacccgtg tcggcggctc 240 caacggctcg ccatcgtcca gaaaacacgg ctcatcgggc atcggcaggc gctgctgccc 300 gcgccgttcc cattcctccg tttcggtcaa ggctggcagg tctggttcca tgcccggaat 360 gccgggctgg ctgggcggct cctcgccggg gccggtcggt agttgctgct cgcccggata 420 cagggtcggg atgcggcgca ggtcgccatg ccccaacagc gattcgtcct ggtcgtcgtg 480 atcaaccacc acggcggcac tgaacaccga caggcgcaac tggtcgcggg gctggcccca 540 cgccacgcgg tcattgacca cgtaggccga cacggtgccg gggccgttga gcttcacgac 600 ggagatccag cgctcggcca ccaagtcctt gactgcgtat tggaccgtcc gcaaagaacg 660 tccgatgagc ttggaaagtg tcttctggct gaccaccacg gcgttctggt ggcccatctg 720 cgccacgagg tgatgcagca gcattgccgc cgtgggtttc ctcgcaataa gcccggccca 780 cgcctcatgc gctttgcgtt ccgtttgcac ccagtgaccg ggcttgttct tggcttgaat 840 gccgatttct ctggactgcg tggccatgct tatctccatg cggtaggggt gccgcacggt 900 tgcggcacca tgcgcaatca gctgcaactt ttcggcagcg cgacaacaat tatgcgttgc 960 gtaaaagtgg cagtcaatta cagattttct ttaacctacg caatgagcta ttgcgggggg 1020 tgccgcaatg agctgttgcg tacccccctt ttttaagttg ttgattttta agtctttcgc 1080 atttcgccct atatctagtt ctttggtgcc caaagaaggg cacccctgcg gggttccccc 1140 acgccttcgg cgcggctccc cctccggcaa aaagtggccc ctccggggct tgttgatcga 1200 ctgcgcggcc ttcggccttg cccaaggtgg cgctgccccc ttggaacccc cgcactcgcc 1260 gccgtgaggc tcggggggca ggcgggcggg cttcgccctt cgactgcccc cactcgcata 1320 ggcttgggtc gttccaggcg cgtcaaggcc aagccgctgc gcggtcgctg cgcgagcctt 1380 gacccgcctt ccacttggtg tccaaccggc aagcgaagcg cgcaggccgc aggccggagg 1440 cttttcccca gagaaaatta aaaaaattga tggggcaagg ccgcaggccg cgcagttgga 1500 gccggtgggt atgtggtcga aggctgggta gccggtgggc aatccctgtg gtcaagctcg 1560 tgggcaggcg cagcctgtcc atcagcttgt ccagcagggt tgtccacggg ccgagcgaag 1620 cgagccagcc ggtggccgct cgcggccatc gtccacatat ccacgggctg gcaagggagc 1680 gcagcgaccg cgcagggcga agcccggaga gcaagcccgt agggcgccgc agccgccgta 1740 ggcggtcacg actttgcgaa gcaaagtcta gtgagtatac tcaagcattg agtggcccgc 1800 cggaggcacc gccttgcgct gcccccgtcg agccggttgg acaccaaaag ggaggggcag 1860 gcatggcggc atacgcgatc atgcgatgca agaagctggc gaaaatgggc aacgtggcgg 1920 ccagtctcaa gcacgcctac cgcgagcgcg agacgcccaa cgctgacgcc agcaggacgc 1980 cagagaacga gcactgggcg gccagcagca ccgatgaagc gatgggccga ctgcgcgagt 2040 tgctgccaga gaagcggcgc aaggacgctg tgttggcggt cgagtacgtc atgacggcca 2100 gcccggaatg gtggaagtcg gccagccaag aacagcaggc ggcgttcttc gagaaggcgc 2160 acaagtggct ggcggacaag tacggggcgg atcgcatcgt gacggccagc atccaccgtg 2220 acgaaaccag cccgcacatg accgcgttcg tggtgccgct gacgcaggac ggcaggctgt 2280 cggccaagga gttcatcggc aacaaagcgc agatgacccg cgaccagacc acgtttgcgg 2340 ccgctgtggc cgatctaggg ctgcaacggg gcatcgaggg cagcaaggca cgtcacacgc 2400 gcattcaggc gttctacgag gccctggagc ggccaccagt gggccacgtc accatcagcc 2460 cgcaagcggt cgagccacgc gcctatgcac cgcagggatt ggccgaaaag ctgggaatct 2520 caaagcgcgt tgagacgccg gaagccgtgg ccgaccggct gacaaaagcg gttcggcagg 2580 ggtatgagcc tgccctacag gccgccgcag gagcgcgtga gatgcgcaag aaggccgatc 2640 aagcccaaga gacggcccga gaccttcggg agcgcctgaa gcccgttctg gacgccctgg 2700 ggccgttgaa tcgggatatg caggccaagg ccgccgcgat catcaaggcc gtgggcgaaa 2760 agctgctgac ggaacagcgg gaagtccagc gccagaaaca ggcccagcgc cagcaggaac 2820 gcgggcgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 2880 gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcgaa taaatacctg 2940 tgacggaaga tcacttcgca gaataaataa atcctggtgt ccctgttgat acc 2993 <210> 3 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 aaacgtccta gaagatgcca ggaggatact tagcagagag acaataaggc cggagcgaag 60 ccgtttttcc ataggctccg cccccctgac gaacatcacg aaatctgacg ctcaaatcag 120 tggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctga tggctccctc 180 ttgcgctctc ctgttcccgt cctgcggcgt ccgtgttgtg gtggaggctt tacccaaatc 240 accacgtccc gttccgtgta gacagttcgc tccaagctgg gctgtgtgca agaacccccc 300 gttcagcccg actgctgcgc cttatccggt aactatcatc ttgagtccaa cccggaaaga 360 cacgacaaaa cgccactggc agcagccatt ggtaactgag aattagtgga tttagatatc 420 gagagtcttg aagtggtggc ctaacagagg ctacactgaa aggacagtat ttggtatctg 480 cgctccacta aagccagtta ccaggttaag cagttcccca actgacttaa ccttcgatca 540 aaccgcctcc ccaggcggtt ttttcgttta cagagcagga gattacgacg atcgtaaaag 600 gatctcaaga agatccttta cggattcccg acacca 636 <210> 4 <211> 804 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 atgtcatcag cggtggagtg caatgtcgtg caatacgaat ggcgaaaagc cgagctcatc 60 ggtcagcttc tcaaccttgg ggttaccccc ggcggtgtgc tgctggtcca cagctccttc 120 cgtagcgtcc ggcccctcga agatgggcca cttggactga tcgaggccct gcgtgctgcg 180 ctgggtccgg gagggacgct cgtcatgccc tcgtggtcag gtctggacga cgagccgttc 240 gatcctgcca cgtcgcccgt tacaccggac cttggagttg tctctgactc attctggcgc 300 ctgccaaatg taaagcgcag cgcccatcca tttgcctttg cggcagcggg gccacaggca 360 gagcagatca tctctgatcc attgcccctg ccacctcact cgcctgcaag cccggtcgcc 420 cgtgtccatg aactcgatgg gcaggtactt ctcctcggcg tgggacacga tgccaacacg 480 acgctgcatc ttgccgagtt gttggcaaag gttccctatg gggtgccgag acactgcacc 540 attcttcagg atggcaagtt ggtacgcgtc gattatctcg agaatgacca ctgctgtgag 600 cgctttgcct tggcggacag gtggctcaag gagaagagcc ttcagaagga aggtccagtc 660 ggtcatgcct ttgctcggtt gatccgctcc cgcgacattg tggcgacagc cctgggtcaa 720 ctgggccgag atccgttgat cttcctgcat ccgccagagg cgggatgcga agaatgcgat 780 gccgctcgcc agtcgattgg ctga 804 <210> 5 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc 60 gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc gtacatttgt acggctccgc agtggatggc 120 ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa 180 acaacgcggc gagctttgat caacgacctt ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc 240 gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt 300 tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt 360 atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa 420 catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg gaggaactct ttgatccggt tcctgaacag 480 gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta acgctatgga actcgccgcc cgactgggct 540 ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg tcccgcattt ggtacagcgc agtaaccggc 600 aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat 660 cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc 720 tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc cactacgtga aaggcgagat caccaaggta 780 gtcggcaaat aa 792 <210> 6 <211> 1917 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 atgaaaatta ttaatattgg agttttagct catgttgatg caggaaaaac taccttaaca 60 gaaagcttat tatataacag tggagcgatt acagaattag gaagcgtgga caaaggtaca 120 acgaggacgg ataatacgct tttagaacgt cagagaggaa ttacaattca gacaggaata 180 acctcttttc agtgggaaaa tacgaaggtg aacatcatag acacgccagg acatatggat 240 ttcttagcag aagtatatcg ttcattatca gttttagatg gggcaattct actgatttct 300 acaaaagatg gcgtacaagc acaaactcgt atattatttc atgcacttag gaaaatgggg 360 attcccacaa tcttttttat caataagatt gaccaaaatg gaattgattt atcaacggtt 420 tatcaggata ttaaagagaa actttctgcc gaaattgtaa tcaaacagaa ggtagaactg 480 tatcctaatg tgtgtgtgac gaactttacc gaatctgaac aatgggatac ggtaatagag 540 ggaaacgatg accttttaga gaaatatatg tccggtaaat cattagaagc attggaactc 600 gaacaagagg aaagcataag atttcagaat tgttctctgt tccctcttta tcatggaagt 660 gcaaaaagta atatagggat tgataacctt atagaagtta ttactaataa attttattca 720 tcaacacatc gaggtccgtc tgaactttgc ggaaatgttt tcaaaattga atatacaaaa 780 aaaagacaac gtcttgcata tatacgcctt tatagtggag tactacattt acgagattcg 840 gttagagtat cagaaaaaga aaaaataaaa gttacagaaa tgtatacttc aataaatggt 900 