KR20220059399A - 소수성 물질의 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이의 제조를 위한 세포막 엔지니어링 방법 - Google Patents

소수성 물질의 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이의 제조를 위한 세포막 엔지니어링 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소수성 물질의 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이의 제조를 위한 세포막 엔지니어링 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 세포막 면적 증가; 세포 외막 소포체(outer membrane vesicle) 형성 및 분비 증가; 및 세포 내막 소포체(inner membrane vesicle) 형성 증가 중 어느 하나 이상의 특징을 갖도록 세포막 엔지니어링된 소수성 물질 생산용 재조합 미생물 및 이의 제조를 위한 세포막 엔지니어링 방법에 관한 것이다.
본 발명은 소수성 불용성 물질을 고효율로 생산하는데 유용하다. 본 발명에 따른 제조방법을 통해 개발된 카로티노이드 또는 비올라세인 유사체 고효율 생산용 재조합 미생물은 천연 색소, 항산화물질, 항생제, 화장품 첨가물, 항암제, 식품 첨가제 또는 영양 보조제의 생산용 미생물로 유용하다. 또한, 본 발명에서 개발한 천연 색소 생산 기술은 획기적인 생산능 증가를 확인하였다. 따라서, 본 발명은 산업적, 의학적으로 유용한 다양한 대사 산물의 효율적 생산을 위한 재조합 균주의 제작 및 효율적 제조방법 확립에 사용할 수 있어 유용하다.

Description

소수성 물질의 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이의 제조를 위한 세포막 엔지니어링 방법 {Recombinant microorganism with improved production capacity of hydrophobic compounds and membrane engineering method for the production thereof}
본 발명은 소수성 물질의 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이의 제조를 위한 세포막 엔지니어링 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 세포막 면적 증가; 세포 외막 소포체(outer membrane vesicle) 형성 및 분비 증가; 및 세포 내막 소포체(inner membrane vesicle) 형성 증가 중 어느 하나 이상의 특징을 갖도록 세포막이 엔지니어링된 소수성 물질 생산용 재조합 미생물 및 이의 제조를 위한 세포막 엔지니어링 방법에 관한 것이다.
전 세계적인 환경문제, 한정된 자원고갈, 친환경 에너지원에 대한 수요로 인해 재생산 가능한 생물체 기반의 세포 공장 구축에 대한 관심이 증가하고 있다. 이런 세포 공장은 세포 내의 대사회로 (metabolic network)를 목적대사산물 (바이오 에너지, 친환경 화학물질, 신약 제재 등) 생산에 최적화하여 제조할 수 있는데, 이 기술 과정에 다양한 분자생물학 기술이 요구되고 있다. 석유 화학 기반으로 생산되는 다양한 물질들은 여러가지 카테고리로 구분될 수 있는데, 대표적인 구분 기준 중 하나가 친수성 및 소수성으로 구분하는 것이다. 소수성 물질 중 대표적인 물질 군으로는 소수성 색소(카로티노이드 및 비올라세인 등)가 있다. 색소는 식품 첨가제, 염료, 화장품, 페인트 등을 포함하는 산업에서 광범위하게 사용되며 우리 삶에 깊숙이 관여되어 있다. 섭취하거나 피부에 바르는 형태의 색소는 신체에 직접적인 영향을 미치므로 현대 사회에서 건강에 대한 관심이 높아짐에 따라 문제의 소지가 있는 석유 기반의 합성 색소보다 안전하다고 여겨지는 천연 색소에 대한 관심과 수요가 급증하고 있다. 석유 기반으로 합성되는 색소는 섬유 염색 시에 심각한 환경 문제를 초래한다고도 알려져 있다. 자연에서 유래하는 천연 색소는 색깔뿐만 아니라 항암, 항생, 항박테리아, 면역억제 등의 다양한 약학적 특성을 가지고 있는 경우가 많으므로 일상생활에서 더욱 더 유용하게 사용될 수 있다. 현재 많은 색소는 석유 화학을 기반으로 생산되고 있으며, 천연 색소의 사용 비중은 낮다. 이는 건강 문제 및 환경 문제 등으로 이어지고 있으며, 특히 어린이를 위한 제품에 석유화학 기반 색소가 널리 활용되고 있다는 점에서 문제가 되고 있다. 석유 화학 기반의 색소는 섬유 염색 과정에서도 심각한 수질 오염을 야기하고 있다.
따라서 이러한 천연 색소를 환경 친화적인 방법으로 미생물 세포공장을 통하여 다량 생산하려는 노력이 있어왔으며, 대표적으로 세포막의 면적을 넓혀 세포막 상에 축적되는 소수성 색소의 생산량을 증가시키려는 시도가 보고되었고 (T. Wu et al., Membrane engineering - A novel strategy to enhance the production and accumulation of beta-carotene in Escherichia coli. Metab Eng 43, 85-91 (2017).), 소수성 색소를 세포 내의 지질에 녹여서 생산량을 증가시키려는 시도가 있었다 (T. Ma et al., Lipid engineering combined with systematic metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for high-yield production of lycopene. Metab Eng 52, 134-142 (2019).).
이러한 배경기술 아래에서, 본 발명자들은 소수성 물질의 생산용 미생물이 갖는 고유의 특성을 세포막 엔지니어링을 통해 변형 시킴으로써, 소수성 물질의 생산능을 향상시키고자 예의 노력한 결과, 천연 색소인 카로티노이드와 비올라세인 유사체를 생산하는 대장균에서의 세포 형태 관련 유전자, 세포 외막 소포체 관련 유전자, 또는 세포 내막 소포체 관련 유전자의 억제, 도입 또는 과발현을 통해 세포막을 엔지니어링하는 경우, 세포막 면적의 증가, 세포 외막 소포체의 형성 및 분비 증가, 및 내막 소포체의 형성 증가로, 친유성 천연 색소 물질이 축적될 수 있는 공간이 확장되고, 결과적으로 생산량이 현저하게 증가하는 것을 확인하였으며, 각 요소들의 시너지 효과를 테스트 및 검증하여 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 세포막이 엔지니어링되어 소수성 물질의 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하여 소수성 물질을 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포막이 엔지니어링된 재조합 미생물 라이브러리를 사용하여 특정 소수성 물질의 생산능이 우수한 재조합 미생물의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포막 면적 증가; 세포 외막 소포체 형성 및 분비 증가; 및 세포 내막 소포체 형성 증가 중 어느 하나 이상의 특징을 갖도록 세포막이 엔지니어링된 소수성 물질 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 소수성 물질 생산용 재조합 미생물에서 세포 형태 관련 유전자, 및 세포 외막 소포체 관련 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 발현을 억제시키거나, 및/또는 세포 내막 소포체 관련 유전자를 소수성 물질 생산용 재조합 미생물에 도입 또는 과발현시키는 단계를 포함하는 소수성 물질 생산용 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포막이 엔지니어링된 소수성 물질 생산용 재조합 미생물을 배양하여 소수성 물질을 생산하는 단계; 및 생산된 소수성 물질을 수득하는 단계를 포함하는 소수성 물질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 소수성 물질 생산용 미생물에 세포 형태 관련 유전자의 발현 억제; 세포 외막 소포체 관련 유전자의 발현 억제; 및 세포 내막 소포체 관련 유전자의 도입 또는 과발현 중 어느 하나 이상의 수단을 통해 세포막 엔지니어링을 수행하여 소수성 물질 생산용 미생물의 라이브러리를 생성하는 단계; 및
(b) 상기 소수성 물질 생산용 미생물을 배양하여 특정 소수성 물질의 생산능이 우수한 재조합 미생물을 선별하는 단계를 포함하는 특정 소수성 물질의 생산능이 증가된 세포막 엔지니어링된 재조합 미생물의 스크리닝방법을 제공한다.
본 발명의 세포막 엔지니어링 방법은 크게 세 요소로 구성되는데, 첫 번째로 세포 분열 관련 유전자의 발현억제를 통하여 세포의 형태를 변형시키는 것이고, 두 번째로 세포 내막 소포체를 발현시키는 유전자를 도입 또는 과발현하여 세포 내막 구조를 확장시키는 것이며, 세 번째로 세포 외막 소포체를 발현시키기 위하여 세포막 대사와 관련된 표적 유전자의 발현억제를 통하여 세포 외막 소포체를 과생산하는 것이다.
이러한 세 가지 방법은 단독으로 사용하는 경우 또는 조합하는 경우 시너지 효과를 내어 소수성 불용성 물질을 고효율로 생산하는데 유용하다. 본 발명에 따른 소수성 물질 생산능이 우수한 재조합 미생물의 스크리닝 방법을 통해 개발된 카로티노이드 또는 비올라세인 유사체 고효율 생산용 재조합 미생물은 천연 색소 제작 미생물로 유용하다. 또한, 본 발명에서 개발한 천연 색소 생산 기술은 획기적인 생산능 증가를 이룩하였다. 따라서, 본 발명은 산업적, 의학적으로 유용한 다양한 대사 산물의 효율적 생산을 위한 재조합 균주의 제작 및 효율적 제조방법 확립에 사용할 수 있어 유용하다.
도 1은 세포막 공간 확장을 위한 세포막 엔지니어링 전략과 카로티노이드 및 비올라세인 유사체 생합성 경로의 개요도를 나타낸다. 세포 형태는 합성 sRNA 시스템을 이용한 관련 유전자 발현 억제를 통하여 변형할 수 있고 세포 외막 소포체 또한 동일한 방법으로 형성할 수 있다. 반면에 세포 내막 소포체는 cav1 등의 외래 유전자 발현을 통해 형성할 수 있다. 굽은 화살과 T 모형은 각각 프로모터와 전사종결자를 의미하며 실선과 점선은 각각 단일과 다중 반응을 나타낸다. 약어는 다음과 같다: G3P, glyceraldehyde 3-phosphate; E4P, erythrose 4-phosphate; PEP, phosphenolpyruvate; PYR, pyruvate; DXP, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate; SKM, shikimate; FPP, farnesyl diphosphate; GGPP, geranylgeranyl pyrophosphate; TRP, tryptophan; IPA, indole pyruvate; Sp., spontaneous.
도 2는 카로티노이드 생산 균주의 구축과 구축된 균주의 배양 결과를 나타낸다. (A)는 pLYC, pBTC, pZEA, pATX 라이브러리의 플라스미드 개요도를 나타낸다. 굽은 화살, 반구, T 모형은 각각 프로모터, 5'UTR, 전사 종결자를 의미한다. (B)는 LYC 균주들의 초기 스크리닝 결과를 나타낸다. 눈에 띄는 붉은 콜로니를 선별 후 테스트 튜브에서 배양하고, (C) 우수한 균주들을 다시 플라스크에서 배양하였다. (D)-(F)는 각각 BTC, ZEA, ATX 균주들의 테스트 튜브 배양 결과에 해당한다. (G)는 (F)에서의 우수 균주 50개의 샘플에 대한 HPLC 분석 결과이다. 각 샘플에 대하여 astaxanthin에 해당하는 peak의 면적 값이 y 축에 나타나 있다. (H), (I), (J)는 각각 테스트 튜브 배양에서 선택된 BTC, ZEA, ATX 균주들의 플라스크 배양 결과를 나타낸다. 오차 막대는 평균 ± 표준편차 (n=3)을 의미하며 **P < 0.01, ***P < 0.001, NS (not significant) P ≥ 0.05는 two-tailed Student's t-test에 의하여 결정되었다.
도 3은 비올라세인 유사체 생산 균주의 구축과 구축된 균주의 배양 결과를 나타낸다. (A)는 violacein 유사체들의 생산을 위하여 구축한 플라스미드 개요도이다. (B)는 glucose와 glycerol을 단일 탄소원으로 이용했을 때의 violacein 생산량 비교 결과 이고, (C)는 glycerol을 이용한 PDVIO와 PVIO 균주의 prodeoxyviolacein과 proviolacein 생산 결과를, (D)는 glycerol을 이용한 DVIO와 VIO 균주의 deoxyviolacein과 violacein 생산 결과를 나타낸다. 아래는 대장균 균주로부터 생산된 (E) prodeoxyviolacein과 (F) proviolacein의 LC-MS 크로마토그램과 스펙트럼과 (G) 파장대 범위 350~750nm의 카로티노이드와 비올라세인 유사체의 흡수 스펙트럼이다. (G) 그래프에서의 각각의 데이터 포인트는 세 개의 개별 샘플로부터 얻은 값의 평균값이며 이들 점을 이어 곡선 그래프를 나타내었다.
도 4는 세포 형태 변형과 세포 내막 소포체 형성을 통한 카로티노이드와 비올라세인 유사체의 증산 결과를 나타낸다. (A)는 대장균의 세포 형태 변형을 통한 세포막 공간 확장의 기작을 나타내며, 세포 형태 변형 관련 유전자의 발현을 억제하는 sRNA의 도입을 통한 (B) β과 (C) deoxyviolacein 생산 결과가 나타나 있다. (D)는 대장균에서의 세포 내막 소포체 형성의 기작을 나타내며, 그에 따른 (E) β과 (F) deoxyviolacein 생산 결과가 나타나 있다. 아래는 (G) β생산 대조군인 BTC1 균주, (H) cav1을 발현하는 β생산 균주, (I) deoxyviolacein 생산 대조군인 DVIO 균주, (J)　cav1을 발현하는 deoxyviolacein 생산 균주의 TEM (위 패널)과 SEM (아래 패널) 이미지다. 생산 그래프의 오차 막대는 평균 ± 표준편차 (n=3)을 의미하며 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, NS (not significant) P ≥ 0.05는 two-tailed Student's t-test에 의하여 결정되었다.
도 5는 세포 형태를 변형한 BTC1과 DVIO 균주의 현미경 사진이다. (A)는 BTC1 균주와, 세포 형태 변형에 관련된 유전자 발현을 억제하는 sRNA가 도입된 BTC1 균주의 현미경 사진이고, (B)는 DVIO 균주와, 세포 형태 변형에 관련된 유전자 발현을 억제하는 sRNA가 도입된 DVIO 균주의 현미경 사진이다. 세포 형태 변형 관련 유전자 발현을 억제하는 sRNA가 도입된 균주들에서 대조군보다 길거나 짧은 세포 형태가 관찰되었다. 각각의 현미경 사진마다 상응하는 발현 억제 목표 유전자가 표기되어 있다.
도 6은 세포 외막 소포체 형성 및 분비 증가를 통한 카로티노이드와 비올라세인 유사체 증산 결과를 나타낸다. (A)는 대장균에서의 세포 외막 소포체 형성의 기작을 나타내며, 그에 따른 (B) β과 (C) deoxyviolacein 생산 결과가 나타나 있다. 아래는 (D) rffD 및 rfaD 발현 억제 sRNA가 도입된 BTC1 균주와 (E) rfaI 발현 억제 sRNA가 도입된 DVIO 균주의 TEM (위 패널)과 SEM (아래 패널) 이미지와 (F) rffD 및 rfaD 발현 억제 sRNA가 도입된 BTC1 균주에서 형성된 세포 외막 소포체와 (위 패널) rfaI 발현 억제 sRNA가 도입된 DVIO 균주에서 형성된 세포 외막 소포체를 (아래 패널) 정제하여 분석한 SEM 이미지다. (G)는 세포 내막과 외막 소포체를 동시에 형성했을 때의　β-carotene 생산 결과이고, (H)는 세포 형태를 변형과 세포 내막과 외막 소포체 생산을 조합하여 적용했을 때의 deoxyviolacein 생산 결과이다. 그 아래는 (I) rffD와 rfaD 발현 억제 sRNA와 cav1-plsBC가 도입된 BTC1 균주와 (J) rfaI 발현 억제 sRNA와 cav1이 도입된 DVIO 균주의 TEM (위 패널)과 SEM (아래 패널) 이미지다.
