CN113005162A - 酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法和用于该方法的转化体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法和用于该方法的转化体，一种酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：S1、分别构建重组表达载体pET15b‑nadV、重组表达载体pET28a(+)‑Amn和重组表达载体pET28a(+)‑Prs，转化到大肠杆菌中，获得重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs；S2、分别发酵表达重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs，获得湿菌体；S3、分别对三种湿菌体进行破碎处理，获得三种粗酶液；S4、将三种粗酶液与烟酰胺、ATP、AMP、MgCl2、KCl和Tris‑HCl缓冲液混合，搅拌均匀后进行反应，控制反应温度为30‑50℃，维持pH值为6.5‑8.5，反应2‑8小时获得烟酰胺单核苷酸粗产品。本发明不使用价格较高且来源受限的底物作为起始原料，价格低廉、绿色环保，适宜大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，具体涉及酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法和用于该方法的转化体。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide,NMN)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，辅酶I)补救合成途径的关键前体之一，在哺乳动物体内，由烟酰胺(Nam)在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的催化下生产。而细胞外的NMN需要去磷酸化转为烟酰胺核苷(NR)后才能进入细胞内，进入细胞后在烟酰胺核苷激酶1(NRK)的磷酸化作用下再次转为NMN，随后与ATP结合生成NAD+。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥作用，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)来调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。NMN作为NAD+补救途径的关键前体，具有抗氧化、减少氧化应激的作用，在一些具体疾病的治疗，如脑卒中、心脏缺血再灌注、阿尔茨海默病、帕金森病、急性肾损伤、视网膜退行性疾病、2型糖尿病等中也有良好表现。特别在抗衰方面，NMN可以减缓生物体的生理衰退，增强能量代谢，延长寿命。鉴于NMN是人体内源性物质，安全性较高，且热稳定性较好，因此NMN作为活性物质在功能食品领域开发中具有广阔前景。
目前NMN的生产方法主要有三种：固态酵母发酵法、化学合成法、生物酶催化法。其中：(1)固态酵母发酵工艺复杂、产量较低，生产的产品价格昂贵。(2)化学合成法多以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到，生产效率低，产品纯度低，且需要使用大量有机溶剂，对环境破坏严重。(3)生物酶催化法：是目前公认最为绿色环保以及经济高效的NMN制备方式，已被广泛应用于各领域。
NMN的生物酶法制备主要有两条途径。一是以烟酰胺核糖(NR)为起始原料，在ATP的存在下，由烟酰胺核糖激酶(NRK)催化生成NMN。目前报道的该路线NMN产量均较低，且底物原料昂贵。二是以D-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶(RK)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(nadV/Nampt)以及磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)的作用下，催化底物生产NMN。此路线转化率低、中间产物多、提取收率低，最终导致生产成本较高。
为了克服上述原料昂贵、成本高、产量低以及对环境造成污染等一系列问题，本发明提供了一种新的生物酶催化法来制备烟酰胺单核苷酸。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法和用于该方法的转化体，解决现有制备烟酰胺单核苷酸成本高、产量低、以及对环境不友好的问题。
此外，本发明还提供通过上述方法获得的转化体。
本发明通过下述技术方案实现：
酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
S1、分别构建重组表达载体pET15b-nadV、重组表达载体pET28a(+)-Amn和重组表达载体pET28a(+)-Prs，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs；
S2、分别发酵表达重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs，获得湿菌体；
S3、分别对三种湿菌体进行破碎处理，获得三种粗酶液；
S4、将三种粗酶液与烟酰胺、ATP、AMP、MgCl2、KCl和Tris-HCl缓冲液混合构成生物转化体系，搅拌均匀后进行反应，控制反应温度为30-50℃，维持pH值为6.5-8.5，反应l-8h后获得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液。
本发明在大肠杆菌中过表达烟酰胺磷酸核糖转移酶(nadV)，磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)，AMP核苷酶(Amn)，用于酶法催化反应，制得烟酰胺单核苷酸。
本发明所述方法不使用价格较高且来源受限的PRPP作为底物，具有价格低廉、绿色环保无公害、适宜大规模工业化生产。
进一步地，步骤S1中，重组工程菌nadV的构建过程如下：