gaattatgta agattgatag agcttattct ggagaaattg ttattttgca aaatgagttt 960 ttgaagttaa atagtgttct tggagataca aaactattgc cacagagaaa aaagattgaa 1020 aatccgcacc ctctactaca aacaactgtt gaaccgagta aacctgaaca gagagaaatg 1080 ttgcttgatg cccttttgga aatctcagat agtgatccgc ttctacgata ttacgtggat 1140 tctacgacac atgaaattat actttctttc ttagggaaag tacaaatgga agtgattagt 1200 gcactgttgc aagaaaagta tcatgtggag atagaactaa aagagcctac agtcatttat 1260 atggagagac cgttaaaaaa tgcagaatat accattcaca tcgaagtgcc gccaaatcct 1320 ttctgggctt ccattggttt atctgtatca ccgcttccgt tgggaagtgg aatgcagtat 1380 gagagctcgg tttctcttgg atacttaaat caatcatttc aaaatgcagt tatggaaggg 1440 atacgctatg gttgtgaaca aggattgtat ggttggaatg tgacggactg taaaatctgt 1500 tttaagtatg gcttatacta tagccctgtt agtaccccag cagattttcg gatgcttgct 1560 cctattgtat tggaacaagt cttaaaaaaa gctggaacag aattgttaga gccatatctt 1620 agttttaaaa tttatgcgcc acaggaatat ctttcacgag catacaacga tgctcctaaa 1680 tattgtgcga acatcgtaga cactcaattg aaaaataatg aggtcattct tagtggagaa 1740 atccctgctc ggtgtattca agaatatcgt agtgatttaa ctttctttac aaatggacgt 1800 agtgtttgtt taacagagtt aaaagggtac catgttacta ccggtgaacc tgtttgccag 1860 ccccgtcgtc caaatagtcg gatagataaa gtacgatata tgttcaataa aataact 1917 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 7 taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgc 49 <210> 8 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 tttctgttgg gccattgcat tgccactgat tttccaacat ataaaaagac aagcccgaac 60 agtcgtccgg gcttttttt 79 <210> 9 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 9 ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60 gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120 gcgtttata 129 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 10 ggtaaaccca ggaggtatag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 11 gtgccaccta aattgtaagc 20 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 12 gcttacaatt taggtggcac acggtaactg atgccgtatt tg 42 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 13 cattgtaacc tatgattatc gaagaactcc agcatgagat cc 42 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 14 gcttacaatt taggtggcac gaccgagtga gctagctatt tg 42 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 15 cattgtaacc tatgattatc ctgagcaata actagcataa c 41 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 16 gcttacaatt taggtggcac gacagtggag tatatcgacc ag 42 <210> 17 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 17 cattgtaacc tatgattatc gctcacatgt agtttataat aac 43 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 18 ctatacctcc tgggtttacc aagttagctc actcattagg c 41 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 19 gataatcata ggttacaatg tttatcaggg ttattgtctc 40 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 20 ctatacctcc tgggtttacc ggtatcaaca gggacaccag g 41 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 21 gataatcata ggttacaatg tatgatcatt tattctgcct cc 42 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 22 ctatacctcc tgggtttacc tatcagggtt attgtctcat g 41 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 23 gataatcata ggttacaatg cgcaacgcaa ttaatgtaag 40 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 24 ggatgagaga agattttcag 20 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 25 tttttttttt tgtgtgaaat tgttatccgc 30 <210> 26 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 26 attaacttta ttaattaaag gaggacaaat atatggcgag cagtgagaac gtc 53 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 27 ctgaaaatct tctctcatcc attacgccac cagggcatag ttttc 45 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 28 gagaacgtca tcgcaaccat tatcaccgcc ag 32 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 29 actgctcgcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 30 caaccatgaa tctgacagta c 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 31 ctctgcgaac tcccagttac 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 32 cgttgcgtaa aagtggcagt c 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 33 gcttcttgca tcgcatgatc 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 34 tccgtaaagg atcttcttga g 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 35 gtcctagaag atgccaggag 20 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 36 agtcaacacg cacggtgtta g 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 37 caattcgccc tatacctcct g 21 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 38 taacaccgtg cgtgttgact attttac 27 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 39 caggaggtat agggcgaatt g 21 <210> 40 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 40 caatttcaca caggaaacag aatgcataaa atcattatcg tcg 43 <210> 41 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 41 ctctagagga tccccgggta cctcattaat ttacccttcc aag 43 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 42 atggcggtaa cgcaaacagc ccag 24 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 43 atgtcctcac gtaaagagct tgcc 24 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 44 atgaaaaaca tcaatccaac gcag 24 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 45 atgattaaga aaatcggtgt gttg 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 46 atgaaaacgt taggtgaatt tatt 24 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 47 atggctcaaa tcttcaattt tagt 24 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 48 atgcaaaaag acgcgctgaa taac 24 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 49 atggaatccc tgacgttaca accc 24 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 50 atggctggaa acacaattgg acaa 24 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 51 atgacatcgg aaaacccgtt actg 24 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 52 atggctgaca ttctgctgct cgat 24 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 53 atgttcacgg gaagtattgt cgcg 24 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 54 gtggcagatc gtaatttgcg cgac 24 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 55 atgccacatt cactgttcag cacc 24 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 56 atgtccaaca atggctcgtc accg 24 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 57 atgtcagaac gtttcccaaa tgac 24 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 58 gtgtcccgta ttattatgct gatc 24 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 59 atgtcgagta agttagtact ggtt 24 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 60 atgcgcgtta acaatggttt gacc 24 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 61 atgaacgaac aatattccgc attg 24 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 62 atggctgata caaaagcaaa actc 24 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 63 atgtcaaaca aaccctttca ttat 24 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 64 atgaaagtcg cagtcctcgg cgct 24 <210> 65 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 65 atgagtctga atttccttga tttt 24 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 66 ttgaagaagg tttggcttaa ccgt 24 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 67 atgtatacga agattattgg tact 24 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 68 atgtttgaga acattaccgc cgct 24 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 69 atgtcaaaca acattcgtat cgaa 24 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 