도 7은 세포 외막 소포체로 인하여 배지로 분비된 카로티노이드와 비올라세인 유사체의 정량 결과를 나타낸다. (A)는 세포 외막 소포체 발현을 위하여 sRNA가 도입된 BTC1 균주 배양액의 상등액에서 추출한 β을, (B)는 정제한 세포 외막 소포체에서 추출한 β을 나타낸다. 여기서 OMV는 rffD와 rfaD의 발현을 억제하는 sRNA가 도입된 BTC1 균주를, IMV는 cav1과 plsBC가 도입된 BTC1 균주를 의미한다. (C)는 세포 외막 소포체 발현을 위하여 sRNA가 도입된 DVIO 균주 배양액의 상등액에서 추출한 deoxyviolacein을, (D)는 정제한 세포 외막 소포체에서 추출한 deoxyviolacein을 나타낸다. 여기서 OMV는 rfaI 발현을 억제하는 sRNA가 도입된 DVIO 균주를, IMV는 cav1이 도입된 DVIO 균주를 의미한다. (E)는 rfaI 발현 억제 sRNA가 도입된 DVIO의 플라스크 배양 시, 물 세척 이후에 남아있는 deoxyviolacein 결정체와 세포와 세포 외막 소포체로 이루어진 집합체의 현미경 사진이다. 아래는 세포 외막 소포체를 발현하는 (F) β과 (G) deoxyviolacein 생산 균주에 plsBC 유전자를 과발현한 플라스크 배양 결과이다. 다음으로 세포 외막 또는 내막 소포체를 발현하였을 때 (H) zeaxanthin, (I) astaxanthin, (J) proviolacein (K) prodeoxyviolacein, (L) violacein의 총 생산량 (Tot로 표기)과 분비 생산량 (Sec로 표기)이 각각 상응하는 그래프에 나타나 있다.　 오차 막대는 평균 ± 표준편차 (n=3)을 의미하며 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, NS (not significant) P ≥ 0.05는 two-tailed Student's t-test에 의하여 결정되었다.
도 8은 본 발명의 재조합 미생물을 사용하여 유가식 발효를 수행하는 경우 시간에 따른 각 소수성 물질의 생산량을 나타낸 것이다: (a) Astaxanthin, (b) beta-carotene, (c) Zeaxanthin, (d) Proviolacein, (e) Prodeoxyviolacein, (f) Violacein, (g) Deoxyviolacein.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→배향으로, 아미노산은 좌측에서 우측으로 N-말단 →말단 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
현재까지 미생물의 대사 회로를 조작하여 색깔을 띠는 천연 물질을 증산하려는 시도는 많이 이루어져 왔으나, 세포 내에 축적되는 물질들의 특성으로 인하여 이는 어느 정도의 한계점을 지닌다. 본 발명에서는 세포막을 다방면에서 엔지니어링하여 세포막의 면적을 넓히거나, 세포 내에 구조체를 만들어서 세포막을 확장시키거나, 해당 물질들을 소포체에 가두어 세포 밖으로 분출하도록 하여 소수성 색소들의 생산량을 획기적으로 증산시켰다.
본 발명의 일 실시예에서는 천연 색소인 carotenoids와 violacein 유사체 (analogs)를 대장균에서 생산하였다. Carotenoids와 violacein 유사체는 친유성 물질로서 대장균 내에서 생산될 때 세포질에 쌓이거나 세포 외로 형성되지 않고 세포막에 축적된다. 이에 착안하여 세포막 면적을 늘리고, 세포 내외로 소포체가 형성되게 하여 친유성 천연 색소 물질이 축적될 수 있는 공간이 확장되도록 하였다. 먼저 세 가지 carotenoids와 네 가지 violacein 유사체를 각각 생산하는 대장균 균주를 구축한 후에 세포막 면적 증가와 소포체 형성 여부에 따른 생산량 변화를 관찰하였다. 또한 모든 물질들의 생산에 있어 본 발명의 각 요소들의 시너지 효과를 테스트 및 검증하였다. 본 연구에서 사용한 전략은 천연 색소뿐만 아니라 항산화물질, 항생제, 화장품 첨가물, 항암제, 식품 첨가제 및 영양 보조제와 같은 여러 가지 다른 친유성 물질들을 대장균에서 생산하는 연구에 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 산업상 가장 많이 이용되는 소수성 물질 중에 하나인 천연 색소, 카르티노이드(carotenoids) 및 비올라세인(Violacein) 생산 균주를 구축하였으며, 소수성 물질 생산능의 증대를 위해, 상기 소수성 물질 생산 균주가 i) 세포막 면적 증가, ii) 세포 외막 소포체 형성 및 분비 증가, 또는 iii) 세포 내막 소포체 형성 증가 특성을 나타내도록 세포막 엔지니어링을 수행하였다. 생산 균주가 상기한 특성을 갖도록 세포막을 엔지니어링하기 위해, 세포 형태 관련 유전자, 및 세포 외막 소포체 관련 유전자를 스크리닝하였으며, 해당 상기 세포 형태 관련 유전자, 또는 세포 외막 소포체 관련 유전자를 타겟팅하는 sRNA를 처리하여 해당 유전자의 발현을 억제하는 경우 또는 세포 내막 소포체 관련 유전자를 과발현하는 경우에, 생산 균주의 천연 색소의 생산능이 현저하게 증가하는 것을 확인하였으며, 상기 유전자들의 발현 억제 또는 과발현을 조합하는 경우, 시너지 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 실시예에서는 대장균의 세포 형태 관련 유전자의 억제를 통한 세포막 면적 증가, 세포 외막 소포체 관련 유전자의 억제를 통한 세포 외막 소포체의 형성 및 분비 증가 및 세포 내막 소포체 관련 유전자의 과발현을 통한 내막 소포체의 형성증가가 세포 막에 축적되는 대표적인 소수성 물질인 천연 색소의 현저한 생산능 향상으로 나타나는 것을 확인하였다. 일반적으로 소수성 물질은 소수성을 띄는 세포막 또는 소포체의 내막 및 외막에 축적되기 때문에, 천연 색소뿐만 아니라, 미생물을 통해 생산될 수 있는 다양한 소수성 물질에서도 천연 색소와 동등한 수준의 생산능 향상을 나타낼 수 있음은 자명하게 이해될 수 있다.
따라서, 본 발명은 세포막 면적 증가; 세포 외막 소포체 형성 및 분비 증가; 및 세포 내막 소포체 형성 증가 중 어느 하나 이상의 특징을 갖도록 세포막 엔지니어링된 소수성 물질 생산용 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 용어 “세포막 엔지니어링”은 종래 세포가 가지는 세포막의 특성을 유전자 재조합 기술 등을 이용해 기존의 특성을 강화 또는 감소시키거나 새로운 특성을 부여하는 기술을 의미한다. 본 발명에서, 세포막 엔지니어링은 유전자의 억제, 과발현 및/또는 도입을 사용하여 수행되었으며, 세포막의 면적 증가, 및/또는 세포 외막 소포체의 형성 및 분비 증가, 및 내막 소포체의 형성 증가 특성을 부여하고자 하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기한 특징은 소수성 물질 생산용 재조합 미생물에 유전자 발현의 억제, 도입 또는 과발현을 통한 세포막 엔지니어링을 수행하여 부여되었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 세포 형태 관련 유전자, 및 세포 외막 소포체 관련 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자가 억제되고; 및/또는
세포 내막 소포체 관련 유전자가 과발현 또는 도입된 것을 특징으로 하는 소수성 물질 생산용 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 제조합 미생물은 세포 형태 관련 유전자, 및 세포 외막 소포체 관련 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자가 억제되어 있고; 및/또는
세포 내막 소포체 관련 유전자가 과발현 또는 도입되어 있어,
다음 중 어느 하나 이상의 특징을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다:
i) 세포막 면적 증가;
ii) 세포 외막 소포체 형성 및 분비 증가; 및
iii) 세포 내막 소포체 형성 증가
본 발명에 있어서, 상기 소수성 물질은 세포막에 축적되는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 소수성 물질은 천연 색소, 항산화물질, 항생제, 화장품 첨가물, 항암제, 식품 첨가제 및 영양 보조제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 천연 색소는 인공적으로 합성하지 않고 자연에서 얻을 수 있는 색소 또는 이의 유사체를 의미하는 것으로, 예를 들어, carotenoids, violacein 등이 있으며, 더욱 구체적인 예로 lycopene, βzeaxanthin, astaxanthin, Proviolacein(PVIO), prodeoxyviolacein (PDVIO), deoxyviolacein(DVIO), violacein(VIO) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항산화 물질은 예를 들어, quercetin, dihydroquercetin, kaempferol, dihydrokaempferol, astaxanthin, resveratrol, tocopherol, tocotrienol, coenzyme Q10, apigenin 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장품 첨가물은 예를 들어, aloesin, vitamin A, ceramide, pantothenate, panthenol, lupeol, squalene, eucalyptol, valencene 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 첨가제는 예를 들어, carminic acid, βlycopene 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 영양 보조제는 예를 들어, silymarin, lutein, vitamins, coenzyme-Q10, resveratrol, omega-3 polyunsaturated fatty acids, ubiquinone, glucosamine, luteolin 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 소수성 물질은 astaxanthin, beta-carotene, zeaxanthin, proviolacein, prodeoxyviolacein, deoxyviolacein 및 violacein으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, “세포 형태 관련 유전자”는 세포의 형태를 유지하는데 관여하는 유전자를 의미하며, 본 발명의 일 실시예에서는 필라멘트형의 재조합 세포의 형태가 보다 불규칙적 또는 구형이 되도록 하여 소수성 물질이 축적되는 세포막의 면적을 증가시키기 위해 상기 세포 형태 관련 유전자의 발현을 억제하였다. 본 발명에 있어서, 상기 세포 형태 관련 유전자는 발현 억제 시 세포의 형태가 변형되어 세포의 면적이 증가하게 되는 유전자라면 모두 포함될 수 있으며, 사용되는 재조합 미생물에 따라 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있고, 바람직하게는 상기 재조합 미생물이 선천적으로 포함하는 세포 형태를 형성, 유지 또는 변형하는데 필요한 유전자 중에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 형태 관련 유전자는 예를 들어, 세포 분열에 관여하는 유전자, 또는 세포골격/세포벽의 합성 또는 유지에 관여하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포 분열에 관여하는 유전자는 예를 들어, 세포 분열 단백질(cell division protein, 예, Fts proteins 등)과 세포 분열 억제 단백질(cell division inhibitor, 예, MinC, MinD 등) 등으로 이루어진 원핵 생물 유래의 세포 분열에 관여하는 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포골격/세포벽의 합성 또는 유지에 관여하는 유전자는 예를 들어, penicillin-binding protein (PBP), cell shape-determining protein (MreB, MreC 등), Peptidoglycan D,D-transpeptidase (MrdA, PbpA 등), peptidoglycan glycosyltransferase (MrdB 등), cytoskeleton protein (RodZ 등) 등으로 이루어진 원핵 생물 유래 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 천연 색소를 발현하도록 재조합된 대장균을 제조한 뒤, 스크리닝된 상기 세포 형태 관련 유전자 16종의 발현을 억제하여 세포막 엔지니어링을 수행하였다. (표 4). 예를들어, 상기 재조합 미생물이 대장균인 경우, 상기 세포 형태 관련 유전자는 rodZ (Cytoskeleton protein), ftsA (Cell division protein), ftsB (Cell division protein), ftsI (Peptidoglycan D,D-transpeptidase), ftsL (Cell division protein), ftsQ (Cell division protein), ftsW (Probable peptidoglycan glycosyltransferase), ftsZ (Cell division protein), minD (Septum site-determining protein), mrdA (Peptidoglycan D,D-transpeptidase), mrdB (Peptidoglycan glycosyltransferase), mreB (Cell shape-determining protein), mreC (Cell shape-determining protein), zipA (Cell division protein), murE (UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate--2,6-diaminopimelate ligase), pbpC (Penicillin-binding protein 1C) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직한 예를 들어, 예를 들어, deoxyviolacein을 생산하는 재조합 대장균의 경우, 상기 세포 형태 관련 유전자인 mrdB 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포 형태 관련 유전자는 사용되는 미생물, 생산하고자하는 소수성 물질에 따라 본 발명의 실시예에서 억제된 대장균의 세포 형태 관련 유전자에 상응하는 유전자 또는 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 유전자로 적절하게 변경 또는 선택될 수 있다.
본 발명에서, “세포 외막 소포체 관련 유전자”는 세포 외막 소포체의 형성 또는 분비에 관여하는 유전자를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는 미생물의 내인성 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자인 세포의 peptidoglycan layer 또는 세포 외막과 내막의 연결을 유지시켜주는 역할을 하는 유전자들의 발현을 억제하여, 세포 외막 소포체를 통해 세포 내에 축적되는 소수성 물질을 분출시킨 결과, 소수성 물질의 생산능이 현저히 향상되는 것을 확인하였다. 본 발명에 있어서, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는 억제 시, 세포의 외막 소모체의 형성 및 분비를 향상시킬 수 있는 유전자라면 모두 포함될 수 있으며, 사용되는 재조합 미생물에 따라 통상의 용이하게 선택될 수 있고, 바람직하게는 세포의 peptidoglycan layer 또는 세포 외막과 내막의 연결 유지에 관여하는 유전자인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는 세포외막/펩티도글리칸 구조 유지 관련 유전자, 세포 외막 단백질 발현 유전자, 세포막 대사회로관련 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포외막/펩티도글리칸 구조 유지 관련 유전자는 예를 들어, lipoprotein (Lpp), Tol-Pal system protein (TolB, Pal, TolA, TolR 등), lipopolysaccharide core biosynthesis protein, lipopolysaccharide core heptosyltransferase, lipid A biosynthesis lauroyltransferase 등의 세포외막/펩티도글리칸 구조 유지에 기여하는 원핵 생물 유래 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포 외막 단백질 발현 유전자는 예를 들어, outer-membrane protein A (OmpA), outer-membrane protein C (OmpC), outer-membrane protein F (OmpF), OprF (OmpA homologue), envelope protein (RagA, RagB 등) 등의 세포 외막 단백질 발현에 기여하는 원핵 생물 유래 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포막 대사회로 관련 유전자는 예를 들어, quinolone signal (PQS), anti-sigma-E factor, sigma factor H (AlgU), chaperone-protease (DegP) 등의 원핵 생물 유래 세포막 대사회로 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 천연 색소를 발현하도록 재조합된 대장균을 제조한 뒤, 스크리닝된 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자 26종의 발현을 억제하여 세포막 엔지니어링을 수행하였다. (표 7). 예를 들어, 상기 재조합 미생물이 대장균인 경우, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는 rseA (Anti-sigma-E factor), rseB (Sigma-E factor regulatory protein), rffD (UDP-N-acetyl-D-mannosamine dehydrogenase), rffC (dTDP-fucosamine acetyltransferase), rffA (dTDP-4-amino-4,6-dideoxygalactose transaminase), ompR (DNA-binding dual transcriptional regulator), gmhB (D-glycero-beta-D-manno-heptose-1,7-bisphosphate 7-phosphatase), lpxL (Lipid A biosynthesis lauroyltransferase), lpxM (Lipid A biosynthesis myristoyltransferase), ompA (Outer membrane protein), ompC (Outer membrane protein), rfaB (Lipopolysaccharide 1,6-galactosyltransferase), rfaC (Lipopolysaccharide heptosyltransferase 1), rfaD (ADP-L-glycero-D-manno-heptose-6-epimerase), rfaE (Bifunctional protein HldE), rfaG (Lipopolysaccharide core biosynthesis protein), rfaI (Lipopolysaccharide 1,3-galactosyltransferase), rfaJ (Lipopolysaccharide 1,2-glucosyltransferase), rfaK (Lipopolysaccharide 1,2-N-acetylglucosaminetransferase), rfaP (Lipopolysaccharide core heptose(I) kinase), rfaQ (Lipopolysaccharide core heptosyltransferase), rfaY (Lipopolysaccharide core heptose(II) kinase), rfbA (Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase 1), rffH (Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase 2), wzxE (ECA polysaccharide chain length modulation protein), 및 pnp (Polyribonucleotide nucleotidyltransferase), tolA (colicin import membrane protein), tolB (Tol-Pal system periplasmic protein), tolC (outer membrane protein), tolR (biopolymer transport protein), nlpI (lipoprotein), nlpD (murein hydrolase activator), ompF (outer membrane pore protein), pal (peptidoglycan-associated outer membrane lipoprotein), degS (serine endoprotease), degP (serine endoprotease), tatC (sec-independent protein translocase protein), lpp (murein lipoprotein) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 카로티노이드 색소인 Astaxanthin, β또는 zeaxanthin 을 생산하는 재조합 대장균의 경우, rfaD, rffD 및 rfaQ에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현 억제, 보다 바람직하게는 rffD 및 rfaD 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 예를 들어, violacein, prodeoxyviolacein, Proviolacein 및 deoxyviolacein 등과 같은 비올라세인 및 이의 유사체를 생산하는 재조합 대장균의 경우, rfaI 또는 rfaQ 유전자의 발현을 억제, 보다 바람직하게는 rfaI 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포 외막 소포체 관련 유전자는 사용되는 미생물, 생산하고자 하는 소수성 물질에 따라, 본 발명의 실시예에서 억제된 세포 외막 소포체 관련 유전자에 상응하는 유전자 또는 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 유전자로 적절하게 변경 또는 선택될 수 있다.