基于烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因序列进行全序列人工合成，合成的产物经限制性内切酶Ndel和Xhol酶切后与经同样限制性内切酶Ndel和Xhol酶切的载体pET-15b连接获得质粒pET15b-nadV，将质粒pET15b-nadV转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，经氨苄抗性筛选，获得具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的菌株即为重组工程菌nadV。
进一步地，步骤S1中，重组工程菌Amn的构建过程如下：
基于AMP核苷酶的基因序列进行全序列人工合成，合成的产物经限制性内切酶Ndel和Xhol酶切后与经同样限制性内切酶Ndel和Xhol酶切的载体pET-28a(+)连接，获得质粒pET-28a(+)-Amn，质粒pET28a(+)-Amn转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，经卡那抗性筛选获得具有AMP核苷酶活性的菌株即为重组工程菌Amn。
进一步地，步骤S1中，重组工程菌Prs的构建过程如下：
基于磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因序列进行全序列人工合成，合成的产物经限制性内切酶Ndel和Xhol酶切后与经同样限制性内切酶Ndel和Xhol酶切的载体pET-28a(+)连接，获得质粒pET-28a(+)-Prs，质粒pET28a(+)-Prs转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，经卡那抗性筛选获得具有磷酸核糖焦磷酸合成酶活性的菌株即为重组工程菌Prs。
进一步地，步骤S2中，
在无菌环境下移种重组工程菌于一级培养基中，37℃、220rpm培养7h，OD600达到3～4后转接到二级培养基中，37℃、220rpm培养4～5h，再接入发酵罐中进行发酵培养，在发酵培养过程中，pH和溶氧上升时，补充补料培养基，继续培养至菌浓度OD600为30时开始降温至16℃～20℃，加入IPTG诱导培养后放罐，离心获得湿菌体。
进一步地，一级培养基采用LB培养基；二级培养基采用TB培养基。
进一步地，发酵培养采用发酵培养基，发酵培养基的配方如下：
酵母浸膏5.6g/L，蛋白胨12g/L，甘油10g/L，三水合磷酸氢二钾4g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，七水合硫酸镁0.49g/L，柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L；
补料培养基的配方如下：
酵母浸粉70g/L，蛋白胨30g/L，甘油400g/L。
进一步地，步骤S3中，破碎处理用超声波粉碎机或者高压匀浆机进行破胞处理。
进一步地，步骤S4中，生物转化体系中所含物质浓度如下：
烟酰胺磷酸核糖转移酶1-100g/L、磷酸核糖焦磷酸合成酶1-100g/L、AMP核苷酶1-100g/L、l-120mM的烟酰胺、1-75mM的ATP、1-l00mM的AMP、l-30mM的MgCl2、l-20mM的KCl以及50-100mM的Tris-HCl缓冲液。
酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法生产的转化体，所述转化体包括重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs；以及分别由重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs经过发酵、破碎获得的粗酶液。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明所述方法不使用价格较高且来源受限的底物作为起始原料，具有价格低廉、绿色环保无公害、适宜大规模工业化生产的特点。
2、本发明提供了一种利用生物酶催化技术制备NMN的新方法，该方法既克服了化学合成法和酵母菌发酵法的缺陷，又缩短了制备周期，保证了NMN的生产成本。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例和附图的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明NMN合成途径；
图2为实施例1的NMN液相色谱图；
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
以下实施例的重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs、粗酶液的制备过程相同，具体地：
1)重组工程菌nadV(烟酰胺磷酸核糖转移酶)的制备：
根据GenBank公布的烟酰胺磷酸核糖转移酶(nadV)的基因序列进行全序列人工合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。合成的产物经限制性内切酶Ndel和Xhol酶切后与经同样限制性内切酶Ndel和Xhol酶切的载体pET-15b连接，转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，在Luria broth(LB)平板上(含氨苄青霉素50mg/L)倒置培养过夜，挑单菌落进行测序验证，得到基因序列完全正确的重组子，成功构建表达载体pET15b-nadV。将测序正确的单菌落接种至LB试管中，过夜培养后转接新的LB培养基中，添加IPTG，于16℃诱导培养12小时，通过SDS-PAGE检测蛋白表达量，结果nadV蛋白可溶性表达，即获得工程菌nadV。
重组工程菌Amn(AMP核苷酶)的制备：