70 atgccaaaac gtacagatat aaaa 24 <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 71 atgcgccgga tattatcagt ctta 24 <210> 72 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 72 atgaatggcg cacagtgggt gg 22 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 73 atgatgcaac atcaggtcaa tgta 24 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 74 atgcaaaaca caactcatga caac 24 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 75 atggctgact cgcaacccct gtcc 24 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 76 atggctaact acttcaatac actg 24 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 77 atgaccacga agaaagctga ttac 24 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 78 atgaaaaccg cttacattgc caaa 24 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 79 atgtgttcaa tttttggcgt attc 24 <210> 80 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 80 atggcacttt ggggcgggcg tttt 24 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 81 ttgtttctcg cacaagaaat tatt 24 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 82 atgtccgctg aacacgtact gacg 24 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 83 atggatcaga catattctct ggag 24 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 84 gtggtaaagg aacgtaaaac cgag 24 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 85 atgcgagtgt tgaagttcgg cggt 24 <210> 86 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 86 atgacgcgta aacaggccac catc 24 <210> 87 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 87 atgccgattc gtgtgccgga cgag 24 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 88 atgaaagcgt tatccaaact gaaa 24 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 89 atgacagccc ttctacgagt gatt 24 <210> 90 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 90 atgaacataa agggtaaagc gtta 24 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 91 atgttgatgt tatttctcac cgtc 24 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 92 atggtgcttg gcaaaccgca aaca 24 <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 93 atggtcatta aggcgcaaag cccg 24 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 94 atgactgata acaataccgc ccta 24 <210> 95 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 95 atggtagata gcaagaagcg ccct 24 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 96 atggcctaca gcaaaatccg ccaa 24 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 97 atgcgtctgg aagtcttttg tgaa 24 <210> 98 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 98 atgctgattc tgactcgtcg agtt 24 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 99 atgaaagcgt taacggccag gcaa 24 <210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 100 atgagtaaga cactgaacat tatc 24 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 101 atggtaagcc gatacgtacc cgat 24 <210> 102 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 102 atgacgcaaa cttataacgc tgat 24

Claims (41)

  1. 제1항생제 내성 유전자; 제1복제원점; 제1 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제1벡터; 및 제2항생제 내성 유전자; 제2복제원점; 제2 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화영역을 포함하는 제2벡터;를 포함하는 원핵생물의 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물로,
    상기 제1항생제 내성 유전자와 제2항생제 내성 유전자, 제1복제원점과 제2복제원점 및 제1표적 유전자와 제2표적 유전자는 서로 각각 상이하며,
    상기 항생제는 앰피실린(ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 클로로암페니콜(chloramphenicol), 아프라마이신(apramycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 스펙티도마이신(spectinomycin), 테트라사이클린(tetracyclin), 에리트로마이신(erythromycin), 네오마이신(neomycin), 페니실린(penicillin), 액시노마이신(actinomycin), 가베니실린(garbenicillin), 겐타미신(gentamicin), 블라스티시딘(blasticidin), 마이코페놀릭산(mycophenolic acid), 퓨로마이신(puromycin), 제오신(zeocin), 보렐리딘(borrelidin), 이오노마이신(ionomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 이버멕틴(ivermectin), 에버멕틴(avermectin), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 나리딕식산(nalidixic acid), 노보비오신(novobiocin), 니스타틴(nystatin), 옥시테트라라시클린(oxytetracycline), 팩리택셀(paclitaxel), 폴리마이신(polymyxin), 리팜피신(rifampicin), 살리노마이신(salinomycin), 타일로신(tylosin), 발리노마이신(valinomycin), 밴코마이신(vancomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 및 빈크리스틴(vincristine) 으로 구성된 군에서 선택되고,
    상기복제원점은 CloDF13(CDF), pBBR1, ColA, ColE1, pUC, pBR322, SC101, RSF1030(RSF), 및 RK2로 구성된 군에서 선택되며,
    상기합성 sRNA 암호화 영역은 프로모터; MicC, SgrS 및 MicF 중 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합 부위(Hfq binding site); 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역; 및 터미네이터를 포함하는 것을 특징으로 하는
    동시다중 표적 유전자 발현 억제 시스템이 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
  2. 다음의 단계를 포함하는 유용물질 생산균주의 개량방법:
    (a) 20~50bp 크기를 가지는 임의의 염기서열을 제조하는 단계;
    (b) 상기 염기서열을 제1항생제 내성 유전자; 제1복제원점; 제1 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제1벡터의 표적유전자 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 삽입하여 제1 sRNA 라이브러리를 포함하는 제1벡터 라이브러리를 제조하는 단계;
    (c) 상기 제1벡터 라이브러리를 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 도입하여, 유용물질 생산량이 향상되는 경우, 발현이 억제된 유전자 후보군을 동정하여, 2 내지 500개의 발현억제 대상 유전자로 결정하는 단계;
    (d) 상기 결정된 2 내지 500개의 발현억제 대상 유전자를 제2항생제 내성 유전자; 제2복제원점; 상기 2 내지 500개의 발현억제 대상 유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화영역을 포함하는 제2 벡터에 각각 삽입하는 단계; 및
    (e) 상기 발현억제 대상 유전자를 포함하는 2개의 벡터가 도입된 재조합 균주를 제조하는 단계,
    여기서,
    상기 제1항생제 내성 유전자와 제2항생제 내성 유전자, 제1복제원점과 제2복제원점 및 제1표적유전자와 2 내지 500개의 발현억제 대상 유전자는 서로 각각 상이한 것을 특징으로 함.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 원핵생물은 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 tac, trc, T7, BAD, λPR 및 앤더슨 합성 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 Hfq 결합부위는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 터미네이터는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 표적유전자는 DsRed2, LuxR, AraC, KanR (kanamycin resistance gene), tyrR(tyrosine regulator), ppc (phosphoenolpyruvate carboxylase), csrA (carbon storage regulator), pgi (glucose-6-phosphate isomerase), glt (citrate synthase), accA (acetyl-CoA carboxyltransferase, alpha-subunit), accB (biotinylated biotin-carboxyl carrier protein), accC (acetyl-CoA carboxylase), accD (acetyl-CoA carboxyltransferase, beta-subunit), aceE (subunit of E1p component of pyruvate dehydrogenase complex), aceF (pyruvate dehydrogenase), ackA (propionate kinase / acetate kinase activity), adiY (AdiY is a positive DNA-binding transcriptional regulator that controls the arginine) decarboxylase (adi) system), argB (acetylglutamate kinase), argC (N-acetylglutamylphosphate reductase), argG (argininosuccinate synthase), argH (argininosuccinate lyase), asnC (transcriptional regulator that activates the expression of asnA, a gene involved in the synthesis of asparagine), aspA (aspartate ammonia-lyase), crp (CRP transcriptional dual regulator), csiD (predicted protein. CsiD is the product of a gene induced by carbon starvation), csiR (DNA-binding transcriptional repressor), cytR (transcription factor required for transport and utilization of ribonucleosides and deoxyribonucleosides), dcuA (The DcuA transporter is one of three transporters known to be responsible for the uptake of C4-dicarboxylates such as fumarate under anaerobic conditions), deoB (phosphopentomutase), deoC (deoxyribose-phosphate aldolase), deoR (The transcriptional repressor DeoR, for "Deoxyribose Regulator," is involved in the negative