본 발명에서, “세포 내막 소포체 관련 유전자”는 세포 내막 소포체의 형성에 관여하는 유전자를 의미하며, 본 발명의 일 실시예에서는, 내막 소포체 시스템이 존재하지 않는 원핵 생물인 대장균을 사용하였기 때문에, 진핵세포 유래의 내막 소포체 시스템 중 인간 유래 caveola 유전자를 도입하여, 내막 세포가 형성될 수 있도록 세포막 엔지니어링을 수행하였다. 본 발명에 있어서, 세포 내막 소포체 관련 유전자는 세포 내막 소포체의 형성을 향상시키는 유전자라면 제한없이 선택되어 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 소수성 물질 생산용 재조합 미생물이 세포 내막 소포체 시스템이 없는 미생물인 경우, 세포 내막을 형성하는 다른 진핵 또는 원핵 생물 유래 내막 소포체 시스템 유전자가 도입되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 소수성 물질 생산용 재조합 세포가 선천적으로 세포 내막 소포체를 시스템을 포함하는 경우, 상기 세포자체의 세포 내막 소포체 유전자를 과발현되거나, 이와 함께 다른 진핵 또는 원핵 생물 유래 내막 소포체 시스템 유전자가 도입된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 내막 소포체 관련 유전자는 진핵 세포 유래의 caveola 시스템의 유전자 또는 clathrin-epsin 시스템의 유전자일 수 있으며, 또는 원핵 세포 유래의 mgs-dgs 시스템 등일 수 있고, 보다 구체적인 예로는 cav1 (Caveolin-1), cav2 (Caveolin-2), cav3 (Caveolin-3), EPN1 (Epsin1), CLINT1 (EpsinR), CLTC (clathrin heavy chain 1), CLTCL1 (clathrin heavy chain 2), CLTA (clathrin light chain A), CLTB (clathrin light chain B), AP180, AP2, almgs (1,2-diacylglycerol 3-glucosyltransferase), aldgs (1,2-diacylglycerol-3-glucose (1-2)-glucosyltransferase producing diglucosyldiacylglycerol) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, Astaxanthin, β및 Zeaxanthin과 같은 카로티노이드 색소를 생산하는 재조합 대장균의 경우, cav1 유전자를 도입 또는 과발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 비올라세인 또는 이의 유사체(Proviolacein, prodeoxyviolacein, deoxyviolacein)를 생산하는 재조합 대장균의 경우, cav1 유전자를 도입 또는 과발현 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포 내막 소포체 관련 유전자는 사용되는 미생물, 생산하고자 하는 소수성 물질에 따라 적절하게 변경 또는 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 세포 형태 관련 유전자의 발현 억제, 세포 외막 소포체 관련 유전자의 발현 억제, 및 세포 내막 유전자의 도입을 조합하는 경우 시너지 효과를 나타내어 더욱 현저한 생산량 증가를 나타냄을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 세포막 면적 증가; 세포 외막 소포체 형성 및 분비 증가; 및 세포 내막 소포체 형성 증가의 특성은 재조합 미생물의 종류, 생산하고자 하는 소수성 물질의 종류, 양, 발현 조건 등에 따라 조합되어 세포막 엔지니어링 되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포 형태 관련 유전자의 발현 억제, 세포외막 소포체 관련 유전자의 발현 억제, 및 세포 내막 소포체 관련 유전자의 도입 또는 과발현은 재조합 미생물의 종류, 생산하고자 하는 소수성 물질의 종류, 양, 발현 조건 등에 따라 조합될 수 있으며, 각각 관련 유전자에 속하는 유전자들 간에 조합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은
i) mrdB, rffD, rfaD 및 rfaI로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 억제 또는 낙다운되어 있고; 및/또는
ii) cav1 유전자가 도입 또는 과발현된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 확인한 각각의 소수성 물질 생산용 재조합 미생물에서 가장 뛰어난 생산량을 나타낸 유전자의 억제 및 도입/과별현 조합은 아래와 같다:
Astaxanthin: rffD & rfaD 낙다운 (OMV)
Beta-carotene: rffD & rfaD 낙다운 (OMV)
Zeaxanthin: rffD & rfaD 낙다운 (OMV)
Proviolacein: rfaI 낙다운 & cav1 과발현 (OMV & IMV)
Prodeoxyviolacein: rfaI 낙다운 (OMV)
Violacein: rfaI 낙다운 & cav1 과발현 (OMV & IMV)
Deoxyviolacein: rfaI 낙다운 & cav1 과발현 (OMV & IMV).
따라서, 본 발명에 있어서, 카로티노이드계 색소군을 생산하는 재조합 미생물의 경우, rfaD 및 rffD를 동시에 발현 억제하는 것이 가장 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 비올라세인 및 이의 유사체를 생산하는 재조합 미생물의 경우, rfaI의 발현을 억제하고, 동시에 cav1 유전자를 도입 또는 과발현을 유도하는 것이 가장 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 소수성 물질의 생산용 재조합 균주는 세포막 면적 증가; 세포 외막 소포체 형성 및 분비 증가; 및 세포 내막 소포체 형성 증가 중 어느 하나 이상의 특징을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 세포막 면적 증가, 세포외막 소포체 형성 및 분비증가, 및 세포 내막 소포체 형성 증가에 따라, 지질의 공급을 원활하게하기 위해 지질 합성효소 유전자인 plsBC 유전자의 발현을 증폭 시켰으며, 이 때 특히 카르티노이드 색소의 생산능 향상에 현저한 상승을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 소수성 물질의 생산용 재조합 미생물은 지질 합성효소 유전자을 과발현 하는 것을 추가적인 특징으로 할 수 있다.
예를 들어 상기 미생물이 대장균인 경우, 지질 합성효소 유전자의 과발현은 plsBC 유전자의 과발현인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “유전자 발현 억제”는 억제 대상 유전자의 전사 또는 번역을 억제 또는 조절하여 코딩하는 단백질의 발현을 감소 또는 차단하거나 단백질이 올바로 기능하지 않도록 하여 해당 유전자의 기능을 상실하게 만드는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 억제는 낙다운(knockdown)과 상호호환적으로 사용될 수 있다. 본 발명에서, 세포막 면적의 증가를 위해 세포 형태 관련 유전자의 발현이 억제될 수 있으며, 세포 외막 소포체의 형성 및 분비 증가를 위해, 세포외막/펩티도글리칸 구조 유지 관련 유전자, 세포 외막 단백질 발현 유전자, 세포막 대사회로 관련 유전자의 발현이 억제될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 유전자 발현의 억제는 종래 공지된 다양한 방법을 통해서 수행될 수 있다. 예를 들어, 제한효소, ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas등을 이용한 유전자 편집; 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide, Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (2): 125-40.); 리보자임(Ribozyme, Human Molecular Genetics. 7 (10): 1649-1653); siRNA, miRNA, shRNA 등을 이용한 RNA 간섭 기술, 합성 조절 sRNA (Na et al., Nat Biotechnol 2013, 31(2):170-174) 등을 통해 유전자의 발현이 억제될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어, “유전자 도입”은 목적하는 유전자 또는 이를 포함하는 벡터를 표적 세포 또는 미생물로 새롭게 유입시키는 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 유전자 도입은 천연 색소 생산 균주를 구축하기 위해 플라스미드 벡터를 사용하여 천연 색소 코딩 유전자를 대장균에 도입하였으며, 내막 소포체 형성 증진을 위해 세포 내막 소포체 관련 유전자를 플라스미드 벡터를 사용하여 재조합 미생물로 도입시켰다. 본 발명에 있어서, 상기 유전자는 종래에 공지된 다양한 방법을 통해 재조합 미생물로 도입될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 도입은 벡터를 사용하여 미생물로 도입되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 유전자가 직접적으로 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
본 발명의 용어, 유전자의 “과발현”은 유전자의 발현이 비변형 미생물과 비교하여 증가되어 비변형 미생물과 비교하여 리보핵산, 단백질 또는 효소의 세포내 농도의 증가로 이어지는 것을 의미한다. 통상의 기술자는 유전자의 과발현을 위해 종래에 공지된 다양한 방법을 제한없이 선택하여 수행할 수 있다.
과발현을 위한 종래에 공지된 기술은 예를 들어,
- 미생물에서 유전자의 카피수를 증가시키는 것; 유전자는 염색체로 또는 염색체 외로 코딩된다. 유전자가 염색체 상에 위치하는 경우에, 유전자의 여러 카피는 관련 기술분야의 전문가에게 공지된 재조합 방법 (유전자 대체를 포함함)에 의해 염색체 상에 도입될 수 있다. 유전자가 염색체 외로 위치하는 경우에, 그것은 세포에서 복제 기점 및 그에 따라 카피수가 상이한 상이한 유형의 플라스미드에 의해 보유될 수 있다. 이들 플라스미드는 플라스미드의 성질에 따라, 1 내지 5 카피, 또는 약 20 카피, 또는 최대 500 카피로 미생물에 존재한다: 치밀 복제를 갖는 저카피수 플라스미드 (pSC101, RK2), 저카피수 플라스미드 (pACYC, pRSF1010) 또는 고카피수 플라스미드 (pSK bluescript II).
- 유전자의 높은 수준의 발현으로 이어지는 프로모터를 사용하는 것; 예를 들어 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac, 또는 람다 프로모터 PR 및 PL이 폭넓게 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 프로모터는 특정한 화합물에 의해 또는 온도 또는 빛과 같은 특정 외부 조건에 의해 "유도성"일 수 있다. 이들 프로모터는 상동 또는 이종일 수 있다.
- 유전자의 특이적 또는 비-특이적인 전사 리프레서의 활성 또는 발현을 감쇠시키는 것;
- 상응하는 메신저 RNA를 안정화시키는 요소 (Carrier and Keasling, 1999) 또는 단백질을 안정화시키는 요소 (예를 들어, GST 태그, 지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하는 것;
- 5' 말단 비해석부위의 (5' untranslated region; 5' UTR) 서열을 변경 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 유전자를 발현시킬 수 있는 적합한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 함유하는 핵산 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 대장균에서 사용되는 단백질 발현 벡터로는 Novagen (미국) 사의 pET 계열, pCDF 계열, pRSF 계열, pACYC 계열 및 pCOLA 계열; Invitrogen (미국)의 pBAD 계열; Takara (일본)의 pHCE 나 pCOLD; 제노포커스 (대한민국)의 pACE 계열; 카이스트 (대한민국)의 pTac15K, pTrc99A, pTacCDFS, pTrcCDFS 계열; 넓은 균주 범위에서 활용 가능한 pBBR1MCS 계열 등을 사용할 수 있다. 고초균에서는 게놈의 특정부분에 목적 유전자를 삽입하여 단백질 발현을 구현하거나, MoBiTech (독일)의 pHT 계열의 벡터, 등을 사용할 수 있다. 곰팡이나 효모에서도 게놈 삽입이나 자가복제 벡터들 이용하여 단백질 발현이 가능하다. Agrobacterium tumefaciens나 Agrobacterium rhizogenes 등의 T-DNA 시스템을 이용하여 식물용 단백질 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 상기 기술한 프로모터 이외에도, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ은 E. coli에서 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절 가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현클로닝에 의해 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름 에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
상기 벡터에서, 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
상기 재조합 벡터는 형질전환 또는 형질감염 등의 방법으로 숙주세포에 도입될 수 있다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
당업계에 주지된 바와 같이, 재조합 세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 소수성 물질의 생산을 위한 미생물은 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 상기한 원핵세포 뿐만 아니라, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열(Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 대장균 또는 재조합 미생물뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용 가능하다. 예를 들어, CHO 세포주, HEK 세포주 등이 발현을 위한 숙주세포로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 매우 다양한 미생물/숙주세포 및 벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, pBBR1MCS 및 이들의 유도체와 같은 broad host range 세균성 플라스미드, pET, pCDF, pRSF, pACYC, pCOLA, pBAD, pHCE, pCOLD, pACE, pTac15K, pTrc99A, pTacCDFS, pTrcCDFS 및 이들의 유도체와 같은 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λ과 λ와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.
본 발명에 있어서, 상기 소수성 물질 생산용 재조합 미생물은 소수성 물질을 코딩하는 내인성 또는 외인성 유전자를 포함하여, 소수성 물질의 발현 능력을 갖는 미생물을 의미한다. 소수성 물질을 코딩하는 유전자가 외인성 유전자인 경우, 발현 미생물 또는 발현 세포에 도입되어 생산능을 가지도록 재조합된 발현 미생물이 세포막 엔지니어링 된 것일 수 있다. 미생물에 외인성 유전자를 도입하는 방법은 비제한적인 예를 들어, “형질전환”, “형질도입” 등의 방법으로 종래에 다양하게 공지되어 있으며, 통상의 기술자에 의해 적절한 방법이 선택되어 소수성 물질의 생산 미생물을 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 바람직하게는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(Cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 "내인성 유전자"는, 유전자가 임의의 유전자 변형 전에 미생물에 존재하였다는 것을 의미한다. 내인성 유전자는 내인성 조절 요소에 추가로 또는 이를 대체하도록 이종 서열을 도입함으로써, 또는 염색체 또는 플라스미드 내로 유전자의 1종 이상의 상보적 카피를 도입함으로써 과다발현될 수 있다. 내인성 유전자는 또한 그의 상응하는 코딩된 단백질의 발현 및 활성을 조정하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 유전자 산물을 변형시키기 위해 코딩 서열 내로 돌연변이가 도입될 수 있거나 또는 내인성 조절 요소에 추가로 또는 이를 대체하도록 이종 서열이 도입될 수 있다. 내인성 유전자의 조정은 유전자 산물의 활성의 상향-조절 및/또는 증진을 유발할 수 있거나, 또는 대안적으로, 내인성 유전자 산물의 활성을 하향 조절 및/또는 저하시킬 수 있다.
발현을 조정하는 또 다른 방식은, 내인성 유전자의 발현을 상향 또는 하향 조절하기 위해 유전자의 내인성 프로모터 (예를 들어, 야생형 프로모터)를 보다 강한 또는 보다 약한 프로모터로 교환하는 것이다. 이들 프로모터는 상동 또는 이종일 수 있다. 적절한 프로모터를 선택하는 것은 충분히 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다.
반대로, "외인성 유전자"는, 유전자가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 수단에 의해 미생물 내로 도입되었으며 이러한 유전자가 미생물에서 자연 발생하지 않는다는 것을 의미한다. 외인성 유전자는 숙주 염색체 내로 통합될 수 있거나, 또는 플라스미드 또는 벡터에 의해 염색체 외로 발현될 수 있다. 세포에서 복제 기점 및 카피수가 상이한 다양한 플라스미드가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들 유전자는 상동일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "상동 유전자"는 이론상 공통의 유전적 조상을 갖는 유전자를 나타내는 것으로 제한되지 않으나, 유전적으로 비관련될 수 있음에도 불구하고 유사한 기능을 수행하고/거나 유사한 구조를 갖는 단백질을 코딩하도록 진화한 유전자를 포함한다. 따라서 본 발명의 목적상 용어 "기능적 상동체"는 특정 효소적 활성이 정의된 아미노산 서열의 특정 단백질에 의해서, 뿐만 아니라 다른 (비)관련된 미생물로부터의 유사한 서열의 단백질에 의해서도 제공될 수 있다는 사실에 관한 것이다.
공지된 유전자에 대해 진뱅크(Genbank)에 주어진 참조를 사용하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서 동등한 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 상용 작업은, 다른 미생물로부터 유래된 유전자와의 서열 정렬을 수행하고 또 다른 유기체에서 상응하는 유전자를 클로닝하기 위한 축중성 프로브를 설계함으로써 결정될 수 있는 컨센서스 서열을 사용하여 유리하게 행해진다. 분자 생물학의 이들 상용 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 세포 형태 관련 유전자, 및 세포 외막 소포체 관련 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 억제; 및 세포 내막 소포체 관련 유전자의 과발현 또는 도입 중 어느 하나 이상의 세포막 엔지니어링을 수행하는 단계를 포함하는 소수성 물질의 생산용 재조합 미생물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 세포막 엔지니어링 단계는 지질 합성효소 유전자의 발현을 증가시키는 것을 추가적인 특징으로 할 수 있다.