根据GenBank公布的腺苷单磷酸核苷酶(Amn)的基因序列进行全序列人工合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。合成的产物经限制性内切酶Ndel和Xhol酶切后与经同样限制性内切酶Ndel和Xhol酶切的载体pET-28a(+)连接，转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，在Luria broth(LB)平板上(含卡那霉素50mg/L)倒置培养过夜，挑单菌落进行测序验证，得到基因序列完全正确的重组子，成功构建表达载体pET28a-Amn。将测序正确的单菌落接种至LB试管中，过夜培养后转接新的LB培养基中，添加IPTG，于16℃诱导培养12小时，通过SDS-PAGE检测蛋白表达量，结果Amn蛋白可溶性表达，即获得工程菌Amn。
重组工程菌Prs(磷酸核糖焦磷酸合成酶)的制备：
根据GenBank公布的磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)的基因序列进行全序列人工合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。合成的产物经限制性内切酶Ndel和Xhol酶切后与经同样限制性内切酶Ndel和Xhol酶切的载体pET-28a(+)连接，转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，在Luria broth(LB)平板上(含卡那霉素50mg/L)倒置培养过夜，挑单菌落进行测序验证，得到基因序列完全正确的重组子，成功构建表达载体pET28a-Prs。将测序正确的单菌落接种至LB试管中，过夜培养后转接新的LB培养基中，添加IPTG，于16℃诱导培养12小时，通过SDS-PAGE检测蛋白表达量，结果Prs蛋白可溶性表达，即获得工程菌Prs。
2)分别发酵表达重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs，获得湿菌体：
工程菌培养：在超净工作台下分别移种重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs于一级培养基(LB)中，37℃、220rpm培养7h，OD600达到3～4后转接到二级培养基(TB)中，37℃、220rpm培养4～5h；按照3.2％的接种量接入5L发酵罐中37℃培养，pH和溶氧上升时开启补料，菌浓度OD600为30时开始降温至16℃～20℃，加入0.1mM的IPTG诱导培养12小时放罐，离心收集菌体待用。
3)粗酶液的制备
按照不同标准添加量分别称取3种湿菌体，加入0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH＝7.0)，重悬菌体，用超声波粉碎机或者高压匀浆机进行破胞处理即为粗酶液，置于4℃保存备用。
实施例1：
生物转化：向反应釜中加入底物溶液，含烟酰胺磷酸核糖转移酶1g/L，磷酸核糖焦磷酸合成酶1g/L、AMP核苷酶1g/L，lmM的烟酰胺、1mM的ATP、1mM的AMP、lmM的MgCl2、lmM的KCl以及50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0)。搅拌均匀后进行反应，反应过程中控制转速50rpm，控制反应温度为30℃，维持pH值为6.5-7.0。反应2h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN0.75mM)，后期再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品，合成路径如图1所示，NMN液相色谱图如图2所示。
实施例2：
生物转化：向反应釜中加入底物溶液，含烟酰胺磷酸核糖转移酶30g/L，磷酸核糖焦磷酸合成酶30g/L、AMP核苷酶30g/L，40mM的烟酰胺、20mM的ATP、20mM的AMP、10mM的MgCl2、10mM的KCl以及70mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0)。搅拌均匀后进行反应，反应过程中控制转速50rpm，控制反应温度为35℃，维持pH值为7.0-7.5。反应3h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN15mM)，后期再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例3：
生物转化：向反应釜中加入底物溶液，含烟酰胺磷酸核糖转移酶65g/L，磷酸核糖焦磷酸合成酶65g/L、AMP核苷酶65g/L，100mM的烟酰胺、50mM的ATP、70mM的AMP、20mM的MgCl2、20mM的KCl以及70mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0)。搅拌均匀后进行反应，反应过程中控制转速50rpm，控制反应温度为40℃，维持pH值为7.5-8.0。反应5h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN21mM)，后期再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例4：
生物转化：向反应釜中加入底物溶液，含烟酰胺磷酸核糖转移酶100g/L，磷酸核糖焦磷酸合成酶100g/L、AMP核苷酶100g/L，120mM的烟酰胺、75mM的ATP、100mM的AMP、30mM的MgCl2、20mM的KCl以及70mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0)。搅拌均匀后进行反应，反应过程中控制转速50rpm，控制反应温度为50℃，维持pH值为8.0-8.5。反应8h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN38mM)，后期再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
采用HPLC法检测实施例1-实施例4制备的烟酰胺单核苷酸，检测方法如下：
1)、KH2PO4溶液的配制：准确称取KH2PO4 6.80g于1000mL容量瓶中，用纯水定容至1000mL；
2)、标样配制：分别称取标品NMN、ATP、AMP、ADP、烟酰胺0.0050g于不同的10mL容量瓶，用水溶解并稀释至刻度；