expression of genes related to transport and catabolism of deoxyribonucleoside nucleotides), fabH (KASIII, -ketoacyl-ACP synthases), fadD (fatty acyl-CoA synthetase), fadR (FadR Fatty acid degradation Regulon, is a multifunctional dual regulator that exerts negative control over the fatty acid degradative regulon [Simons80, Simons80a] and acetate metabolism), fbp (fructose-1,6-bisphosphatase), fnr (FNR is the primary transcriptional regulator that mediates the transition from aerobic to anaerobic growth), fruR (FruR is a dual transcriptional regulator that plays a pleiotropic role to modulate the direction of carbon flow through the different metabolic pathways of energy metabolism, but independently of the CRP regulator) , ftsL (essential cell division protein FtsL), ftsQ (essential cell division protein FtsQ), ftsW (essential cell division protein FtsW), ftsZ (essential cell division protein FtsZ), fur (Fur-Fe+2 DNA-binding transcriptional dual regulator), gabD (succinate semialdehyde dehydrogenase, NADP+-dependent), gabP (APC transporter), gabT (4-aminobutyrate aminotransferase), gadA (glutamate decarboxylase A subunit), gadB (glutamate decarboxylase B subunit), gadC (GABA APC transporter), glcC (GntR family transcriptional regulator, glc operon transcriptional activator), glpK (glycerol kinase), glpR (sn-Glycerol-3-phosphate repressor), glpX (fructose 1,6-bisphosphatase II), gltA (citrate synthase), hflD (lysogenization regulator), ihfA (IHF, Integration host factor, is a global regulatory protein), ihfB (IHF, Integration host factor, is a global regulatory protein), ilvB (acetohydroxybutanoate synthase/acetolactate synthase), ilvC (acetohydroxy acid isomeroreductase), ilvD (dihydroxy acid dehydratase), ilvG_1 (acetolactate synthase II, large subunit, N-ter fragment (pseudogene)), ilvG_2 (acetolactate synthase II, large subunit, C-ter fragment (pseudogene)), ilvH (acetolactate synthase/acetohydroxybutanoate synthase), ilvL (ilvGEDA operon leader peptide), ilvM (acetohydroxybutanoate synthase/acetolactate synthase), ilvN (acetohydroxybutanoate synthase / acetolactate synthase), ilvX (Predicted small protein), lexA (LexA represses the transcription of several genes involved in the cellular response to DNA damage), lpxC (UDP-3-O-acyl-N-acetylglucosamine deacetylase), marA (MarA participates in controlling several genes involved in resistance to antibiotics, oxidative stress, organic solvents and heavy metals.), metJ (MetJ transcriptional repressor), modE (ModE is the principal regulator that controls the transcription of operons involved in the transport of molybdenum and synthesis of molybdoenzymes and molybdate-related functions), nadB (L-aspartate oxidase), narL(nitrate/nitrite response regulator), pck (phosphoenolpyruvate carboxykinase), PdhR (PdhR, "pyruvate dehydrogenase complex regulator," regulates genes involved in the pyruvate dehydrogenase complex), phoP (PhoP-Phosphorylated DNA-binding transcriptional dual regulator. Member of the two-component regulatory system phoQ/phoP involved in adaptation to low Mg2+ environments and the control of acid resistance genes), pnuC (PnuC NMN transporter), ppsA (phosphoenolpyruvate synthetase), pta (Phosphate acetyltransferase), purA (adenylosuccinate synthetase), purB (adenylosuccinate lyase), purR (PurR Hypoxanthine DNA-binding transcriptional repressor. PurR dimer controls several genes involved in purine nucleotide biosynthesis and its own synthesis), puuE (4-aminobutyrate aminotransferase), rbsA (ribose ABC transporter), rbsB (ribose ABC transporter), rbsD (ribose pyranase), rbsK (ribokinase), rbsR (The transcription factor RbsR, for "Ribose Repressor," is negatively autoregulated and controls the transcription of the operon involved in ribose catabolism and transport), rcsB (RcsB-BglJ DNAbinding transcriptional activator. RcsB protein for "Regulator capsule synthesis B," is a response regulator that belongs to the multicomponent RcsF/RcsC/RcsD/RcsA-RcsB phosphorelay system and is involved in the regulation of the synthesis of colanic acid capsule, cell division, periplasmic proteins, motility, and a small RNA) , rutR (RutR regulates genes directly or indirectly involved in the complex pathway of pyrimidine metabolism), serA (alpha-ketoglutarate reductase / D-3-phosphoglycerate dehydrogenase), serC (phosphohydroxythreonine aminotransferase / 3-phosphoserine aminotransferase), soxS (dual transcriptional activator and participates in the removal of superoxide and nitric oxide), sroD (SroD small RNA), zwf (glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase), asnA (asparagine synthetase A), asnB (asparagine synthetase B), carA (carbamoyl phosphate synthetase), carB (carbamoyl phosphate synthetase), ddlB (D-alanine-D-alanine ligase B), deoA (thymidine phosphorylase / uracil phosphorylase), deoD (purine nucleoside phosphorylase deoD-type), dpiA (dual transcriptional regulator involved in anaerobic citrate catabolism), fis (Fis, "factor for inversion stimulation", is a small DNA-binding and bending protein whose main role appears to be the organization and maintenance of nucleoid structure), gadE (GadE controls the transcription of genes involved in glutamate dependent system), gadW (GadW controls the transcription of genes involved in glutamate dependent system), gadX (GadX controls the transcription of genes involved in glutamate dependent system), glpF (GlpF glycerol MIP channel), ilvY (IlvY DNA-binding transcriptional dual regulator), ivbL (The ilvB operon leader peptide (IvbL)), lhgO (L-2-hydroxyglutarate oxidase), lpd (Lipoamide dehydrogenase), lrp (Lrp is a dual transcriptional regulator for at least 10% of the genes in Escherichia coli. These genes are involved in amino acid biosynthesis and catabolism, nutrient) transport, pili synthesis, and other cellular functions, including 1-carbon metabolism), metB (O-succinylhomoserine lyase / Osuccinylhomoserine(thiol)-lyase), metL (aspartate kinase / homoserine dehydrogenase), mraY (phospho-Nacetylmuramoyl-pentapeptide transferase), mraZ (Unknown function), murE (UDP-N-acetylmuramoylalanyl-Dglutamate 2,6-diaminopimelate ligase), murF (D-alanyl-D-alanine-adding enzyme), murG (Nacetylglucosaminyl transferase), nac (Nacregulates, without a coeffector, genes involved in nitrogen metabolism under nitrogen-limiting conditions), nadA (quinolinate synthase), nsrR (NsrR, the "nitritesensitive repressor" regulates genes involved in cell protection against nitric oxide (NO) ), panC (pantothenate synthetase), panD (Aspartate 1-decarboxylase), pgl (6-phosphogluconolactonase), pyrB (aspartate carbamoyltransferase, PyrB subunit), pyrC (dihydroorotase), pyrL (aspartate carbamoyltransferase, PyrI subunit), rob (Rob is a transcriptional dual regulator. Its N-terminal domain shares 49% identity with MarA and SoxS. These proteins activate a common set of about 50 target genes, the marA/soxS/rob regulon, involved in antibiotic resistance, superoxide resistance, and tolerance to organic solvents and heavy metals.) , rpe (ribulose phosphate 3-epimerase), talA (transaldolase A), thrA (aspartate kinase / homoserine dehydrogenase), thrB (homoserine kinase), thrC (threonine synthase), thrL (thr operon leader