예를 들어 상기 미생물이 대장균인 경우, 지질 합성효소 유전자의 발현 증가는 plsBC 유전자를 추가 과발현하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법으로 제조된 재조합 미생물은 세포 표면 면적 증가; 세포 외막 소포체의 형성 및 분비 증가; 및 세포 내막 소포체의 형성 증가 중 어느 하나 이상의 특징을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 재조합 미생물은 세포 표면 면적 증가; 세포 외막 소포체의 형성 및 분비 증가; 및 세포 내막 소포체의 형성 증가 중 어느 하나 이상의 특징을 가짐으로써, 재조합 미생물의 세포막에 축적되는 특징을 갖는 소수성 물질의 생산능을 현저하게 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 형태 관련 유전자는 예를 들어, 예를 들어, 세포 분열에 관여하는 유전자, 또는 세포골격/세포벽의 합성 또는 유지에 관여하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포 분열에 관여하는 유전자는 예를 들어, 세포 분열 단백질(cell division protein, 예, Fts proteins 등)과 세포 분열 억제 단백질(cell division inhibitor, 예, MinC, MinD 등) 등으로 이루어진 원핵 생물 유래의 세포 분열에 관여하는 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포골격/세포벽의 합성 또는 유지에 관여하는 유전자는 예를 들어, penicillin-binding protein (PBP), cell shape-determining protein (MreB, MreC 등), Peptidoglycan D,D-transpeptidase (MrdA, PbpA 등), peptidoglycan glycosyltransferase (MrdB 등), cytoskeleton protein (RodZ 등) 등으로 이루어진 원핵 생물 유래 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 재조합 미생물이 대장균인 경우, 상기 세포 형태 관련 유전자는 rodZ (Cytoskeleton protein), ftsA (Cell division protein), ftsB (Cell division protein), ftsI (Peptidoglycan D,D-transpeptidase), ftsL (Cell division protein), ftsQ (Cell division protein), ftsW (Probable peptidoglycan glycosyltransferase), ftsZ (Cell division protein), minD (Septum site-determining protein), mrdA (Peptidoglycan D,D-transpeptidase), mrdB (Peptidoglycan glycosyltransferase), mreB (Cell shape-determining protein), mreC (Cell shape-determining protein), zipA (Cell division protein), murE (UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate--2,6-diaminopimelate ligase), pbpC (Penicillin-binding protein 1C) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, deoxyviolacein을 생산하는 경우, mrdB 유전자의 발현을 억제하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는 억제 시, 세포의 외막 소포체의 형성 및 분비를 향상시킬 수 있는 유전자라면 모두 포함될 수 있으며, 사용되는 재조합 미생물에 따라 통상의 용이하게 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는 세포외막/펩티도글리칸 구조 유지 관련 유전자, 세포 외막 단백질 발현 유전자, 세포막 대사회로관련 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포외막/펩티도글리칸 구조 유지 관련 유전자는 예를 들어, lipoprotein (Lpp), Tol-Pal system protein (TolB, Pal, TolA, TolR 등), lipopolysaccharide core biosynthesis protein, lipopolysaccharide core heptosyltransferase, lipid A biosynthesis lauroyltransferase 등의 세포외막/펩티도글리칸 구조 유지에 기여하는 원핵 생물 유래 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포 외막 단백질 발현 유전자는 예를 들어, outer-membrane protein A (OmpA), outer-membrane protein C (OmpC), outer-membrane protein F (OmpF), OprF (OmpA homologue), envelope protein (RagA, RagB 등) 등의 세포 외막 단백질 발현에 기여하는 원핵 생물 유래 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포막 대사회로 관련 유전자는 예를 들어, quinolone signal (PQS), anti-sigma-E factor, sigma factor H (AlgU), chaperone-protease (DegP) 등의 원핵 생물 유래 세포막 대사회로 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 천연 색소를 발현하도록 재조합된 대장균을 제조한 뒤, 스크리닝된 상기 외막 소포체 관련 유전자 26종의 발현을 억제하여 세포막 엔지니어링을 수행하였다. (표 7). 본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물이 대장균인 경우, 상기 외막 소포체 관련 유전자는 rseA (Anti-sigma-E factor), rseB (Sigma-E factor regulatory protein), rffD (UDP-N-acetyl-D-mannosamine dehydrogenase), rffC (dTDP-fucosamine acetyltransferase), rffA (dTDP-4-amino-4,6-dideoxygalactose transaminase), ompR (DNA-binding dual transcriptional regulator), gmhB (D-glycero-beta-D-manno-heptose-1,7-bisphosphate 7-phosphatase), lpxL (Lipid A biosynthesis lauroyltransferase), lpxM (Lipid A biosynthesis myristoyltransferase), ompA (Outer membrane protein), ompC (Outer membrane protein), rfaB (Lipopolysaccharide 1,6-galactosyltransferase), rfaC (Lipopolysaccharide heptosyltransferase 1), rfaD (ADP-L-glycero-D-manno-heptose-6-epimerase), rfaE (Bifunctional protein HldE), rfaG (Lipopolysaccharide core biosynthesis protein), rfaI (Lipopolysaccharide 1,3-galactosyltransferase), rfaJ (Lipopolysaccharide 1,2-glucosyltransferase), rfaK (Lipopolysaccharide 1,2-N-acetylglucosaminetransferase), rfaP (Lipopolysaccharide core heptose(I) kinase), rfaQ (Lipopolysaccharide core heptosyltransferase), rfaY (Lipopolysaccharide core heptose(II) kinase), rfbA (Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase 1), rffH (Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase 2), wzxE (ECA polysaccharide chain length modulation protein), 및 pnp (Polyribonucleotide nucleotidyltransferase), tolA (colicin import membrane protein), tolB (Tol-Pal system periplasmic protein), tolC (outer membrane protein), tolR (biopolymer transport protein), nlpI (lipoprotein), nlpD (murein hydrolase activator), ompF (outer membrane pore protein), pal (peptidoglycan-associated outer membrane lipoprotein), degS (serine endoprotease), degP (serine endoprotease), tatC (sec-independent protein translocase protein), lpp (murein lipoprotein) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 소수성 물질 생산용 재조합 미생물이 세포 내막 소포체 시스템이 없는 미생물인 경우, 세포 내막을 형성하는 다른 진핵 또는 원핵 생물 유래 내막 소포체 시스템 유전자가 도입되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 소수성 물질 생산용 재조합 세포가 선천적으로 세포 내막 소포체를 시스템을 포함하는 경우, 상기 세포자체의 세포 내막 소포체 유전자를 과발현시키거나, 이와 함께 다른 진핵 또는 원핵 생물 유래 내막 소포체 시스템 유전자가 도입시키 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 세포 내막 소포체 관련 유전자는 진핵 세포 유래의 caveola 시스템의 유전자 또는 clathrin-epsin 시스템의 유전자일 수 있으며, 또는 원핵 세포 유래의 mgs-dgs 시스템 등일 수 있고, 보다 구체적인 예로는 cav1 (Caveolin-1), cav2 (Caveolin-2), cav3 (Caveolin-3), EPN1 (Epsin1), CLINT1 (EpsinR), CLTC (clathrin heavy chain 1), CLTCL1 (clathrin heavy chain 2), CLTA (clathrin light chain A), CLTB (clathrin light chain B), AP180, AP2, almgs (1,2-diacylglycerol 3-glucosyltransferase), aldgs (1,2-diacylglycerol-3-glucose (1-2)-glucosyltransferase producing diglucosyldiacylglycerol) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 재조합 미생물은 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(Cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 소수성 물질 생산용 재조합 미생물 또는 상기 방법으로 제조된 소수성 물질 생산용 재조합 미생물을 배양하여 소수성 물질을 생산하는 단계 및 생산된 소수성 물질을 수득하는 단계를 포함하는 소수성 물질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 소수성 물질 생산용 재조합 미생물을 배양하여 소수성 물질을 생산하는 단계는 종래에 공지된 다양한 미생물 배양 방법으로 제한없이 수행될 수 있으며, 균주, 생산하고자 하는 물질 등에 따라 배양 배지, 배양 조건(온도, 시간, 물리적 조건) 등이 적절하게 선택되어 수행될 수 있다.
본 발명의 용어 “배양”은 미생물을 배양하여, 목적하고자 하는 효능을 이끌어 내는 것을 의미하며, 본 발명에서 목적하고자 하는 효능은 소수성 물질의 생산을 의미한다. 상기 배양은 사용되는 미생물에 적합화되고 적어도 1종의 단순 탄소 공급원 및 필요한 경우에 공동-기질을 함유하는 적절한 배양 배지를 갖는 배양기에서 일반적으로 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “배양”은 미생물 배양을 통한 소수성 물질의 생산의 의미에서, “발효”와 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 소수성 물질을 생산하는 단계는 유가식 발효를 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 “유가식 배양” 또는 “유가식 발효”는 배지를 간헐적으로 추가 공급하여 배양액의 농도를 제어하여 배양/발효 시키는 것을 의미한다.
"적절한 배양 배지"는 탄소 공급원 또는 탄소 기질, 질소 공급원, 예를 들어 펩톤, 포도당, 글리세롤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 우레아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 및 인산암모늄; 인 공급원, 예를 들어 인산일칼륨 또는 인산이칼륨; 미량 원소 (예를 들어, 금속 염), 예를 들어 마그네슘 염, 코발트 염 및/또는 망가니즈 염; 뿐만 아니라 성장 인자, 예컨대 아미노산 및 비타민과 같이, 세포의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 유익한 영양소; 효모 추출물, 항생제 등을 포함할 수 있다.본 발명에 있어서, 상기 배양은 소수성 물질을 생산하기 위해 적절한 범위의 온도에서 배양되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어 30 내지 40℃바람직하게는 35 내지 38℃에서 배양되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 숙주 미생물의 종, 발현하고자 하는 물질 등에 따라 상이한 조건으로 배양될 수 있다.
본 발명은 목적은 세포막에 축적되는 소수성 물질을 세포막 엔지니어링을 수행하여 세포막 면적 증가, 세포 외막 소포체의 형성 및 분비 증가, 또는 내막 소포체의 형성 증가를 통해 생산능을 증대시키기 위함이다. 본 발명의 실시예에서는 대장균의 세포 형태 관련 유전자의 억제를 통한 세포막 면적 증가, 세포 외막 소포체 관련 유전자의 억제를 통한 세포 외막 소포체의 형성 및 분비 증가 및 세포 내막 소포체 관련 유전자의 과발현을 통한 내막 소포체의 형성증가가 세포 막에 축적되는 대표적인 소수성 물질인 천연 색소의 현저한 생산능 향상으로 나타나는 것을 확인하였다. 일반적으로 소수성 물질은 소수성을 띄는 세포막 또는 소포체의 내막 및 외막에 축적되기 때문에, 천연 색소뿐만 아니라, 미생물을 통해 생산될 수 있는 다양한 소수성 물질의 생산능 향상을 나타낼 수 있음은 자명하다 할 것이다.
따라서, 본 발명의 재조합 미생물이 생산하는 소수성 물질은 세포막에 축적되는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 소수성 물질은 천연 색소, 항산화물질, 항생제, 화장품 첨가물, 항암제, 식품 첨가제 및 영양 보조제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 천연 색소는 인공적으로 합성하지 않고 자연에서 얻을 수 있는 색소 또는 이의 유사체를 의미하는 것으로, 예를 들어, carotenoids, violacein 등이 있으며, 더욱 구체적인 예로 lycopene, βzeaxanthin, astaxanthin, Proviolacein(PVIO), prodeoxyviolacein (PDVIO), deoxyviolacein(DVIO), violacein(VIO) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항산화 물질은 예를 들어, quercetin, dihydroquercetin, kaempferol, dihydrokaempferol, astaxanthin, resveratrol, tocopherol, tocotrienol, coenzyme Q10, apigenin 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장품 첨가물은 예를 들어, aloesin, vitamin A, ceramide, pantothenate, panthenol, lupeol, squalene, eucalyptol, valencene 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 첨가제는 예를 들어, carminic acid, βlycopene 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 영양 보조제는 예를 들어, silymarin, lutein, vitamins, coenzyme-Q10, resveratrol, omega-3 polyunsaturated fatty acids, ubiquinone, glucosamine, luteolin 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기한 것과 같이 다양한 유전자의 억제, 도입 또는 과발현을 수행하여, 본 발명의 소수성 물질 생산용 재조합 미생물을 제조하고 전체적으로 소수성 물질의 생산능이 유지 또는 현저히 향상됨을 확인하였으나, 생산하고자 하는 소수성 물질에 따라, 가장 현저한 생산능의 증진 효과를 나타내는 유전자 조합의 세포막 엔지니어링이 상이한 것을 확인하였다.
소수성 물질의 경우 동일한 소수성을 나타내는 세포막에 축적되는 현상을 나타내기 때문에, 세포막 면적 향상, 세포 외막 소포체의 형성 및 분비 증가, 내막소포체 형성 증가를 위한 본 발명의 세포막이 엔지니어링된 재조합 미생물법은 소수성 물질의 생산능 향상을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명의 세포막 엔지니어링을 통한 소수성 물질 생산용 미생물은 다양한 유전자 조합의 억제, 도입, 또는 과발현을 통해 라이브러리로 구축될 수 있으며, 상기 라이브러리를 이용하여 특정한 소수성 물질에 대한 우수한 생산능을 나타내는 균주를 스크리닝 하는 것은 소수성 물질의 생산능이 향상된 재조합 균주의 선별 및 개발에 비용적, 절차적, 시간적으로 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 소수성 물질 생산용 미생물에 세포 형태 관련 유전자의 발현 억제; 세포 외막 소포체 관련 유전자의 발현 억제; 및 세포 내막 소포체 관련 유전자의 도입 또는 과발현 중 어느 하나 이상의 수단을 통해 세포막 엔지니어링을 수행하여 소수성 물질 생산용 미생물의 라이브러리에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 소수성 물질 생산용 미생물에 세포 형태 관련 유전자의 발현 억제; 세포 외막 소포체 관련 유전자의 발현 억제; 및 세포 내막 소포체 관련 유전자의 도입 또는 과발현 중 어느 하나 이상의 수단을 통해 세포막 엔지니어링을 수행하여 소수성 물질 생산용 미생물의 라이브러리를 생성하는 단계; 및
(b) 상기 소수성 물질 생산용 미생물을 배양하여 특정 소수성 물질의 생산능이 우수한 재조합 미생물을 선별하는 단계를 포함하는 특정소수성 물질의 생산능이 증가된 세포막 엔지니어링된 재조합 미생물의 스크리닝방법에 관한 것이다.