3)、色谱条件：色谱柱Inertsil ODS-3.250mm*4.6mm*5um；流动相A：KH2PO4溶液；流动相B：乙腈；检测波长：210nm；进样量：10uL；样温：25℃，流速：1.0mL/min。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分别构建重组表达载体pET15b-nadV、重组表达载体pET28a(+)-Amn和重组表达载体pET28a(+)-Prs，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs；
S2、分别发酵表达重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs，获得湿菌体；
S3、分别对三种湿菌体进行破碎处理，获得三种粗酶液；
S4、将三种粗酶液与烟酰胺、ATP、AMP、MgCl2、KCl和Tris-HCl缓冲液混合构成生物转化体系，搅拌均匀后进行反应，控制反应温度为30-50℃，维持pH值为6.5-8.5，反应l-8h后获得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液。
2.根据权利要求1所述的酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，步骤S1中，重组工程菌nadV的构建过程如下：
基于烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因序列进行全序列人工合成，合成的产物经限制性内切酶Ndel和Xhol酶切后与经同样限制性内切酶Ndel和Xhol酶切的载体pET-15b连接获得质粒pET15b-nadV，将质粒pET15b-nadV转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，经氨苄抗性筛选，获得具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的菌株即为重组工程菌nadV。
3.根据权利要求1所述的酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，步骤S1中，重组工程菌Amn的构建过程如下：
基于AMP核苷酶的基因序列进行全序列人工合成，合成的产物经限制性内切酶Ndel和Xhol酶切后与经同样限制性内切酶Ndel和Xhol酶切的载体pET-28a(+)连接，获得质粒pET-28a(+)-Amn，质粒pET28a(+)-Amn转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，经卡那抗性筛选获得具有AMP核苷酶活性的菌株即为重组工程菌Amn。
4.根据权利要求1所述的酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，步骤S1中，重组工程菌Prs的构建过程如下：
基于磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因序列进行全序列人工合成，合成的产物经限制性内切酶Ndel和Xhol酶切后与经同样限制性内切酶Ndel和Xhol酶切的载体pET-28a(+)连接，获得质粒pET-28a(+)-Prs，质粒pET28a(+)-Prs转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，经卡那抗性筛选获得具有磷酸核糖焦磷酸合成酶活性的菌株即为重组工程菌Prs。
5.根据权利要求1所述的酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，步骤S2中，
在无菌环境下移种重组工程菌于一级培养基中，37℃、220rpm培养7h，OD600达到3～4后转接到二级培养基中，37℃、220rpm培养4～5h，再接入发酵罐中进行发酵培养，在发酵培养过程中，pH和溶氧上升时，补充补料培养基，继续培养至菌浓度OD600为30时开始降温至16℃～20℃，加入IPTG诱导培养后放罐，离心获得湿菌体。
6.根据权利要求5所述的酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，一级培养基采用LB培养基；二级培养基采用TB培养基。
7.根据权利要求5所述的酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，发酵培养采用发酵培养基，发酵培养基的配方如下：
酵母浸膏5.6g/L，蛋白胨12g/L，甘油10g/L，三水合磷酸氢二钾4g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，七水合硫酸镁0.49g/L，柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L；
补料培养基的配方如下：
酵母浸粉70g/L，蛋白胨30g/L，甘油400g/L。
8.根据权利要求1所述的酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，步骤S3中，破碎处理用超声波粉碎机或者高压匀浆机进行破胞处理。
9.根据权利要求1所述的酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，步骤S4中，生物转化体系中所含物质浓度如下：
烟酰胺磷酸核糖转移酶1-100g/L、磷酸核糖焦磷酸合成酶1-100g/L、AMP核苷酶1-100g/L、l-120mM的烟酰胺、1-75mM的ATP、1-l00mM的AMP、l-30mM的MgCl2、l-20mM的KCl以及50-100mM的Tris-HCl缓冲液。
10.如权利要求1-9任一项所述的酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法生产的转化体，其特征在于，所述转化体包括重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs；以及分别由重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs经过发酵、破碎获得的粗酶液。
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