peptide), tktA (transketolase I), tktB (transketolase II), torR (two-component system, OmpR family, torCAD operon response regulator TorR), aroF (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase, tyrosine-repressible), aroA (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase), aroC (Chorismate synthase), pheA (chorismate mutase and prephenate dehydratase, P-protein), trpD (fused glutamine amidotransferase (component II) of anthranilate synthase/anthranilate phosphoribosyl transferase), dapA (4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase), ilvE (Branched-chain-amino-acid aminotransferase), lysA (Diaminopimelate decarboxylase), gltA (cistrate synthase), fumA (Fumarate hydratase class I, aerobic), glnA (glutamine synthetase), mdh (malate dehydrogenase), gdhA (NADP-specific glutamate dehydrogenase), argA (amino acid N-acetyltransferase and inactive acetylglutamate kinase), metA (Homoserine O-succinyltransferase), tdh (L-threonine dehydrogenase), livJ (branched-chain amino acid ABC transporter periplasmic binding protein), rhtC (Threonine efflux protein), yohJ (UPF0299 membrane protein), chpA (antitoxin of the ChpA-ChpR toxin-antitoxin system), aspC (aspartate aminotransferase), pfkA (ATP-dependent 6-phosphofructokinase isozyme 1), parE (DNA topoisomerase 4 subunit B), ytfR (predicted sugar transporter subunit), ilvA (L-threonine dehydratase, biosynthetic; also known as threonine deaminase), ilvG(Acetolactate synthase), minD (inhibitor of FtsZ ring polymerization; chromosome-membrane tethering protein; membrane ATPase of the MinCDEE system), hisJ(histidine transport system substrate-binding protein), yneH(Glutaminase), napG(Ferredoxin-type protein NapG), kdsA(2-dehydro-3-deoxyphosphooctonate aldolase), ygfA(5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase), ftsI(cell division protein FtsI (penicillin-binding protein 3)), ostB(trehalose 6-phosphate phosphatase), hybG(hydrogenase expression/formation protein HypC), ampG(MFS transporter, PAT family, beta-lactamase induction signal transducer AmpG), potG(spermidine/putrescine transport system permease protein), caiF(transcriptional activator CaiF), yfbR(5'-deoxynucleotidase YfbR), rfe(UDP-GlcNAc:undecaprenyl-phosphate/decaprenyl-phosphate GlcNAc-1-phosphate transferase), atpH(F-type H+-transporting ATPase subunit delta), tiaE(glyoxylate/hydroxypyruvate/2-ketogluconate reductase) 및 murI(Glutamate racemase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 표적유전자는 zwf (glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase), tktA (transketolase I), tktB (transketolase II), pgi (glucose-6-phosphate isomerase, fbp (fructose-1,6-bisphosphatase), serC (phosphohydroxythreonine aminotransferase / 3-phosphoserine aminotransferase), murE (UDP-N-acetylmuramoylalanyl-Dglutamate 2,6-diaminopimelate ligase), pps (phosphoenolpyruvate synthetase), aceE (subunit of E1p component of pyruvate dehydrogenase complex), pta (Phosphate acetyltransferase), purA (adenylosuccinate synthetase), ackA (propionate kinase / acetate kinase activity), pck (phosphoenolpyruvate carboxykinase), ppc (phosphoenolpyruvate carboxylase), accA (acetyl-CoA carboxyltransferase, alpha-subunit), fadD (fatty acyl-CoA synthetase), fabH (KASIII, -ketoacyl-ACP synthases), aspA (aspartate ammonia-lyase), carB (carbamoyl phosphate synthetase), ilvH (acetolactate synthase/acetohydroxybutanoate synthase), ilvM (acetohydroxybutanoate synthase/acetolactate synthase), ilvN (acetohydroxybutanoate synthase / acetolactate synthase), ilvC (acetohydroxy acid isomeroreductase), asnA (asparagine synthetase A), asnB (asparagine synthetase B), argH (argininosuccinate lyase), deoA (thymidine phosphorylase / uracil phosphorylase), thrA (aspartate kinase / homoserine dehydrogenase), metB (O-succinylhomoserine lyase / Osuccinylhomoserine(thiol)-lyase), metA, tdh, ilvL (ilvGEDA operon leader peptide), crp (CRP transcriptional dual regulator), fadR (FadR Fatty acid degradation Regulon, is a multifunctional dual regulator that exerts negative control over the fatty acid degradative regulon [Simons80, Simons80a] and acetate metabolism), fur (Fur-Fe+2 DNA-binding transcriptional dual regulator), lrp (Lrp is a dual transcriptional regulator for at least 10% of the genes in Escherichia coli. These genes are involved in amino acid biosynthesis and catabolism, nutrient) transport, pili synthesis, and other cellular functions, including 1-carbon metabolism), gltA (citrate synthase), pdhR (PdhR, "pyruvate dehydrogenase complex regulator," regulates genes involved in the pyruvate dehydrogenase complex), tyrR(tyrosine regulator), csrA (carbon storage regulator), lexA (LexA represses the transcription of several genes involved in the cellular response to DNA damage), aroF (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase, tyrosine-repressible), aroA (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase), aroC (Chorismate synthase), pheA (chorismate mutase and prephenate dehydratase, P-protein), trpD (fused glutamine amidotransferase (component II) of anthranilate synthase/anthranilate phosphoribosyl transferase), dapA (4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase), ilvE (Branched-chain-amino-acid aminotransferase), lysA (Diaminopimelate decarboxylase), gltA (cistrate synthase), fumA (Fumarate hydratase class I, aerobic), glnA (glutamine synthetase), mdh (malate dehydrogenase), gdhA (NADP-specific glutamate dehydrogenase), argA (amino acid N-acetyltransferase and inactive acetylglutamate kinase), metA (Homoserine O-succinyltransferase), tdh (L-threonine dehydrogenase), livJ (branched-chain amino acid ABC transporter periplasmic binding protein), rhtC (Threonine efflux protein), yohJ (UPF0299 membrane protein), chpA (antitoxin of the ChpA-ChpR toxin-antitoxin system), aspC (aspartate aminotransferase), pfkA (ATP-dependent 6-phosphofructokinase isozyme 1), parE (DNA topoisomerase 4 subunit B), ytfR (predicted sugar transporter subunit), ilvA (L-threonine dehydratase, biosynthetic; also known as threonine deaminase), ilvG(Acetolactate synthase), minD (inhibitor of FtsZ ring polymerization; chromosome-membrane tethering protein; membrane ATPase of the MinCDEE system), hisJ(histidine transport system substrate-binding protein), yneH(Glutaminase), napG(Ferredoxin-type protein NapG), kdsA(2-dehydro-3-deoxyphosphooctonate aldolase), ygfA(5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase), ftsI(cell division protein FtsI (penicillin-binding protein 3)), ostB(trehalose 6-phosphate phosphatase), hybG(hydrogenase expression/formation protein HypC), ampG(MFS transporter, PAT family, beta-lactamase induction signal transducer AmpG), potG(spermidine/putrescine transport system permease protein), caiF(transcriptional activator CaiF), yfbR(5'-deoxynucleotidase YfbR), rfe(UDP-GlcNAc:undecaprenyl-phosphate/decaprenyl-phosphate GlcNAc-1-phosphate transferase), atpH(F-type H+-transporting ATPase subunit delta), tiaE(glyoxylate/hydroxypyruvate/2-ketogluconate reductase) 및 murI(Glutamate racemase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
  13. 삭제
  14. 제1항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 제1 및 제2 표적유전자의 mRNA 발현을 억제하는 단계를 포함하는 표적유전자의 동시다중 발현억제 방법.