본 발명은 소수성 물질이 세포막에 축적되는 성질을 이용하여, 관련 유전자군의 억제 또는 과발현을 통한 세포막 엔지니어링을 통해 세포막 면적 증가, 세포 외막 소포체 형성 및 분비 증가, 및/또는 세포 내막 소포체 형성 증가의 특성을 갖는 소수성 물질 생산용 라이브러리를 생산할 수 있으며, 이를 기반으로 특정 소수성 물질의 생산능이 향상된 재조합 균주를 스크리닝 할 수 있는데 특징이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “소수성 물질 생산용 미생물의 라이브러리”는 세포 형태 관련 유전자의 발현 억제; 세포 외막 소포체 관련 유전자의 발현 억제, 및 세포 내막 소포체 관련 유전자의 도입 또는 과발현이 단독 또는 임의로 조합되어 수행된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 세포막 엔지니어링은 소수성 물질 생산용 미생물 라이브러리는 지질 합성효소 유전자의 발현을 증가시키는 것을 추가적인 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 라이브러리는 상기 세포 형태 관련 유전자 단독, 세포 형태 관련 유전자 간의 임의의 조합이 억제된 재조합 미생물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 형태 관련 유전자는 세포의 형태를 유지하는데 관여하는 유전자라면 모두 이에 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 형태 관련 유전자는 발현 억제 시 세포의 형태가 변형되어 세포의 면적이 증가하게 되는 유전자라면 모두 포함될 수 있으며, 사용되는 재조합 미생물에 따라 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 형태 관련 유전자는 예를 들어, 세포 분열에 관여하는 유전자, 또는 세포골격/세포벽의 합성 또는 유지에 관여하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포 분열에 관여하는 유전자는 예를 들어, 본 발명에 있어서, 세포 분열에 관여하는 유전자는 예를 들어, 세포 분열 단백질(cell division protein, 예, Fts proteins 등)과 세포 분열 억제 단백질(cell division inhibitor, 예, MinC, MinD 등) 등의 원핵 생물 유래의 효소군을 암호화하는 내인성 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포골격/세포벽의 합성 또는 유지에 관여하는 유전자는 예를 들어, penicillin-binding protein (PBP), cell shape-determining protein (MreB, MreC 등), Peptidoglycan D,D-transpeptidase (MrdA, PbpA 등), peptidoglycan glycosyltransferase (MrdB 등), cytoskeleton protein (RodZ 등) 등의 원핵 생물 유래 효소군을 암호화하는 내인성 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 예를들어, 상기 라이브러리를 제조하는데 사용되는 재조합 미생물이 대장균인 경우, 상기 세포 형태 관련 유전자는 rodZ (Cytoskeleton protein), ftsA (Cell division protein), ftsB (Cell division protein), ftsI (Peptidoglycan D,D-transpeptidase), ftsL (Cell division protein), ftsQ (Cell division protein), ftsW (Probable peptidoglycan glycosyltransferase), ftsZ (Cell division protein), minD (Septum site-determining protein), mrdA (Peptidoglycan D,D-transpeptidase), mrdB (Peptidoglycan glycosyltransferase), mreB (Cell shape-determining protein), mreC (Cell shape-determining protein), zipA (Cell division protein), murE (UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate--2,6-diaminopimelate ligase), pbpC (Penicillin-binding protein 1C) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 라이브러리는 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자 단독, 세포 외막 소포체 관련 유전자간의 임의의 조합이 억제된 재조합 미생물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는 세포 외막 소포체의 형성 또는 분비에 관여하는 유전자라면 모두 이에 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는 세포의 펩티도글리칸 층 또는 세포 외막과 내막의 연결을 유지시켜주는 역할을 하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는 세포외막/펩티도글리칸 구조 유지 관련 유전자, 세포 외막 단백질 발현 유전자, 세포막 대사회로관련 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포외막/펩티도글리칸 구조 유지 관련 유전자는 예를 들어, lipoprotein (Lpp), Tol-Pal system protein (TolB, Pal, TolA, TolR 등), lipopolysaccharide core biosynthesis protein, lipopolysaccharide core heptosyltransferase, lipid A biosynthesis lauroyltransferase 등의 세포외막/펩티도글리칸 구조 유지에 기여하는 원핵 생물 유래 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포 외막 단백질 발현 유전자는 예를 들어, outer-membrane protein A (OmpA), outer-membrane protein C (OmpC), outer-membrane protein F (OmpF), OprF (OmpA homologue), envelope protein (RagA, RagB 등) 등의 세포 외막 단백질 발현에 기여하는 원핵 생물 유래 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포막 대사회로 관련 유전자는 예를 들어, quinolone signal (PQS), anti-sigma-E factor, sigma factor H (AlgU), chaperone-protease (DegP) 등의 원핵 생물 유래 세포막 대사회로 효소군을 암호화하는 유전자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 예를 들어, 상기 재조합 미생물이 대장균인 경우, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는 rseA (Anti-sigma-E factor), rseB (Sigma-E factor regulatory protein), rffD (UDP-N-acetyl-D-mannosamine dehydrogenase), rffC (dTDP-fucosamine acetyltransferase), rffA (dTDP-4-amino-4,6-dideoxygalactose transaminase), ompR (DNA-binding dual transcriptional regulator), gmhB (D-glycero-beta-D-manno-heptose-1,7-bisphosphate 7-phosphatase), lpxL (Lipid A biosynthesis lauroyltransferase), lpxM (Lipid A biosynthesis myristoyltransferase), ompA (Outer membrane protein), ompC (Outer membrane protein), rfaB (Lipopolysaccharide 1,6-galactosyltransferase), rfaC (Lipopolysaccharide heptosyltransferase 1), rfaD (ADP-L-glycero-D-manno-heptose-6-epimerase), rfaE (Bifunctional protein HldE), rfaG (Lipopolysaccharide core biosynthesis protein), rfaI (Lipopolysaccharide 1,3-galactosyltransferase), rfaJ (Lipopolysaccharide 1,2-glucosyltransferase), rfaK (Lipopolysaccharide 1,2-N-acetylglucosaminetransferase), rfaP (Lipopolysaccharide core heptose(I) kinase), rfaQ (Lipopolysaccharide core heptosyltransferase), rfaY (Lipopolysaccharide core heptose(II) kinase), rfbA (Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase 1), rffH (Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase 2), wzxE (ECA polysaccharide chain length modulation protein), 및 pnp (Polyribonucleotide nucleotidyltransferase), tolA (colicin import membrane protein), tolB (Tol-Pal system periplasmic protein), tolC (outer membrane protein), tolR (biopolymer transport protein), nlpI (lipoprotein), nlpD (murein hydrolase activator), ompF (outer membrane pore protein), pal (peptidoglycan-associated outer membrane lipoprotein), degS (serine endoprotease), degP (serine endoprotease), tatC (sec-independent protein translocase protein), lpp (murein lipoprotein) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 라이브러리는 상기 세포 내막 소포체 관련 유전자 단독, 세포 내막 소포체 관련 유전자간의 임의의 조합이 억제된 재조합 미생물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서, “세포 내막 소포체 관련 유전자”는 세포 내막 소포체의 형성에 관여하는 유전자라면 모두 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포 내막 소포체 관련 유전자는 세포 내막 소포체의 형성을 향상시키는 유전자라면 제한없이 선택되어 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 소수성 물질 생산용 재조합 미생물이 세포 내막 소포체 시스템이 없는 미생물인 경우, 세포 내막을 형성하는 다른 진핵 또는 원핵 생물 유래 내막 소포체 시스템 유전자가 도입되어 라이브러리를 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소수성 물질 생산용 재조합 미생물이 선천적으로 세포 내막 소포체를 시스템을 포함하는 경우, 상기 세포 내막 소포체의 관련 유전자를 과발현시키거나, 이와 함께 다른 진핵 또는 원핵 생물 유래 내막 소포체 시스템 유전자가 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 내막 소포체 관련 유전자는 진핵 세포 유래의 caveola 시스템의 유전자 또는 clathrin-epsin 시스템의 유전자일 수 있으며, 또는 원핵 세포 유래의 mgs-dgs 시스템 등일 수 있고, 보다 구체적인 예로는 cav1 (Caveolin-1), cav2 (Caveolin-2), cav3 (Caveolin-3), EPN1 (Epsin1), CLINT1 (EpsinR), CLTC (clathrin heavy chain 1), CLTCL1 (clathrin heavy chain 2), CLTA (clathrin light chain A), CLTB (clathrin light chain B), AP180, AP2, almgs (1,2-diacylglycerol 3-glucosyltransferase), aldgs (1,2-diacylglycerol-3-glucose (1-2)-glucosyltransferase producing diglucosyldiacylglycerol) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 소수성 생산용 미생물의 라이브러리는 세포 형태 관련 유전자들, 세포 외막 소포체 관련 유전자들 및 세포 내막 소포체 관련 유전자들로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 이들 유전자의 임의의 조합이 억제, 도입, 또는 과발현된 재조합 미생물을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소수성 생산용 미생물의 라이브러리는 단일 속 또는 단일 종의 미생물을 포함할 수 있으며, 서로 상이한 속 또는 종의 미생물이 혼합되어 포함될 수도 있다.
본 발명에 있어서 상기 소수성 생산용 미생물의 라이브러리는 대장균, 리조비움 (Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아 (Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터 (Aggregatibacter), 잔토모나스 (Xanthomonas), 비브리오 (Vibrio), 슈도모나스 (Pseudomonas), 아조토박터 (Azotobacter), 애시네토박터 (Acinetobacter), 랄스토니아 (Ralstonia), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 로도박터 (Rhodobacter), 자이모모나스 (Zymomonas), 바실러스 (Bacillus), 스테필로코커스 (Staphylococcus), 락토코커스 (Lactococcus), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 클로스트리디움 (Clostridium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 사이아노박테리움 (Cyanobacterium), 사이클로박테리움 (Cyclobacterium) 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 미생물을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 소수성 물질 생산용 미생물의 라이브러리는 세포막 면적 증가; 세포 외막 소포체 형성 및 분비증가; 및 세포 내막 소포체 형성 증가 중 어느 하나 이상의 특징을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
실시예 1: 천연 색소 생산 균주의 구축
실시예 1-1: 카로티노이드 생산 균주의 구축
Carotenoids는 무지개 스펙트럼에서 빨강, 주황, 노랑 빛을 담당하는데, 다양한 carotenoids 중에서 βzeaxanthin, astaxanthin이 대표적이며 각각 주황, 노랑, 빨강 빛을 띤다. 이 세 가지 carotenoids를 생산하는 대장균 구축에 앞서, 이들의 전구체가 되는 lycopene 생산 균주를 먼저 구축하였다. 대장균은 원래 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate 생산 경로를 통하여 farnesyl diphosphate를 생산할 수 있으므로, carotenoids 합성 경로에서 가장 앞에 위치하는 lycopene 생산을 위해서는 crtE, crtB, crtI의 세 가지 유전자의 도입이 필요하다 (도 1). 불필요한 전구체가 축적되는 것을 방지하고 대사 흐름의 균형을 맞추기 위하여 각각의 유전자의 발현 수준을 다양하게 조합하여 스크리닝하였다. 발현 수준은 5' 말단 비해석부위의 (5' untranslated region; 5' UTR) 서열을 변경함으로써 조절되도록 하였다 (도 2A). 5' UTR 서열 라이브러리 (library)는 각각의 유전자에 대해 UTR 라이브러리 디자이너 프로그램을 이용하여 구축하였고 총 16개의 5' UTR 서열로 구성되도록 하였다. 16가지의 다른 5'UTR 서열이 융합된 각각의 유전자를 조합하여 pTac15K 플라스미드에 도입하여 pLYC 라이브러리를 구축하였다. pLYC 라이브러리를 구축하기 위해서, 먼저 pTac15K 플라스미드를 [서열번호 1]와 [서열번호 2]의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭으로 선형화하였다. 다음으로 crtE, crtB, crtI 유전자를 pCar184 (Choi et al., Appl Environ Microbiol 2010, 76(10):3097-3105) 플라스미드에서 각각 [서열번호 3]와 [서열번호 4], [서열번호 5]와 [서열번호 6], [서열번호 7]와 [서열번호 8] 프라이머로 각각 PCR 증폭한 후 선형화된 pTac15k 플라스미드에 Gibson assembly를 통하여 클로닝하였다.
lycopene 생산 균주의 구축에 사용된 프라이머
이름 서열 서열 번호
pTac15K 플라스미드-프라이머(Forward) CTTGGCTGTTTTGGCGGATG 1
pTac15K 플라스미드-프라이머(Reverse) TGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC 2
crtE 프라이머 (Forward) ATAACAATTT CACACAGGAA ACACGYTCMG CGGAAAGRAG CATCGWCCAT GTATCCGTTT ATAAGGACA 3
crtE 프라이머 (Reverse) TTAACTGACGGCAGCGAGTT 4
crtB 프라이머 (Forward) CGCTGCCGTC AGTTAAARCC TTGTTCAAAG GMSYATCTAG GATGAATAAT CCGTCGTTAC T 5
crtB 프라이머 (Reverse) TTCGAACGGTTCTTAGAGCGGGCGCTGCCA 6
crtI 프라이머 (Forward) GCTCTAAGAACCGTTCGAAWGSAGCRTMCAAGATGAAACCAACTACGGTAAT 7
crtI 프라이머 (Reverse) CGCCAAAACAGCCAAGTTAAATCAGATCCTCCAGC 8
구축한 pLYC 라이브러리를 본 연구진의 선행 연구에서 개발한 대장균 WLGB-RPP 균주에 도입한 후,　pLYC 라이브러리 크기의 10배에 달하는 콜로니 (colony) 중에서 특히 진한 색을 띠는 콜로니 200개를 선별하여 테스트 튜브 배양을 시행 후 생산된 lycopene을 추출하여 474 nm에서의 흡광도를 비교하였다. 그 중 상위 10개 균주에 대하여 플라스크 배양을 추가적으로 진행하였고 LYC79 균주에서 가장 많은 23.90 mg/L의 lycopene이 생산되었다.
선별한 LYC79 균주를 기반으로 βzeaxanthin, astaxanthin 생산 균주도 마찬가지 방법으로 구축하였다. 먼저 lycopene에서 β을 생산하는 데는 crtY 유전자가, β에서 zeaxanthin을 생산하는 데는 crtZ가, zeaxanthin에서 astaxanthin을 생산하는 데는 BKT가 추가적으로 필요하다. 이 각각의 유전자에 대해 각기 다른 16개의 5' UTR 서열로 구성된 5' UTR 라이브러리를 구축하여 유전자의 5' 말단에 융합하였다.
pBTC 라이브러리를 구축하기 위해서, 먼저 pTrcCDFS 플라스미드를 [서열번호 9]와 [서열번호 10] 프라이머를 이용하여 PCR 증폭으로 선형화하였다. pCar184 플라스미드로부터 [서열번호 11]와 [서열번호 12] 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 crtY는 선형화된 pTrcCDFS에 Gibson assembly를 통하여 클로닝하였다. pZEA 라이브러리 구축을 위해서는 pCar184로부터 각각 [서열번호 11]와 [서열번호 13], [서열번호 14]와 [서열번호 15] 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 crtY와 crtZ를 선형화된 pTrcCDFS에 Gibson assembly를 통하여 클로닝하였다. pATX 라이브러리 구축을 위해서는 pAX1 (Park et al., Metab Eng 2018, 49:105-115) 플라스미드에서 [서열번호 16]와 [서열번호 17] 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 trCrBKT를 pZEA의 SalI/HindIII 사이트로 삽입하였다.
β-carotene, zeaxanthin, astaxanthin 생산 균주의 구축에 사용된 프라이머
이름 서열 서열 번호
pTrcCDFS 플라스미드-프라이머(Forward) 5'-TCTAGAGTCGACCTGCAG-3' 9
pTrcCDFS 플라스미드-프라이머(Reverse) 5'-TCTGTTTCCTGTGTGAAATT-3' 10
crtY 프라이머 (Forward) 5'-CAATTTCACA CAGGAAACAG ACCTTCCTCC AWAAGRAGCA TCMASTATGG GAGCGGCTAT G-3' 11
crtY 프라이머1 (Reverse) 5'-GCAGGTCGACTCTAGATTAACGATGAGTCGTCATAA-3' 12
crtY 프라이머2 (Reverse) 5'-TTAACGATGAGTCGTCATAA-3' 13
crtZ 프라이머 (Forward) 5'-CATTATGACG ACTCATCGTT AAAGTACATC CGAMMGSAGC ATCCTTKATG TTGTGGATTT GGAATGC-3' 14
crtZ 프라이머 (Reverse) 5'-GCAGGTCGACTCTAGATTACTTCCCGGATGC-3' 15
trCrBKT 프라이머 Forward) 5'-AGACAGGTCGACKCCACCCCGCAAAGGAGSATCGKCRATGGGTCCGGGCATC-3' 16
trCrBKT 프라이머 (Reverse) 5'-AGACAGAAGCTTTTACGCCAGCGCCGC-3' 17
구축된 pBTC, pZEA, pATX 라이브러리를 LYC79 균주에 도입하여 각각 20, 40, 200개의 콜로니를 육안으로 선별 후 테스트 튜브 배양하였다. 생산된 βzeaxanthin, astaxanthin는 각각 아세톤 (acetone) 추출하여 473, 452, 475 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 생산 농도를 비교하였다. 이 때, astaxanthin은 전구체인 canthaxanthin과 육안과 흡광도 측정으로 그 색을 구분할 수 없으므로 흡광도 측정 결과 상위 50개 균주에 대해서는 HPLC 분석을 추가적으로 진행하였다. 테스트 튜브 배양에서 βzeaxanthin, astaxanthin를 가장 많이 생산하는 3개, 5개, 10개 균주에 대하여 플라스크 배양을 시행하였고 BTC1, ZEA20, ATX68 균주가 각각 18.65 mg/L β12.67 mg/L zeaxanthin, 14.49 mg/L로 가장 많은 생산량을 보였고 최종 균주로 선별되었다 (도 2).