  15. 삭제
  16. 트레오닌 생합성 경로를 가지는 숙주세포에,
    제1항생제 내성 유전자; 제1복제원점; 제1 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제1벡터; 및 제2항생제 내성 유전자; 제2복제원점; 제2 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화영역을 포함하는 제2벡터;를 포함하는 원핵생물의 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 도입되어 있는 재조합 미생물로,
    상기 제1항생제 내성 유전자와 제2항생제 내성 유전자, 제1복제원점과 제2복제원점 및 제1표적유전자와 제2표적유전자는 서로 각각 상이하며,
    상기항생제는앰피실린(ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 클로로암페니콜(chloramphenicol), 아프라마이신(apramycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 스펙티도마이신(spectinomycin), 테트라사이클린(tetracyclin), 에리트로마이신(erythromycin), 네오마이신(neomycin), 페니실린(penicillin), 액시노마이신(actinomycin), 가베니실린(garbenicillin), 겐타미신(gentamicin), 블라스티시딘(blasticidin), 마이코페놀릭산(mycophenolic acid), 퓨로마이신(puromycin), 제오신(zeocin), 보렐리딘(borrelidin), 이오노마이신(ionomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 이버멕틴(ivermectin), 에버멕틴(avermectin), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 나리딕식산(nalidixic acid), 노보비오신(novobiocin), 니스타틴(nystatin), 옥시테트라라시클린(oxytetracycline), 팩리택셀(paclitaxel), 폴리마이신(polymyxin), 리팜피신(rifampicin), 살리노마이신(salinomycin), 타일로신(tylosin), 발리노마이신(valinomycin), 밴코마이신(vancomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 및 빈크리스틴(vincristine) 으로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 복제원점은 CloDF13(CDF), pBBR1, ColA, ColE1, pUC, pBR322, SC101, RSF1030(RSF), 및 RK2로 구성된 군에서 선택되며,
    상기 합성 sRNA 암호화 영역은 프로모터; MicC, SgrS 및 MicF 중 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합 부위(Hfq binding site); 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역; 및 터미네이터를 포함하고,
    상기 제1 내지 제2벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 tktA, aroF, pta, ilvH, ilvE, glnA, fur 또는 chpA 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, tktA, aroF, pta, ilvH, ilvE, glnA fur 및 chpA로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있어 트레오닌 생산능력이 향상된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  17. 제16항에 있어서, lacI(Lactose-inducible lac operon transcriptional repressor), metA(Homoserine O-succinyltransferase/O-acetyltransferase), lysA(Diaminopimelate decarboxylase), tdh(L-threonine dehydrogenase), iclR(AceBAK operon repressor) 및 tdcC(Threonine/serine transporter)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 결실된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  18. 제17항에 있어서, thrA(Bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 1)의 1034번째 염기 서열이 C에서 T로 바뀐 돌연변이, lysC(lysine-sensitive aspartokinase 3)의 1055번째 염기 서열이 C에서 T로 바뀐 돌연변이, ilvA(l-threonine dehydratase, biosynthetic; also known as threonine deaminase)의 290번째 염기 서열이 C에서 T로 바뀐 돌연변이로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 조작된 것을 특징으로 하고, thrABC 오페론, ppc(phosphoenolpyruvate carboxylase), acs(acetyl-CoA synthetase)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 프로모터가 trc 프로모터로 치환된 것을 특징으로 하며, rhtA(threonine and homoserine efflux system), rhtB(homoserine, homoserine lactone and S-methyl-methionine efflux pump), rhtC(threonine efflux pump), thrAC1034T, thrB(homoserine kinase), thrC(L-threonine synthase)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 플라스미드 기반 과발현된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  19. 제16항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  20. 프롤린(proline) 생합성 경로를 가지는 숙주세포에,
    제1항생제 내성 유전자; 제1복제원점; 제1 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제1벡터; 및 제2항생제 내성 유전자; 제2복제원점; 제2 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화영역을 포함하는 제2벡터;를 포함하는 원핵생물의 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 도입되어 있는 재조합 미생물로,
    상기 제1항생제 내성 유전자와 제2항생제 내성 유전자, 제1복제원점과 제2복제원점 및 제1 표적유전자와 제2 표적유전자는 서로 각각 상이하며,
    상기 항생제는 앰피실린(ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 클로로암페니콜(chloramphenicol), 아프라마이신(apramycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 스펙티도마이신(spectinomycin), 테트라사이클린(tetracyclin), 에리트로마이신(erythromycin), 네오마이신(neomycin), 페니실린(penicillin), 액시노마이신(actinomycin), 가베니실린(garbenicillin), 겐타미신(gentamicin), 블라스티시딘(blasticidin), 마이코페놀릭산(mycophenolic acid), 퓨로마이신(puromycin), 제오신(zeocin), 보렐리딘(borrelidin), 이오노마이신(ionomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 이버멕틴(ivermectin), 에버멕틴(avermectin), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 나리딕식산(nalidixic acid), 노보비오신(novobiocin), 니스타틴(nystatin), 옥시테트라라시클린(oxytetracycline), 팩리택셀(paclitaxel), 폴리마이신(polymyxin), 리팜피신(rifampicin), 살리노마이신(salinomycin), 타일로신(tylosin), 발리노마이신(valinomycin), 밴코마이신(vancomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 및 빈크리스틴(vincristine) 으로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 복제원점은 CloDF13(CDF), pBBR1, ColA, ColE1, pUC, pBR322, SC101, RSF1030(RSF), 및 RK2로 구성된 군에서 선택되며,
    상기 합성 sRNA 암호화 영역은 프로모터; MicC, SgrS 및 MicF 중 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합 부위(Hfq binding site); 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역; 및 터미네이터를 포함하고,
    상기 제1 내지 제2 벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 serC, murE, aspC, metB, fadR, fur 또는 chpA 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, serC, murE, aspC, metB, fadR, fur 및 chpA 로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있어 프롤린 생산능력이 향상된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.

  21. 제20항에 있어서, lacI, speE, speG, argI, puuP, puuA, putA, putP, proP, speC, potE, 및 speF로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 결실된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  22. 제20항에 있어서, PP3533 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  23. 제20항에 있어서, argF 및 glnA 유전자의 발현이 추가로 억제되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  24. 제20항에 있어서, argECBH 오페론, speF-potE, 및 argD로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 프로모터가 trc 프로모터로 치환된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  25. 제20항의 재조합 미생물을 트레이스 메탈 용액(trace metal solution)을 포함하는 배지에서 유가식 발효를 통해 배양하는 단계를 포함하는 프롤린 생산 방법.
  26. 제20항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  27. 인디고(indigo) 생합성 경로를 가지는 숙주세포에,
    제1항생제 내성 유전자; 제1복제원점; 제1 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제1벡터; 및 제2항생제 내성 유전자; 제2복제원점; 제2 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화영역을 포함하는 제2벡터;를 포함하는 원핵생물의 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템이 도입되어 있는 재조합 미생물로,
    상기 제1항생제 내성 유전자와 제2항생제 내성 유전자, 제1복제원점과 제2복제원점 및 제2 표적유전자와 제2 표적유전자는 서로 각각 상이하며,
    상기 항생제는 앰피실린(ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 클로로암페니콜(chloramphenicol), 아프라마이신(apramycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 스펙티도마이신(spectinomycin), 테트라사이클린(tetracyclin), 에리트로마이신(erythromycin), 네오마이신(neomycin), 페니실린(penicillin), 액시노마이신(actinomycin), 가베니실린(garbenicillin), 겐타미신(gentamicin), 블라스티시딘(blasticidin), 마이코페놀릭산(mycophenolic acid), 퓨로마이신(puromycin), 제오신(zeocin), 보렐리딘(borrelidin), 이오노마이신(ionomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 이버멕틴(ivermectin), 에버멕틴(avermectin), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 나리딕식산(nalidixic acid), 노보비오신(novobiocin), 니스타틴(nystatin), 옥시테트라라시클린(oxytetracycline), 팩리택셀(paclitaxel), 폴리마이신(polymyxin), 리팜피신(rifampicin), 살리노마이신(salinomycin), 타일로신(tylosin), 발리노마이신(valinomycin), 밴코마이신(vancomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 및 빈크리스틴(vincristine) 으로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 복제원점은 CloDF13(CDF), pBBR1, ColA, ColE1, pUC, pBR322, SC101, RSF1030(RSF), 및 RK2로 구성된 군에서 선택되며,
    상기 합성 sRNA 암호화 영역은 프로모터; MicC, SgrS 및 MicF 중 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합 부위(Hfq binding site); 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역; 및 터미네이터를 포함하고,
    상기 제1 내지 제2벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 asnA, hisJ, yneH, napG, kdsA, ygfA, ftsl, aceF 또는 ostB 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, asnA, hisJ, yneH, napG, kdsA, ygfA, ftsl, aceF 및 ostB 로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있어 인디고 생산능력이 향상된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  28. 제27항에 있어서, trpR, pykF 및 pykA로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 결실되고, tktA의 프로모터가 trc 프로모터로 치환되어 있으며, tnaA, fmo, aroGfbr, trpEfbr, 및 aroL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  29. 제27항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  30. 제1항생제 내성 유전자; 제1복제원점; 제1 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제1벡터; 및 제2항생제 내성 유전자; 제2복제원점; 제2 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화영역을 포함하는 제2벡터;를 포함하는 원핵생물의 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템으로,
    상기 제1항생제 내성 유전자와 제2항생제 내성 유전자, 제1복제원점과 제2복제원점 및 제1표적유전자와 제2표적유전자는 서로 각각 상이하며,
    상기 항생제는 앰피실린(ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 클로로암페니콜(chloramphenicol), 아프라마이신(apramycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 스펙티도마이신(spectinomycin), 테트라사이클린(tetracyclin), 에리트로마이신(erythromycin), 네오마이신(neomycin), 페니실린(penicillin), 액시노마이신(actinomycin), 가베니실린(garbenicillin), 겐타미신(gentamicin), 블라스티시딘(blasticidin), 마이코페놀릭산(mycophenolic acid), 퓨로마이신(puromycin), 제오신(zeocin), 보렐리딘(borrelidin), 이오노마이신(ionomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 이버멕틴(ivermectin), 에버멕틴(avermectin), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 나리딕식산(nalidixic acid), 노보비오신(novobiocin), 니스타틴(nystatin), 옥시테트라라시클린(oxytetracycline), 팩리택셀(paclitaxel), 폴리마이신(polymyxin), 리팜피신(rifampicin), 살리노마이신(salinomycin), 타일로신(tylosin), 발리노마이신(valinomycin), 밴코마이신(vancomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 및 빈크리스틴(vincristine) 으로 구성된 군에서 선택되고,
    상기복제원점은 CloDF13(CDF), pBBR1, ColA, ColE1, pUC, pBR322, SC101, RSF1030(RSF), 및 RK2로 구성된 군에서 선택되며,
    상기 합성 sRNA 암호화 영역은 프로모터; MicC, SgrS 및 MicF 중 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합 부위(Hfq binding site); 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역; 및 터미네이터를 포함하는 것을 특징으로 하는
    동시다중 표적 유전자 발현억제 시스템이 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물에서,
    상기 숙주세포는 비올라세인(violacein) 생합성 경로를 가지고,
    상기 제1 내지 제2벡터의 표적유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 ytfR, hybG, ampG, potG, caiF, minD, ilvM, yfbR, rfe, atpH, tiaE 또는 murI 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 서열을 삽입하여 제조된 벡터가 도입되어 있어, ytfR, hybG, ampG, potG, caiF, minD, ilvM, yfbR, rfe, atpH, tiaE 및 murI로 구성된 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현이 억제되어 있는 것을 특징으로 하는 비올라세인/디옥시비올라세인 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
  31. 제30항에 있어서, vioA, vioB, vioC, vioD 및 vioE로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  33. 제30항의 재조합 미생물을 트레이스 메탈 용액(trace metal solution)을 포함하는 배지에서 유가식 발효를 통해 배양하는 단계를 포함하는 비올라세인/디옥시비올라세인 생산 방법.
  34. 다음의 단계를 포함하는 다중억제 유전자 조합의 스크리닝 방법:
    (a) 20 ~ 50bp 크기를 가지는 임의의 염기서열을 제조하는 단계;
    (b) 상기 염기서열을 제1항생제 내성 유전자; 제1복제원점; 제1 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제1벡터; 내지 제2항생제 내성 유전자; 제2복제원점; 제2 표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화영역을 포함하는 제2벡터;의 표적유전자 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 삽입하여 제1 내지 제2 sRNA 라이브러리를 포함하는 제1 내지 제2 벡터 라이브러리를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 제1 내지 제2 벡터 라이브러리를 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 도입하여, 유용물질 생산량이 향상되는 경우, 발현이 억제된 유전자 후보군을 동정하여, 2개의 발현억제 대상 유전자 조합을 결정하는 단계;
    여기서, 상기 제1항생제 내성 유전자와 제2항생제 내성 유전자, 제1복제원점과 제2복제원점 및 제1 표적유전자와 제2 표적유전자는 서로 각각 상이한 것을 특징으로 함.
  35. 제1항에 있어서, 제1항생제 내성유전자 및 제2항생제 내성유전자와 상이한 제3항생제 내성 유전자; 제1복제원점 및 제2복제원점과 상이한 제3복제원점; 제1표적유전자 및 제2표적유전자와 상이한 제3표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제3벡터가 숙주세포에 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  36. 제2항에 있어서,
    (f) 상기 결정된 2 내지 500개의 발현억제 대상 유전자를 제1항생제 내성유전자 및 제2항생제 내성유전자와 상이한 제3항생제 내성 유전자; 제1복제원점 및 제2복제원점과 상이한 제3복제원점; 제1표적유전자 및 제2표적유전자와 상이한 제3표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제3벡터에 각각 삽입하는 단계; 및
    (g) 상기 제3벡터가 추가로 도입된 재조합 균주를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유용물질 생산균주의 개량방법.
  37. 제16항에 있어서, 제1항생제 내성유전자 및 제2항생제 내성유전자와 상이한 제3항생제 내성 유전자; 제1복제원점 및 제2복제원점과 상이한 제3복제원점; 제1표적유전자 및 제2표적유전자와 상이한 제3표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제3벡터가 숙주세포에 추가로 도입되어 있는 재조합 미생물로,
    상기 표적 유전자는 tktA, aroF, pta, ilvH, ilvE, glnA fur 및 chpA로 구성된 군에서 선택되는 트레오닌 생산능력이 향상된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  38. 제20항에 있어서, 제1항생제 내성유전자 및 제2항생제 내성유전자와 상이한 제3항생제 내성 유전자; 제1복제원점 및 제2복제원점과 상이한 제3복제원점; 제1표적유전자 및 제2표적유전자와 상이한 제3표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제3벡터가 숙주세포에 추가로 도입되어 있는 재조합 미생물로,
    상기 표적 유전자는 serC, murE, aspC, metB, fadR, fur 및 chpA로 구성된 군에서 선택되는 프롤린생산능력이 향상된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  39. 제27항에 있어서, 제1항생제 내성유전자 및 제2항생제 내성유전자와 상이한 제3항생제 내성 유전자; 제1복제원점 및 제2복제원점과 상이한 제3복제원점; 제1표적유전자 및 제2표적유전자와 상이한 제3표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제3벡터가 숙주세포에 추가로 도입되어 있는 재조합 미생물로,
    상기 표적 유전자는 asnA, hisJ, yneH, napG, kdsA, ygfA, ftsl, aceF 및 ostB로 구성된 군에서 선택되는 인디고 생산능력이 향상된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  40. 제30항에 있어서, 제1항생제 내성유전자 및 제2항생제 내성유전자와 상이한 제3항생제 내성 유전자; 제1복제원점 및 제2복제원점과 상이한 제3복제원점; 제1표적유전자 및 제2표적유전자와 상이한 제3표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제3벡터가 숙주세포에 추가로 도입되어 있는 재조합 미생물로,
    상기 표적 유전자는 , ytfR, hybG, ampG, potG, caiF, minD, ilvM, yfbR, rfe, atpH, tiaE 및 murI로 구성된 군에서 선택되는 비올라세인 생산능력이 향상된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  41. 제34항에 있어서, 상기 (b) 단계는
    상기 염기서열을 제1항생제 내성유전자 및 제2항생제 내성유전자와 상이한 제3항생제 내성 유전자; 제1복제원점 및 제2복제원점과 상이한 제3복제원점; 제1표적유전자 및 제2표적유전자와 상이한 제3표적유전자 발현을 억제하는 합성 sRNA 암호화 영역을 포함하는 제3벡터;의 표적유전자 mRNA와 상보적으로 결합하는 영역에 삽입하여 제3 sRNA 라이브러리를 포함하는 제3 벡터 라이브러리를 제조하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 (c) 단계는
    상기 제3 벡터 라이브러리를 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 추가로 도입하여, 유용물질 생산량이 향상되는 경우, 발현이 억제된 유전자 후보군을 동정하여, 3개의 발현억제 대상 유전자 조합을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다중억제 유전자 조합의 스크리닝 방법.