1-2. Violacein 유사체 생산 균주 구축
Carotenoids에 이어 무지개 스펙트럼을 완성하기 위하여 본 연구진은 violacein 유사체를 생산하고자 하였다. 비올라세인 유사체는 bis-indole 색소로 분류되며 Chromobacterium violaceum과 Janthinobacterium lividum 등과 같은 박테리아로부터 생산되고, 항암 효과와 같이 다양한 약리적 효능을 지닌다고 알려져있다. 따라서 본 연구진은 네 종류의 비올라세인 유사체인 prodeoxyviolacein, proviolacein, deoxyviolacein, violacein을 생산할 수 있도록 생합성 경로를 구축하였고 (도 1, 도 3A), 이로부터 생산된 물질들의 색깔을 관찰하였다 (도 3G). 본 연구진이 기존의 연구로부터 violacein 유사체들의 공통된 전구체인 tryptophan 과생산 균주를 이미 구축하였으므로 (IND5 harboring pTacGEL), 해당 균주에 pTacCDFS 벡터 기반의 violacein 유사체 생합성 경로를 도입한 플라스미드들을 형질전환시켜 violacein 유사체 생산 기본 균주들을 제작하였다.
우선 pTacCDFS 플라스미드를 기본 벡터로 삼고, [서열번호 18]와 [서열번호 19] 프라이머를 이용하여 역 PCR 반응을 수행하여 플라스미드를 선형화하였다. 그 후 vioAB 유전자를 두 유전자 조각으로 쪼개 증폭하였는데 첫 번째 조각은 [서열번호 20]와 [서열번호 21], 두 번째 조각은 [서열번호 22]와 [서열번호 23]로 증폭하였다. 해당 두 DNA 조각은 앞서 선형화된 플라스미드와 Gibson assembly를 통하여 클로닝되어 pTacCDFS-vioAB 플라스미드가 제작되었다. 동일한 방법을 이용하여 pTacCDFS-vioC, pTacCDFS-vioD, pTacCDFS-vioCD, pTacCDFS-vioE 플라스미드를 구축하였다. 유전자 vioC, vioD, vioCD와 vioE는 각각 프라이머 쌍 [서열번호 24]와 [서열번호 25], [서열번호 26]와 [서열번호 27], [서열번호 24]와 [서열번호 27], 그리고 [서열번호 28]와 [서열번호 29]들을 이용하여 PCR 증폭되었다. Prodeoxyviolacein (PDVIO) 생산을 위한 플라스미드 pPDVIO (pTacCDFS-vioABE)는 다음과 같이 구축되었다. pTacCDFS-vioE 플라스미드를 템플릿으로 하여 [서열번호 30]와 [서열번호 31] 프라이머를 활용하여 vioE 유전자 조각을 증폭하였고, 이를 pTacCDFS-vioAB 플라스미드에 SacI 사이트에 삽입하였다. Proviolacein (PVIO), deoxyviolacein (DVIO), violacein (VIO)를 각각 생산하기 위한 pPVIO (pTacCDFS-vioABDE), pDVIO (pTacCDFS-vioABCE), pVIO (pTacCDFS-vioABCDE) 플라스미드는 다음과 같이 구축되었다. 각 플라스미드 pTacCDFS-vioC, pTacCDFS-vioD, pTacCDFS-vioCD를 템플릿으로 하여 [서열번호 32]와 [서열번호 31]를 공통된 프라이머로 활용하여 각 유전자 조각 vioC, vioD, vioCD를 증폭하였다. 증폭된 유전자들은 pTacCDFS-vioABE 플라스미드의 SacI 사이트로 삽입되어 pDVIO (pTacCDFS-vioABCE), pPVIO (pTacCDFS-vioABDE), pVIO (pTacCDFS-vioABCDE) 플라스미드를 완성하였다.
Violacein 유사체 생산 균주의 구축에 사용된 프라이머
이름 서열 서열 번호
pTacCDFS 플라스미드 프라이머 (Foward) 5'-TGGAATTCGAGCTCGGTACC-3' 18
pTacCDFS 플라스미드 프라이머 (Reverse) 5'-TTCACACAGGAAACAGACCA-3' 19
vioAB 프라이머 (Forward) 5'-CACACAGGAAACAGACCAATGAAGCATTCTTCCGATATCTGC-3' 20
vioAB_mid 프라이머(Reverse) 5'-GCCAGGCTTCGGAATCGAATG-3' 21
vioAB_mid 프라이머(Forward) 5'-CATTCGATTCCGAAGCCTGGC-3' 22
vioAB 프라이머(Reverse) 5'-GGTACCGAGCTCGAATTCCATTATCAGGCCTCTCTAGAAAGCTTTCC-3' 23
vioC 프라이머(Forward) 5'-CACACAGGAAACAGACCAATGAAAAGAGCAATCATAGTCGG-3' 24
vioC 프라이머(Reverse) 5'-GGTACCGAGCTCGAATTCCATTATCAGTTGACCCTCCCTATCTTG-3' 25
vioD 프라이머(Forward) 5'-CACACAGGAAACAGACCAATGAAGATTCTGGTCATCGGC-3' 26
vioD 프라이머(Reverse) 5'-GGTACCGAGCTCGAATTCCATTATCAGCGTTGCAGCGCGTAG-3' 27
vioE 프라이머(Forward) 5'-CACACAGGAAACAGACCAATGGAAAACCGGGAACCGCC-3' 28
vioE 프라이머(Reverse) 5'-GGTACCGAGCTCGAATTCCATTACTAGCGCTTGGCGGCGAAG-3' 29
vioE_frag 프라이머(Forward) 5'-CCTGATAATGGAATTCGAGCTGACTGCACGGTGCACCAATG-3' 30
vioE_frag 프라이머(Reverse) 5'-CAGGTCGACTCTAGAGGATCC-3' 31
vio_frag 프라이머(Forward) 5'-GCTAGTAATGGAATTCGAGCTGACTGCACGGTGCACCAATG-3' 32
Violacein 생산 균주를 포도당 및 글리세롤을 각각 탄소원으로 하여 플라스크 배양을 수행하였을 때, 도 3b에서와 같이 글리세롤을 탄소원으로 하였을 때 더 높은 농도의 violacein이 생산되었다. 이에 따라 모든 violacein 유사체들은 글리세롤을 탄소원으로 활용하였다. 　위와 같이 구축된 균주들로부터는, vioABCE 생합성 경로(BGC)를 도입하였을 때 1.09 g/L의 deoxyviolacein이 생산되었고, vioABCDE BGC를 도입하였을 때 1.36 g/L의 violacein, 0.13 g/L의 deoxyviolacein이 생산되었다 (도 3D). vioABE BGC를 도입하였을 때는 prodeoxyviolacein이, vioABDE BGC를 도입하였을 때는 proviolacein이 생산되었지만, 표준 물질이 존재하지 않아 정량이 불가능하여 violacein의 HPLC 상 교정 테이블 (calibration table)을 토대로 계산되었다 (도 3C).
플라스크 배양 조건은 다음과 같다. 카로티노이드 생산 균주의 경우 콜로니를 적절한 농도의 항생제가 첨가된 3 mL의 TB (terrific broth; 20 g tryptone, 24 g yeast extract, 4 mL of glycerol, 0.017 M KH2PO4, and 0.072 M K2HPO4 per liter) 배지에 접종하였고, 섭씨 30도에서 배양하였다. 배양액의 OD600이 1-2가 되었을 때 1 mL의 배양액을 20 mL의 TB 배지를 담고 있는 250 mL 둥근 플라스크로 계대 배양 수행하였고, 역시 OD600이 1-2가 될 때까지 배양을 진행하였다. 비올라세인 유사체의 경우 콜로니를 적절한 농도의 항생제가 첨가된 10 mL LB 배지에 접종하였고, 섭씨 37도에서 하룻밤동안 배양하였다. 그 후 준비된 카로티노이드와 비올라세인 유사체 배양액을 3 g/L yeast extract, 20 g/L 글리세롤 (비올라세인 유사체의 경우 추가적으로 3 g/L (NH4)2SO4) 이 첨가된 50 mL의 R/2 배지를 담고 있는 250 mL 배플 플라스크로 계대한 후, 섭씨 30도, 200 rpm에서 배양하였다. R/2 배지 (pH 6.8) 조성은 다음과 같다 (리터 당): 2 g (NH4)2HPO4, 6.75 g KH2PO4, 0.85 g citric acid, 0.7 g MgSO4.7H2O, and 5 ml trace metal solution (TMS) [10 g FeSO4.7H2O, 2.25 g ZnSO4.7H2O, 1 g CuSO4.5H2O, 0.5 g MnSO4.5H2O, 0.23 g Na2B4O7.10H2O, 2 g CaCl2.2H2O 및 0.1 g (NH4)6Mo7O24 per liter of 5 M HCl]. 배양액의 OD600가 0.6-0.8이 되었을 때 1 mM isopropyl β(IPTG)를 첨가하여 외래 유전자 발현을 유도하였다. 유도 후 카로티노이드의 경우 36시간, 비올라세인 유사체의 경우 48시간 동안 배양하였다.
배양 후 다음과 같은 조건으로 생산량 분석을 진행하였다. 카로티노이드의 경우, 1 mL의 배양액을 원심분리기를 활용하여 세포들을 모은 후, 상층액을 제거하고 1 mL의 아세톤을 첨가하여 섭씨 55도, 1,500 rpm에서 격렬하게 와동을 주어 세포 내부의 물질을 추출하였다. 원심분리기를 활용하여 추출액 중의 세포 찌꺼기를 걸러주어, 상층액의 카로티노이드 추출액을 얻을 수 있었다. 비올라세인 유사체의 경우 50 μL 배양액(추측되는 농도 범위에 따라 적절히 첨가하는 배양액의 부피를 조절할 수 있음; 총 부피가 1 mL이 되도록 첨가하는 DMSO의 양을 조절)을 950 μL dimethylsulfoxide (DMSO)와 섞은 후 섭씨 40도, 1,500 rpm에서 격렬하게 와동을 주어 세포 내외부의 물질을 추출하였다. 그 후 상기와 동일하게 원심분리기를 활용하여 추출액 중의 세포 찌꺼기를 걸러주어, 상층액의 비올라세인 유사체 추출액을 얻을 수 있었다. 각 추출액의 정량 분석은 HPLC를 이용하여 수행하였다. 표준 물질이 없는 비올라세인 유사체의 경우 LC-MS를 이용하여 진위를 판별하였다 (도 3E 내지 도 3F).
실시예 2. 세포 형태 엔지니어링을 통한 무지개 색소의 증산
Carotenoids는 긴 탄소 사슬을 지니고, violacein 유사체들은 소수성의 탄소 고리들을 지니기 때문에, 소수성의 특성을 보인다. 이러한 특성 때문에 carotenoids와 violacein 유사체들은 대장균 내에서 생산되었을 때, 세포 밖으로 나오기보다는 세포 안에, 특히 세포막에 낀 상태로 축적된다. 따라서 세포막 면적을 확장함으로써 수용 한도를 높여 해당 물질들을 더욱 과량으로 생산하고자 하였다. 이를 위하여 세포막 관련 대사 회로를 담당하는 유전자들의 발현을 억제시키고자 하였다. 표적 유전자의 발현 억제를 위해서는 합성 조절 sRNA 도구 (Na et al., Nat Biotechnol 2013, 31(2):170-174)를 활용하였다. 발현 억제 표적으로는 세포 분열과 세포 형태 유지에 관여하는 16 종의 유전자를 선별하였다 (표4). 발현 억제 표적 유전자는 두 가지 기준에 의하여 선별되었는데, 첫 번째 기준은 세포 분열과 관련된 유전자들이다 (ftsABILQWZ, minD, zipA). 세포 분열을 억제하면 세포의 길이가 변할 것으로 예상된다 (도 4A). 두 번째 기준은 세포 벽 합성 또는 유지와 관련된 유전자들인데(rodZ, mrdAB, mreBCE, murE), 세포 벽이 대장균의 막대형 형태를 결정하기 때문에 세포 벽과 관련된 유전자를 발현 억제하면 세포의 형태가 보다 구형이며 불규칙적으로 변할 것으로 예상된다 (도 4A). 본 실시예에서는 위의 두 가지 기준에 의거하여 가장 효과가 좋을 것으로 예상되는 유전자 표적을 선별하였지만, 반드시 해당 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니며 위의 두 기준에 해당되는 다른 유전자 또한 표적으로 활용될 수 있다.
세포 형태 관련 유전자(세포막 관련 대사 회로 유전자) 타겟 16종
유전자 단백질 기능 Essentiality* NCBI ID
rodZ transmembrane component of cytoskeleton NE 946992
ftsA ATP-binding cell division protein involved in recruitment of FtsK to Z ring E 944778
ftsB cell division protein E 946033
ftsI transpeptidase involved in septal peptidoglycan synthesis E 944799
ftsL membrane bound cell division protein at septum containing leucine zipper motif E 944803
ftsQ membrane anchored protein involved in growth of wall at septum E 944823
ftsW integral membrane protein involved in stabilising FstZ ring during cell division E 946322
ftsZ GTP-binding tubulin-like cell division protein E 944786
minD membrane ATPase of the MinC-MinD-MinE system E 945741
mrdA transpeptidase involved in peptidoglycan synthesis E 945240
mrdB cell wall shape-determining protein E 945238
mreB cell wall structural complex MreBCD, actin-like component MreB E 948588
mreC cell wall structural complex MreBCD transmembrane component MreC E 947655
zipA cell division protein involved in Z ring assembly E 946869
murE UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate:meso- diaminopimelate ligase E 944791
pbpC fused transglycosylase and transpeptidase NE 947152
*E, 최소 배지에서 배양 시 대장균 세포 성장에 필수적인 유전자; NE, 최소 배지에서 배양 시 대장균 세포 성장에 필수적이지 않은 유전자.　
대부분의 표적 유전자들은 필수 유전자들이었으며, 이는 sRNA 기술의 활용의 필요성을 잘 나타내어주고 있다. 해당 실험에서는 대표적으로 β생산 균주와 deoxyviolacein 생산 균주를 이용하여 테스트하였으며, 그 결과는 도 4B 내지 4C와 같다.　
도 4 및 도 5에서 확인할 수 있듯이, β생산 균주에서는 세포막 관련 유전자들을 발현 억제하였을 때 세포 형태의 변화는 관찰되었지만 생산량은 오히려 감소하였다. 반면에 deoxyviolacein 생산 균주에서는 mrdB 유전자를 발현억제시켰을 때 생산량이 많이 증가하여 1.37 g/L에 달하였다 (25% 증산). mrdB를 발현억제시켰을 경우, 예상된 바와 같이 세포의 길이가 짧아지며, 보다 구형의 형태를 나타내어, 세포막 면적이 오히려 감소되는 것을 알 수 있다.
실시예 3. 세포 내막 소포체 형성을 통한 무지개 색소의 증산
무지개 색소의 생산량을 보다 증가시키기 위하여, 본 연구진은 진핵세포 시스템에 존재하는 세포 내막 소포체를 도입하고자 하였다. 이를 통하여 세포 자체의 부피는 그대로 두면서 동시에 세포 내부의 막 면적을 넓힘으로써 막에 축적되는 물질들의 생산량 또한 증가시키고자 하였다 (도 4D). 도입한 세포내막 소포체 유전자는 진핵 생물의 세포 내막 소포체 시스템들 중 특히 caveola를 차용하였는데, caveola는 골지체 또는 소포체의 주름진 형태를 담당하고 있다. 우선 pTrc99A 플라스미드에 cav1, cav2, cav3 유전자를 도입한 후, 각각 β과 deoxyviolacein 생산 균주에 도입한 후 플라스크 배양을 진행하였다. 본 실시예에서는 진핵 생물의 caveola 시스템을 차용하였지만, 세포 내막을 형성하는 다른 진핵 또는 원핵 생물 유래 시스템 (진핵 생물의 clathrin-epsin 시스템, 원핵 생물의 mgs-dgs 시스템 등) 또한 본 발명과 동일한 범위에 해당된다.
각 cav1 [서열번호 36], cav2 [서열번호 37]와 cav3 [서열번호 38] 유전자는 Homo sapiens 유래 유전자 서열을 대장균 코돈 최적화 후 활용되었다. pTrc99A-cav1 플라스미드 구축을 위하여 cav1 유전자는 pTrc99A 플라스미드의 EcoRI과 BamHI 사이트로 삽입되었다. pTrc99A-cav2와 pTrc99A-cav3의 구축을 위해 cav2와 cav3 유전자는 각각 pTrc99A 플라스미드에 NcoI과 BamHI 사이트로 삽입되었다. pTrc99A-cav12 플라스미드(cav1, cav2 모두를 보유)의 구축을 위하여 cav2 유전자를 [서열번호 33]와 [서열번호 34] 프라이머를 활용하여 증폭 후, pTrc99A-cav1 플라스미드에 BamHI과 PstI 사이트로 삽입하였다. pTrc99A-cav23과 pTrc99A-cav13의 구축을 위해서 cav3 유전자를 [서열번호 35]와 [서열번호 34] 프라이머를 활용하여 증폭 후, 각각 pTrc99A-cav2와 pTrc99A-cav1 플라스미드에 PstI 사이트에 삽입하였다. pTrc99A-cav123 플라스미드의 구축을 위하여 상기 증폭된 cav3 유전자를 pTrc99A-cav12 플라스미드의 PstI 사이트에 삽입하였다.
도입된 세포 내막 소포체 관련 유전자 및 프라이머 서열
이름 서열 서열 번호
cav2 프라이머(Forward) TTAACTGGATCCTTTCACACAGGAAACAGACCATGGGGCTTGAGACTGAGAAG 33
cav 프라이머(Reverse) CATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTG 34
cav3 프라이머(Forward) TTAACTCTGCAGTTTCACACAGGAAACAGACCATGATGGCCGAAGAGCATACC 35
cav1 atgtctgggg gcaaatacgt agactcggag ggacatctct acaccgttcc catccgggaa cagggcaaca tctacaagcc caacaacaag gccatggcag acgagctgag cgagaagcaa gtgtacgacg cgcacaccaa ggagatcgac ctggtcaacc gcgaccctaa acacctcaac gatgacgtgg tcaagattga ctttgaagat gtgattgcag aaccagaagg gacacacagt tttcacggca tttggaaggc cagcttcacc accttcactg tgacgaaata ctggttttac cgcttgctgt ctgccctctt tggcatcccg atggcactca tctggggcat ttacttcgcc attctctctt tcctgcacat ctgggcagtt gtaccatgca ttaagagctt cctgattgag attcagtgca ccagccgtgt ctattccatc tacgtccaca ccgtctgtga cccactcttt gaagctgttg ggaaaatatt cagcaatgtc cgcatcaact tgcagaaaga aatataa 36
cav2 atggggcttg agactgagaa ggcagatgtc caactgttca tggatgatga ttcttactca catcactcag gactggaatatgcagatccagaaaagtttgcggactccgaccaggatcgtgacccccaccgcttaaatagtcacttaaaactgggctttgaagatgtgatcgcggagcctgtcacaactcatagtttcgataaggtttggatttgctcacacgcattatttgaaatttcaaagtacgttatgtataagttccttactgtatttttggccatccctcttgcctttatcgcaggaatcctgttcgctaccttgagttgtctgcacatttggattcttatgccattcgtaaagacatgccttatggtgttgccatcagtgcaaaccatctggaagtccgtcactgatgtaattattgcccctttgtgtacatctgtgggccgctgcttttcgagcgtctcacttcaattgtcgcaggattaa 37
cav3 atgatggccgaagagcataccgatcttgaagctcaaattgtaaaggatattcattgtaaggaaattgacttggttaatcgtgatcctaagaacatcaacgaggatatcgttaaggtagacttcgaggatgttattgcagaacctgttggaacatacagtttcgacggtgtctggaaggtgtcgtacactacgtttaccgttagtaagtattggtgctatcgcttactgtccactctgttgggtgtcccccttgctttgctttggggattcctgttcgcgtgtatctctttttgccatatttgggctgtcgttccatgtattaaatcgtacttaattgagattcaatgtatctctcatatttatagtctttgtatccgcacgttctgtaatcccctttttgcggccttggggcaggtgtgctcaagtattaaggttgtacttcgtaaggaggtctaa 38
세포 내 막 구조체를 형성함에 따라 부족할 수 있는 세포막 지질을 보다 공급하기 위하여 대장균의 plsBC 유전자를 증폭해 주었는데, 이를 위하여 우선 pTrc99A-plsBC 플라스미드를 구축하였다. 따라서 plsB와 plsC 유전자를 대장균의 genomic DNA로부터 [서열번호 39], [서열번호 40] 프라이머와 [서열번호 41], [서열번호 42] 프라이머 쌍을 각각 이용하여 증폭 후, pTrc99A 플라스미드의 PstI과 HindIII 사이트에 Gibson assembly를 이용하여 삽입하였다. 그 후 구축된 플라스미드를 PstI과 HindIII 제한 효소를 이용하여 자른 후, plsBC 유전자 조각을 분리하여 pTrc99A-cav1 플라스미드의 PstI과 HindIII 사이트로 삽입하여 pTrc99A-cav1-plsBC 플라스미드를 구축하였다.
세포 내 막 구조체를 형성함에 따라 부족할 수 있는 세포막 지질을 보다 공급하기 위하여 대장균의 plsBC 유전자를 증폭해 주었는데, 이를 위하여 우선 pTrc99A-plsBC 플라스미드를 구축하였다. 따라서 plsB와 plsC 유전자를 대장균의 genomic DNA로부터 [서열번호 39], [서열번호 40] 프라이머와 [서열번호 41], [서열번호 42] 프라이머 쌍을 각각 이용하여 증폭 후, pTrc99A 플라스미드의 PstI과 HindIII 사이트에 Gibson assembly를 이용하여 삽입하였다. 그 후 구축된 플라스미드를 PstI과 HindIII 제한 효소를 이용하여 자른 후, plsBC 유전자 조각을 분리하여 pTrc99A-cav1 플라스미드의 PstI과 HindIII 사이트로 삽입하여 pTrc99A-cav1-plsBC 플라스미드를 구축하였다.
세포막 지질 합성 효소 유전자 증폭에 사용된 프라이머
이름 서열 서열 번호
plsB 프라이머(Forward) CTAGAGTCGACCTGCAGTTTCACACAGGAAACAGACCATGTCCGGCTGGCCACGA 39
plsB 프라이머(Reverse) TCTGTTTCCTGTGTGAAATTACCCTTCGCCCTGCGTC 40
plsC 프라이머(Forward) GAAGGGTAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCTATATATCTTTCGTCTTATTATTACC 41
plsC 프라이머1(Reverse) CCGCCAAAACAGCCAAGCTTTTAAACTTTTCCGGCGGC 42
그 결과, β과 deoxyviolacein 생산 균주 모두 cav1 유전자를 발현하였을 경우 생산량이 각각 21.89 mg/L와 1.28 g/L로 가장 크게 증가하였다. 특히 deoxyviolacein 생산 균주의 경우, cav1, cav2, cav3를 조합으로 두 개 또는 세 개씩 발현시켰을 때에는 오히려 생산량이 급격히 줄어듦을 알 수 있었다 (도 4E 및 도 4F). TEM(각 도의 상단) 및 SEM(각 도의 하단)을 통해 대조군(도 4G 및 4I) 및 cav1 과발현 균주(도 4H 및 4J)에서 내막 소포체의 형성이 유도되었는지를 확인한 결과, cav1 과발현 균주에서 세포의 형태에는 대조군과 큰차이를 나타내지 않으면서도 내막 소포체가 성공적으로 형성되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 세포 외막 소포체의 형성 및 분비 증가를 통한 무지개 색소의 증산
무지개 색소의 생산량을 보다 증가시키기 위하여, 본 연구진은 미생물 본연의 세포 외막 소포체 형성 유전자의 발현을 증가시킴으로써 소포체를 통하여 세포 내에 축적되는 무지개 색소들을 밖으로 분출시키고자 하였다 (도 6A). 세포 외막 소포체의 발현을 위해서는 특정 유전자를 발현시키는 것이 아닌, 세포의 peptidoglycan layer 또는 세포 외막과 내막의 연결을 유지시켜주는 역할을 하는 유전자들의 발현을 억제시키는 것이 중요하다고 보고되어 있다. 따라서 본 연구진은 역시 sRNA 기반 표적 유전자 발현억제 시스템을 이용하여 총 26종의 표적 유전자의 발현 세기를 억제시키고자 하였다. 선별된 26 종의 발현억제 유전자 표적은 다음과 같다: rseA, rseB, rffD, rffC, rffA, ompR, gmhB, lpxL, ompA, ompC, rfaB, rfaC, rfaD, rfaE, rfaG, rfaI, rfaJ, rfaK, rfaP, rfaQ, rfaY, rfbA, rffH, wzxE, pnp (표 7). 이 때, (1) 세포외막/펩티도글리칸 구조 유지 관련 유전자 타겟들은 rfaG, rffA, rffC, rffD, rffH 등이고, (2) 세포 외막 단백질 발현에 해당하는 유전자 타겟들은 ompR, ompC 등이고, (3) 세포막 대사 회로의 anti-sigma factor 발현과 관계된 유전자 타겟들은 rseA, rseB 등이다. 본 실시예에서는 위의 세 가지 기준에 의거하여 가장 효과가 좋을 것으로 예상되는 유전자 표적을 선별하였지만, 반드시 해당 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니며 위의 세 기준에 해당되는 다른 유전자 또한 표적으로 활용될 수 있다. 해당 유전자 표적들을 발현억제 시켰을 때의 β과 deoxyviolacein 생산량은 도 6B 및 6C와 같다. β의 경우, rfaD, rffD, rfaQ를 각각 발현억제하였을 때 생산량이 각각 26.43, 24.21, 20.29 mg/L로 유효하게 증가하였다. Deoxyviolacein의 경우, 특히 rfaI와 rfaQ를 발현억제시켰을 경우 생산량이 많이 증가되었는데, rfaI를 발현억제 시킨 균주에서는 1.74 g/L이 생산되었다.　
rffD와 rfaD 발현 억제 sRNA가 도입된 BTC1 균주 및 rfaI 발현 억제 sRNA가 도입된 DVIO 균주를 SEM 및 TEM을 통해 관찰한 결과, 세포 외막 소포체의 형성 및 분비가 현저히 증가하였음을 확인하였다 (도 6D-F). 특히, rfaI 발현 억제 sRNA가 도입된 DVIO 균주를 배양하였을 때 플라스크 벽면에 세포 외막 소포체, deoxyviolacein 및 세포 찌꺼기 등이 뭉쳐 있는 것을 발견하였는데, 이를 현미경으로 관찰한 사진은 도 7E와 같다.
세포 외막 소포체 형성 및 분비의 증가를 위한 세포외막 소포체 관련 유전자 타겟 26종
Target gene Protein function Essentiality* NCBI ID
rseA Inhibitor of σE NE 947053
rseB Inhibitor of σE E 947054
rffD Genes involved in ECA pathway E 948977
rffC Genes involved in ECA pathway NE 948298
rffA Genes involved in ECA pathway NE 948296
ompR Response regulator for ompC and ompF NE 947913
gmhB Genes involved in LPS pathway NE 944879
lpxL Genes involved in LPS pathway NE 946216
lpxM Genes involved in LPS pathway NE 945143
ompA Outer membrane protein A NE 945571
ompC Outer membrane porin NE 946716
rfaB Genes involved in LPS pathway E 948144
rfaC Genes involved in LPS pathway NE 948136
rfaD Genes involved in LPS pathway NE 948134
rfaE Genes involved in LPS pathway NE 947548
rfaG LPS core biosynthesis; glucosyl transferase NE 948149
rfaI Genes involved in LPS pathway NE 948143
rfaJ Genes involved in LPS pathway E 948142
rfaK Genes involved in LPS pathway E 948147
rfaP Genes involved in LPS pathway E 948150
rfaQ Genes involved in LPS pathway E 948155
rfaY Genes involved in LPS pathway E 948145
rfbA Genes involved in ECA pathway NE 945154
rffH Genes involved in ECA pathway E 948299
wzxE Inner membrane translocase for a component of ECA NE 948294
pnp Polynucleotide phosphorylase NE 947672
*E, 최소 배지에서 배양 시 대장균 세포 성장에 필수적인 유전자; NE, 최소 배지에서 배양 시 대장균 세포 성장에 필수적이지 않은 유전자.　
실시예 5. 세포 형태 변형과 소포체 형성의 시너지효과 확인
현재까지 나온 결과들을 토대로 각 카테고리 별로 가장 효과가 좋았던 유전자 조작 표적들을 조합으로 시너지 효과를 테스트하고자 하였다.
동시 다중 표적 유전자 낙다운을 위한 sRNA 플라스미드 클로닝은 다음과 같이 진행되었다. 첫 번째 sRNA 조각은 [서열번호 43]와 [서열번호 44] 프라이머를 이용하여 PCR 증폭되었고, 두 번째 sRNA 조각을 포함하고 있는 플라스미드는 [서열번호 45]와 [서열번호 46] 프라이머를 이용하여 역 PCR을 통해 선형화되었다. 이렇게 생성된 두 sRNA 포함 조각을 Gibson assembly를 이용하여 합쳐 이중 낙다운을 위한 sRNA 플라스미드를 완성하였다. sRNA를 포함한 플라스미드에 대장균 plsBC를 삽입하기 위해서 pTrc99A-plsBC 플라스미드를 템플릿으로 하여 [서열번호 47]와 [서열번호 48] 프라이머를 이용하여 plsBC 유전자를 PCR 증폭하였고, 이를 sRNA 포함 플라스미드에 SphI 사이트로 삽입하였다.　 sRNA를 포함한 플라스미드에 cav1 유전자를 삽입하기 위하여 pTrc99A-cav1 플라스미드를 템플릿으로 하여 [서열번호 47]와 [서열번호 49] 프라이머를 이용하여 sRNA를 포함한 플라스미드에 SphI 사이트에 삽입하였다.
세포막 지질 합성 효소 유전자 증폭에 사용된 프라이머
이름 서열 서열 번호
sRNA 프라이머1(Forward) CACTAGATCTCAAATGTGCTGGAATTCTAACACCGTGCGTG 43
sRNA 프라이머1(Reverse) CCTTATAAATCAAACATGTGCGGCGAATTGGGTACCTATAAAC 44
sRNA 프라이머2(Forward) GCACATGTTTGATTTATAAGGG 45
sRNA프라이머2(Reverse) CAGCACATTTGAGATCTAGTGG 46
ptrc 프라이머(Forward) ATGTGACAGCTTATCGCATGCTTGACAATTAATCATCCGG 47
plsC 프라이머2(Reverse) CCTGGGTTTACCTAGGCATGCTTAAACTTTTCCGGCGGCTTC 48
cav1 프라이머(Reverse) CCTGGGTTTACCTAGGCATGCTTATATTTCTTTCTGCAAGTTG 49
먼저 β생산 균주의 경우, 실시예 2의 세포막 대사 회로 관련 유전자를 발현억제하였을　때는 생산량 증가가 확인되지 않았으므로 실시예 3의 세포내막 소포체 발현 유전자 (cav1) 과발현과 실시예 4의 세포 외막 소포체 발현 표적 유전자 (rfaD, rffD, rfaD)의 발현억제를 조합하여 적용하였다. 먼저 세포 외막 소포체 발현 표적 유전자 세 개를 각각 다르게 조합하여 발현억제하였는데, rfaD와 rffD를 동시에 발현억제하였을 때 β생산량이 34.2 mg/L로 크게 증가하였다(도 6B). 해당 균주에 추가적으로 세포내막 소포체 형성을 위하여 cav1 유전자를 과발현하였으나 생산량이 오히려 감소하였다 (도 6G).
Deoxyviolacein 생산 균주에서는 실시예 2의 세포막 대사 회로 표적 유전자 (mrdB), 실시예 3의 세포내막 소포체 발현 유전자 (cav1), 그리고 실시예 4의 세포 외막 소포체 발현 표적 유전자 (rfaI)를 두 개씩 혹은 세 개씩 조합으로 발현시켜 deoxyviolacein 생산량을 테스트하였다. 그 결과, rfaI 발현억제 cav1 과발현 균주에서 1.9 g/L deoxyviolacein 생산량을 보이며, 가장 많이 증산된 결과를 보여주었다 (도 6H).
rffD와 rfaD 발현 억제 sRNA와 cav1-plsBC가 도입된 BTC1 균주와 rfaI 발현 억제 sRNA와 cav1이 도입된 DVIO 균주를 SEM 과 TEM으로 관찰한 결과, 세포 외막 소포체의 형성 및 분비 증가와 내막 소포체의 형성 증가가 동시에 발현되는 것을 확인하였다 (도 6I 및 6J).