KR1020180073970A 2018-06-27 2018-06-27 합성조절 sRNA 기반 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법 KR102037958B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180073970A KR102037958B1 (ko) 2018-06-27 2018-06-27 합성조절 sRNA 기반 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법
PCT/KR2019/007729 WO2020004936A1 (ko) 2018-06-27 2019-06-26 합성조절 srna 기반 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180073970A KR102037958B1 (ko) 2018-06-27 2018-06-27 합성조절 sRNA 기반 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102037958B1 true KR102037958B1 (ko) 2019-11-26

Family

ID=68731316

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180073970A KR102037958B1 (ko) 2018-06-27 2018-06-27 합성조절 sRNA 기반 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102037958B1 (ko)
WO (1) WO2020004936A1 (ko)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111505292A (zh) * 2020-04-03 2020-08-07 青岛大学附属医院 基于pck1调节的脂质代谢作为癌症治疗、诊断和预后预测之靶标的应用
CN111549012A (zh) * 2020-06-08 2020-08-18 石家庄创组生物科技有限公司 核糖激酶突变体及其应用
CN112143751A (zh) * 2020-09-22 2020-12-29 廊坊梅花生物技术开发有限公司 高产核苷的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用
KR20210144444A (ko) * 2020-05-22 2021-11-30 인천대학교 산학협력단 박테리아 인공 염색체 재조합 스크리닝 방법
CN117568301A (zh) * 2023-11-16 2024-02-20 安徽农业大学 一种通过糖多孢红霉菌sace_1646基因提高红霉素产量的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110306213B (zh) * 2019-07-08 2020-08-04 广州三孚新材料科技股份有限公司 一种太阳能电池用镀锡液及其制备方法
CN111471638B (zh) * 2020-05-22 2021-11-23 江南大学 一株产l-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用
KR20220059399A (ko) * 2020-11-02 2022-05-10 한국과학기술원 소수성 물질의 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이의 제조를 위한 세포막 엔지니어링 방법
CN114517197B (zh) * 2022-02-16 2023-08-29 河南科技大学 大肠杆菌sRNA120、DNA分子、重组载体及在调控细菌耐药能力方面的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101575587B1 (ko) * 2012-01-11 2015-12-09 한국과학기술원 신규한 합성 조절 ｓＲＮＡ 및 그 제법
KR101690780B1 (ko) * 2014-06-11 2016-12-29 한국과학기술원 합성 조절 sRNA를 이용한 클로스트리듐 속 미생물 유전자의 발현 조절 방법
KR101750855B1 (ko) * 2014-06-11 2017-06-27 한국과학기술원 합성 조절 sRNA를 이용한 유전자 발현 미세조절 방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103293732B (zh) * 2013-05-31 2015-11-25 京东方科技集团股份有限公司 液晶面板驱动方法以及液晶面板

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101575587B1 (ko) * 2012-01-11 2015-12-09 한국과학기술원 신규한 합성 조절 ｓＲＮＡ 및 그 제법
KR101690780B1 (ko) * 2014-06-11 2016-12-29 한국과학기술원 합성 조절 sRNA를 이용한 클로스트리듐 속 미생물 유전자의 발현 조절 방법
KR101750855B1 (ko) * 2014-06-11 2017-06-27 한국과학기술원 합성 조절 sRNA를 이용한 유전자 발현 미세조절 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biotechnology and Bioengineering,114권,2호,374-383면(2017.02.) 1부.* *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111505292A (zh) * 2020-04-03 2020-08-07 青岛大学附属医院 基于pck1调节的脂质代谢作为癌症治疗、诊断和预后预测之靶标的应用
KR20210144444A (ko) * 2020-05-22 2021-11-30 인천대학교 산학협력단 박테리아 인공 염색체 재조합 스크리닝 방법
KR102384173B1 (ko) 2020-05-22 2022-04-06 인천대학교 산학협력단 박테리아 인공 염색체 재조합 스크리닝 방법
CN111549012A (zh) * 2020-06-08 2020-08-18 石家庄创组生物科技有限公司 核糖激酶突变体及其应用
CN111549012B (zh) * 2020-06-08 2022-05-13 石家庄创组生物科技有限公司 核糖激酶突变体及其应用
CN112143751A (zh) * 2020-09-22 2020-12-29 廊坊梅花生物技术开发有限公司 高产核苷的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用
CN117568301A (zh) * 2023-11-16 2024-02-20 安徽农业大学 一种通过糖多孢红霉菌sace_1646基因提高红霉素产量的方法
CN117568301B (zh) * 2023-11-16 2024-05-10 安徽农业大学 一种通过糖多孢红霉菌sace_1646基因提高红霉素产量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020004936A1 (ko) 2020-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102037958B1 (ko) 합성조절 sRNA 기반 동시다중 표적유전자 발현억제 시스템 및 그 제법
CN104254606B (zh) 新型合成-调控sRNA及其制备方法
Becker et al. Metabolically engineered Corynebacterium glutamicum for bio-based production of chemicals, fuels, materials, and healthcare products
Zhang et al. Ribosome binding site libraries and pathway modules for shikimic acid synthesis with Corynebacterium glutamicum
Pérez-García et al. Fermentative production of L‐pipecolic acid from glucose and alternative carbon sources
Rodriguez et al. Constitutive expression of selected genes from the pentose phosphate and aromatic pathways increases the shikimic acid yield in high-glucose batch cultures of an Escherichia coli strain lacking PTS and pykF
ES2592887T3 (es) Procedimiento la producción de cadaverina
Du et al. Engineering Halomonas bluephagenesis for L-Threonine production
EP0827542B1 (en) Application of glucose transport mutants for production of aromatic pathway compounds
Shen et al. Improved production of tryptophan in genetically engineered Escherichia coli with TktA and PpsA overexpression
CN107267575A (zh) 微生物发酵生产n‑乙酰‑d‑氨基葡萄糖和/或d‑氨基葡萄糖盐的方法
Wang et al. Metabolic engineering of l-leucine production in Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum: a review
CN101688196A (zh) 用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法
US10196644B2 (en) Method for fine-tuning gene expression levels using synthetic regulatory SRNA
CN113278655B (zh) 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
Gao et al. Mutations in genes encoding antibiotic substances increase the synthesis of poly‐γ‐glutamic acid in Bacillus amyloliquefaciens LL3
Wang et al. A novel riboregulator switch system of gene expression for enhanced microbial production of succinic acid
CN102154339A (zh) 一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法
Tang et al. The overexpression of phasin and regulator genes promoting the synthesis of polyhydroxybutyrate in Cupriavidus necator H16 under nonstress conditions
KR101750855B1 (ko) 합성 조절 sRNA를 이용한 유전자 발현 미세조절 방법
Zhang et al. Strengthening the (R)-pantoate pathway to produce D-pantothenic acid based on systematic metabolic analysis
Liu et al. Site-specific integration and constitutive expression of key genes into Escherichia coli chromosome increases shikimic acid yields
Sun et al. Engineering Escherichia coli for L‐homoserine production
Vemuri et al. Physiological response of central metabolism in Escherichia coli to deletion of pyruvate oxidase and introduction of heterologous pyruvate carboxylase
CN106635945A (zh) 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
GRNT Written decision to grant