상기 실시예들에서 적용하였던 전략을 다른 소수성 색소에도 적용하여 본 발명의 범용성을 보여주고자 하였다. 이에 카로티노이드 대표 화합물인 β과 비올라세인 유사체 대표 화합물인 deoxyviolacein 증산에 가장 효과적이었던 세포막 엔지니어링 전략을 각각의 카테고리의 남은 무지개 색소들에 적용하였다. β을 증산하는데 cav1과 plsBC 유전자의 동시 과발현을 통한 세포 내막 소포체 형성과 rffD와 rfaD 유전자의 발현 억제를 통한 세포 외막 소포체 형성이 각각 효과적으로 향상되었으므로, 이들 전략을 zeaxanthin과 astaxanthin 생산 균주인 ZEA20과 ATX68에 적용하여 테스트하였다. 그 결과, 세포 내막 소포체 형성은 zeaxanthin 생산을 오히려 감소시켰고 astaxanthin생산은 소량 증가시켰다. 반면에 세포 외막 소포체 형성은 zeaxanthin과 astaxanthin 생산을 모두 증가시켰다 (각 18.38 mg/L; 도 7H, 22.69 mg/L; 도 7I). Violacein 유사체들의 경우, 세포 내막 소포체와 외막 소포체의 동시 발현이 가장 높은 deoxyviolacein 생산량으로 이어졌으므로, 세포 내막 소포체와 외막 소포체를 각각 또는 동시에 발현시킴으로써 그 효과를 알아보고자 하였다. 이에 따라 (1) 세포 외막 소포체의 과발현을 위한 rfaI 낙다운, (2) 세포 내막 소포체의 과발현을 위한 cav1의 과발현 및 (3) rfaI 낙다운과 cav1 과발현의 세 전략을 테스트하였다. Proviolacein과 violacein의 경우 세포 내막 소포체와 외막 소포체를 동시 발현시켰을 때 가장 높은 생산량을 얻을 수 있었다 (각 402 mg/L; 도 7J, 2.84 g/L; 도 7L). 하지만 prodeoxyviolacein의 경우에는 세포 외막 소포체만 발현시켰을 때 가장 높은 생산량을 얻을 수 있었다 (341 mg/L; 도 7K). 이 때 proviolacein과 prodeoxyviolacein의 경우에는 상업적으로 판매되는 시약을 구할 수 없었으므로 HPLC와 연결된 fraction collector를 이용하여 해당 물질을 정제한 후 정량하였다.
실시예 7. 무지개 색소 고효율 생산을 위한 유가식 발효 공정 개발
상기 실시예에서 구축된 재조합 대장균 균주들을 이용하여 6.6 L 발효기에서 유가식 발효를 수행하고자 하였다. 유가식 발효는 다음과 같은 조건에서 수행되었다. 카로티노이드 생산 균주들의 경우, 30 g/L 포도당 또는 글리세롤, 3 g/L yeast extract 및 항생제가 포함된 1.6 L R/2 배지 (pH 6.95)를 첨가한 6.6 L 발효기 (BioFlo 320, Eppendorf)에서 배양되었다. 비올라세인 유도체 생산 균주들의 경우 20 g/L 포도당 또는 글리세롤, 3 g/L yeast extract, 3 g/L (NH4)2SO4 및 항생제가 포함된 1.95 L R/2 배지 (pH 6.8)를 첨가한 6.6 L 발효기 (BioFlo 320, Eppendorf)에서 배양되었다. 카로티노이드 생산 균주의 경우 콜로니를 적절한 농도의 항생제가 첨가된 3 mL의 TB 배지에 접종하였고, 섭씨 30도에서 배양하였다. 비올라세인 유사체의 경우 콜로니를 적절한 농도의 항생제가 첨가된 10 mL LB 배지에 접종하였고, 섭씨 37도에서 하룻밤동안 배양하였다. 그 후 준비된 카로티노이드와 비올라세인 유사체 배양액을 3 g/L yeast extract, 20 g/L 글리세롤 또는 포도당 (비올라세인 유사체의 경우 추가적으로 3 g/L (NH4)2SO4) 이 첨가된 50 mL의 R/2 배지를 담고 있는 250 mL 배플 플라스크로 계대한 후, 섭씨 30도, 200 rpm에서 배양하였다. OD600이 3-4가 될 때까지 배양을 진행한 후 발효기에 접종하였다. pH는 28% (v/v) 암모니아 수용액을 이용하여 6.8로 유지하였고 온도는 30 oC를 유지하였다. 용존산소도 (DO) 값은 2 L/min의 공기, 자동으로 1,000 r.p.m.까지 조절 가능한 교반 속도, 그리고 증가하는 산소 유량을 통하여 40%로 유지되었다. 영양 공급은 pH-stat 전략으로 진행되었는데, pH 값이 카로티노이드의 경우 7, 비올라세인 유도체의 경우 6.85가 넘었을 때 자동으로 피드가 유입되도록 설정되었다. 카로티노이드 생산을 위한 피드 용액은 1 L 당 다음의 성분을 가지고 있다: 800 g glucose 또는 817 g glycerol, 6 mL trace metal solution 및 12 g MgSO4.H2O. 비올라세인 유도체 생산을 위한 피드 용액은 1 L 당 다음의 성분을 가지고 있다: 650 g glucose 또는 800 g glycerol, 6 mL trace metal solution, 85 g (NH4)2SO4 및 8 g MgSO4.H2O. 접종 후 OD600 값이 20-30에 도달하였을 때 1 mM IPTG를 이용하여 외래 단백질의 발현이 유도되었다.
각 색소에 관해 가장 뛰어난 생산능을 나타낸 재조합 대장균의 유가식 배양하여 얻은 각 색소의 농도는 다음과 같다:
i) astaxanthin 생산 재조합 미생물 ATX68 (pWAS, rffD, rfaD 발현 억제): 322 mg/L (도8a);
ii) β생산 재조합 미생물 BTC1 (pWAS, rffD, rfaD 발현 억제): 343 mg/L (도8b);
iii) zeaxanthin 생산 재조합 미생물 ZEA20 (pWAS, rffD, rfaD 발현 억제): 218 mg/L (도8c);
iv) proviolacein 생산 재조합 미생물 PVIO (pWAS, rfaI 발현 억제 & cav1 과발현): 1.3 g/L (도8d);
v) prodeoxyviolacein 생산 재조합 미생물 PDVIO (pWAS, rfaI 발현 억제): 0.855 g/L (도8e);
vi) violacein 생산 재조합 미생물 VIO (pWAS, rfaI 발현 억제 & cav1 과발현): 6.69 g/L의 violacein 생산 (1.39 g/L의 deoxyviolacein도 함께 생산) (도8f);
vii) deoxyviolacein 생산 재조합 미생물 DVIO (pWAS, rfaI 발현 억제 & cav1 과발현): 11.3 g/L (도8g).
이렇게 본 발명을 통하여 개발한 대장균 균주를 이용하여 일곱 가지 소수성 색소를 모두 고농도로 생산할 수 있었다는 점은 본 발명이 전반적인 소수성 물질의 고효율 생산에 효과적이라는 것을 보여준다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant microorganism with improved production capacity of hydrophobic compounds and membrane engineering method for the production thereof <130> P21-B206 <150> KR 2020-0144521 <151> 2020-11-02 <160> 49 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTac15K plasmid primer-Forward <400> 1 cttggctgtt ttggcggatg 20 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTac15K plasmid primer-Reverse <400> 2 tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctc 29 <210> 3 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crtE primer-Forward <400> 3 ataacaattt cacacaggaa acacgytcmg cggaaagrag catcgwccat gtatccgttt 60 ataaggaca 69 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crtE primer-Reverse <400> 4 ttaactgacg gcagcgagtt 20 <210> 5 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crtB primer-Forward <400> 5 cgctgccgtc agttaaarcc ttgttcaaag gmsyatctag gatgaataat 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20 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vioAB primer-Forward <400> 20 cacacaggaa acagaccaat gaagcattct tccgatatct gc 42 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vioAB mid primer-Reverse <400> 21 gccaggcttc ggaatcgaat g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vioAB mid primer-Forward <400> 22 cattcgattc cgaagcctgg c 21 <210> 23 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vioAB primer-Reverse <400> 23 ggtaccgagc tcgaattcca ttatcaggcc tctctagaaa gctttcc 47 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vioC primer-Forward <400> 24 cacacaggaa acagaccaat gaaaagagca atcatagtcg g 41 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vioC primer-Reverse <400> 25 ggtaccgagc tcgaattcca ttatcagttg accctcccta tcttg 45 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vioD primer-Forward <400> 26 cacacaggaa acagaccaat gaagattctg gtcatcggc 39 <210> 27 <211> 42 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cactctgttg 240 ggtgtccccc ttgctttgct ttggggattc ctgttcgcgt gtatctcttt ttgccatatt 300 tgggctgtcg ttccatgtat taaatcgtac ttaattgaga ttcaatgtat ctctcatatt 360 tatagtcttt gtatccgcac gttctgtaat cccctttttg cggccttggg gcaggtgtgc 420 tcaagtatta aggttgtact tcgtaaggag gtctaa 456 <210> 39 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plsB primer-Forward <400> 39 ctagagtcga cctgcagttt cacacaggaa acagaccatg tccggctggc cacga 55 <210> 40 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plsB primer-Reverse <400> 40 tctgtttcct gtgtgaaatt acccttcgcc ctgcgtc 37 <210> 41 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plsC primer-Forward <400> 41 gaagggtaat ttcacacagg aaacagacca tgctatatat ctttcgtctt attattacc 59 <210> 42 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plsC primer 1-Reverse <400> 42 ccgccaaaac agccaagctt ttaaactttt ccggcggc 38 <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sRNA primer 1-Forward <400> 43 cactagatct caaatgtgct ggaattctaa caccgtgcgt g 41 <210> 44 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sRNA primer 1-Reverse <400> 44 ccttataaat caaacatgtg cggcgaattg ggtacctata aac 43 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sRNA primer 2-Forward <400> 45 gcacatgttt gatttataag gg 22 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sRNA primer 2-Reverse <400> 46 cagcacattt gagatctagt gg 22 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptrc primer-Forward <400> 47 atgtgacagc ttatcgcatg cttgacaatt aatcatccgg 40 <210> 48 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plsC primer-Reverse <400> 48 cctgggttta cctaggcatg cttaaacttt tccggcggct tc 42 <210> 49 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cav1 primer-Reverse <400> 49 cctgggttta cctaggcatg cttatatttc tttctgcaag ttg 43

Claims (18)

  1. 세포 형태 관련 유전자, 및 세포 외막 소포체 관련 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자가 억제되어 있고; 및/또는
    세포 내막 소포체 관련 유전자가 과발현 또는 도입되어 있어,
    다음 중 어느 하나 이상의 특징을 가지도록 엔지니어링된 재조합 미생물:
    i) 세포막 면적 증가;
    ii) 세포 외막 소포체 형성 및 분비 증가; 및
    iii) 세포 내막 소포체 형성 증가.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 형태 관련 유전자는 세포 분열 유전자, 세포벽 합성 유전자 및 세포벽 유지 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포 형태 관련 유전자는
    rodZ (Cytoskeleton protein), ftsA (Cell division protein), ftsB (Cell division protein), ftsI (Peptidoglycan D,D-transpeptidase), ftsL (Cell division protein), ftsQ (Cell division protein), ftsW (Probable peptidoglycan glycosyltransferase), ftsZ (Cell division protein), minD (Septum site-determining protein), mrdA (Peptidoglycan D,D-transpeptidase), mrdB (Peptidoglycan glycosyltransferase), mreB (Cell shape-determining protein), mreC (Cell shape-determining protein), zipA (Cell division protein), murE (UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate--2,6-diaminopimelate ligase), pbpC (Penicillin-binding protein 1C) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는 세포 분열에 관여하는 유전자, 및 세포골격 또는 세포벽의 합성 또는 유지에 관여하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포 외막 소포체 관련 유전자는
    rseA (Anti-sigma-E factor), rseB (Sigma-E factor regulatory protein), rffD (UDP-N-acetyl-D-mannosamine dehydrogenase), rffC (dTDP-fucosamine acetyltransferase), rffA (dTDP-4-amino-4,6-dideoxygalactose transaminase), ompR (DNA-binding dual transcriptional regulator), gmhB (D-glycero-beta-D-manno-heptose-1,7-bisphosphate 7-phosphatase), lpxL (Lipid A biosynthesis lauroyltransferase), lpxM (Lipid A biosynthesis myristoyltransferase), ompA (Outer membrane protein), ompC (Outer membrane protein), rfaB (Lipopolysaccharide 1,6-galactosyltransferase), rfaC (Lipopolysaccharide heptosyltransferase 1), rfaD (ADP-L-glycero-D-manno-heptose-6-epimerase), rfaE (Bifunctional protein HldE), rfaG (Lipopolysaccharide core biosynthesis protein), rfaI (Lipopolysaccharide 1,3-galactosyltransferase), rfaJ (Lipopolysaccharide 1,2-glucosyltransferase), rfaK (Lipopolysaccharide 1,2-N-acetylglucosaminetransferase), rfaP (Lipopolysaccharide core heptose(I) kinase), rfaQ (Lipopolysaccharide core heptosyltransferase), rfaY (Lipopolysaccharide core heptose(II) kinase), rfbA (Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase 1), rffH (Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase 2), wzxE (ECA polysaccharide chain length modulation protein), 및 pnp (Polyribonucleotide nucleotidyltransferase), tolA (colicin import membrane protein), tolB (Tol-Pal system periplasmic protein), tolC (outer membrane protein), tolR (biopolymer transport protein), nlpI (lipoprotein), nlpD (murein hydrolase activator), ompF (outer membrane pore protein), pal (peptidoglycan-associated outer membrane lipoprotein), degS (serine endoprotease), degP (serine endoprotease), tatC (sec-independent protein translocase protein), lpp (murein lipoprotein) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포 내막 소포체 관련 유전자는
    cav1 (Caveolin-1), cav2 (Caveolin-2), cav3 (Caveolin-3), EPN1 (Epsin1), CLINT1 (EpsinR), CLTC (clathrin heavy chain 1), CLTCL1 (clathrin heavy chain 2), CLTA (clathrin light chain A), CLTB (clathrin light chain B), AP180, AP2, almgs (1,2-diacylglycerol 3-glucosyltransferase), aldgs (1,2-diacylglycerol-3-glucose (1-2)-glucosyltransferase producing diglucosyldiacylglycerol) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 세포막 지질 합성효소 유전자의 발현이 향상된 것을 추가적인 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 미생물은
    대장균, 리조비움 (Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아 (Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라 (Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터 (Aggregatibacter), 잔토모나스 (Xanthomonas), 비브리오 (Vibrio), 슈도모나스 (Pseudomonas), 아조토박터 (Azotobacter), 애시네토박터 (Acinetobacter), 랄스토니아 (Ralstonia), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 로도박터 (Rhodobacter), 자이모모나스 (Zymomonas), 바실러스 (Bacillus), 스테필로코커스 (Staphylococcus), 락토코커스 (Lactococcus), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 클로스트리디움 (Clostridium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 사이아노박테리움 (Cyanobacterium) 및 사이클로박테리움 (Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 i) mrdB, rffD, rfaD 및 rfaI로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 억제되어 있고; 및/또는
    ii) cav1 유전자의 도입 또는 과발현된 것을 특징으로 하는 대장균인 재조합 미생물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 소수성 물질의 생산용 재조합 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 소수성 물질은 세포막에 축적되는 것을 특징으로 하는 소수성 물질의 생산용 재조합 미생물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 소수성 물질은 천연 색소, 항산화물질, 항생제, 화장품 첨가물, 항암제, 식품 첨가제 및 영양 보조제 등으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 소수성 물질의 생산용 재조합 미생물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 소수성 물질은 astaxanthin, beta-carotene, zeaxanthin, proviolacein, prodeoxyviolacein, deoxyviolacein 및 violacein으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 소수성 물질의 생산용 재조합 미생물.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 소수성 물질은 카르티노이드계 색소이고,
    상기 재조합 미생물은 rffD 및 rfaD 유전자의 발현이 억제된 것을 특징으로 하는 소수성 물질의 생산용 재조합 미생물.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 소수성 물질은 비올라세인 또는 이의 유사체이고,
    상기 재조합 미생물은 rfaI 유전자의 발현이 억제된 것을 특징으로 하는 소수성 물질의 생산용 재조합 미생물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 cav1 유전자가 도입 또는 과발현된 것을 특징으로 하는 소수성 물질의 생산용 재조합 미생물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하여 소수성 물질을 생성시키는 단계; 및
    상기 생성된 소수성 물질을 수득하는 단계를 포함하는 소수성 물질의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 배양은 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 소수성 물질의 제조방법.
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