CN114317515A - 一种以改性硅藻土为载体的固定化全细胞催化制备β-烟酰胺单核苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以改性硅藻土为载体的固定化全细胞催化制备β‑烟酰胺单核苷酸的方法。将经过酸、碱处理后的改性硅藻土作为固定化载体，以分别含有多磷酸激酶(Ppk)、核酮糖‑5‑磷酸异构酶(RKI1)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prps)以及烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的菌株为对象来制备固定化细胞，再以D‑核糖、ATP、烟酰胺为原料，加入多磷酸激酶、核酮糖‑5‑磷酸异构酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶以及烟酰胺磷酸核糖转移酶四种酶的组合用于催化反应合成β‑烟酰胺单核苷酸(β‑NMN)，转化率高。不仅提高了酶法合成β‑NMN的效率和底物转化率，而且其中的固定化细胞可以多次重复使用。

Description

一种以改性硅藻土为载体的固定化全细胞催化制备β-烟酰胺 单核苷酸的方法

技术领域

本发明涉及细胞技术与生物催化领域，尤其涉及一种以改性硅藻土为载体的固定化全细胞催化制备β-烟酰胺单核苷酸的方法。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(β-NMN)是磷酸核糖焦磷酸、烟酰胺经过烟酰胺磷酸核糖转移酶催化后得到的产物，在体内有着重要的作用，也是NAD⁺的关键前体之一。研究发现，当小鼠体内NAD⁺含量增加时，大龄小鼠的部分组织和肌肉的衰老迹象被逆转，说明NAD⁺在延缓衰老、维持肌肉活性等方面具有一定功效。但由于NAD⁺分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，在体内主要依赖于细胞的自我合成，而且合成量很低。但随着对NAD⁺前体小分子物质β-NMN的研究发现，服用β-NMN可以有效提高体内NAD⁺的含量，从而起到抑制衰老引起的新陈代谢、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌以及延缓衰老的目的。

目前合成β-NMN的方法主要有化学合成法和生物转化法。在化学合成过程中容易产生手性化合物以及溶剂中残留的小分子有机物，对人体健康和环境存在潜在危害，并且原料成本较高。而生物转化法相比前者更加绿色环保，固定化全细胞的催化效率快、易制备还可以多次循环使用，有效的控制成本。因此，生物转化制备β-NMN已经成为各大医药公司竞争的研究热点。

CN108949865A公开了一种一步酶法催化制备β-NMN的方法，利用分子生物学和基因工程技术构建一株包含磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prps)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)双酶的重组基因工程菌，再对该菌进行固定化处理后进行催化反应。此法虽然催化反应步骤较少，但在构建工程菌时实验周期较长、基因克隆难度较大、重组基因全表达率较低，而制备固定化全细胞时使用的氨基型树脂成本较高，且树脂的回收、活化过程较为繁琐，需要用到酸、碱及有机溶剂进行清洗置换。而硅藻土不仅价格低廉，回收和活化操作简便，而且更加绿色环保，比较适用于产业化生产。

CN107889505A公开了一种固定化细胞制备烟酰胺单核苷酸的方法，该方法以环氧型LX-3000、大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯、玻璃珠等材料作为吸附载体，分别与烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(Hgprt)、黄嘌呤氧化酶(XOD)与磷酸二氢钾溶液制备的含酶细胞悬液按比例混合后搅拌吸附2h，过滤后即得固定化细胞。将其与烟酰胺、焦磷酸、肌苷酸钠分步混合反应后即可得到目标产物烟酰胺单核苷酸。此法的优点在于避免使用PRPP,使得成本相比于一步酶法合成β-NMN有所降低，但是在制备固定化细胞时单纯依靠吸附载体与含酶细胞之间的共价吸附作用进行交联，固定化细胞的机械强度较差、易受环境影响而脱落，导致重复利用率降低，进而影响转化效率。而硅藻土和加入的几种交联剂会与含酶细胞之间形成紧密的网络结构，从而将含酶细胞固定在载体上，不仅提高了固定化细胞的机械强度，还增加了循环使用次数，更适用于产业化生产。

根据近期文献资料表明，采用固定化全细胞催化法制备β-烟酰胺单核苷酸仍然是β-NMN合成领域最受关注的研究热点之一。结合诸多β-NMN生产工艺来看，大都先对催化反应的微生物进行基因层面的改造，然后再经常规的固定化操作后进行催化反应。但是在β-NMN合成领域除了对微生物的转化性能进行集中性研究以外，很少有人对固定化细胞的易制备性，工艺的可行性、便捷性以及绿色环保等方面进行更深入的探究。事实上合理的固定化工艺不仅可以提高微生物的催化速率，还可以增加固定化细胞的催化次数，延长使用寿命，显著降低生产成本。

发明内容

发明所要解决的技术问题是针对目前化学合成法存在的环境危害大、生产成本高、制备流程繁复等缺陷，以及固定化全细胞整体机械强度差、循环使用次数较少、吸附载体成本高等问题。开发一种绿色环保、生产成本较低且易于操作的β-NMN制备方法，有效降低产业化难度，提高产业化的可操作性和底物的转化率。

为实现上述目的，本发明提供一种以改性硅藻土为载体的固定化全细胞催化制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.发酵液预处理：将各菌株单独发酵所得到的发酵液离心后收集下层菌泥，用适量去离子水洗涤菌泥，离心除去菌泥中残留的发酵液和其他杂质，离心后分别将四种湿菌泥与NaCl溶液按比例混合均匀，制成菌悬液；

S2.细胞固定化：在所得四种菌悬液中分别加入交联剂搅拌交联30～120min，再加入改性硅藻土进行吸附处理，静置60～180min后用二价金属离子溶液洗涤、离心2～3次，即可得到四种固定化细胞；

所述改性硅藻土的制备：配制盐酸和氢氧化钠溶液，在盐酸溶液中加入硅藻土，浸泡刻蚀后用超纯水冲洗至滤液呈中性，再将酸改性后的硅藻土与氢氧化钠溶液混合刻蚀，冲洗，经高温烘干后过筛即得改性硅藻土；

S3.酶催化反应：向含有D-核糖、烟酰胺、ATP、焦磷酸钾、MgSO₄、ZnSO₄以及BindingBuffer缓冲液，pH为6.0-7.5的底物溶液中添加上述制备好的四种固定化细胞，搅拌至质地均匀，并在整个反应过程中使搅拌速度维持在70rpm，控制反应体系的温度在30-40℃，保持pH在6.0-7.5之间，反应3-8h后得到烟酰胺单核苷酸粗品。

进一步，还包括将烟酰胺单核苷酸粗品过滤、浓缩、脱色、纯化、真空干燥得到烟酰胺单核苷酸纯品。

进一步，S1中的发酵液的制备包括：将菌种分别接种到发酵液中进行发酵培养16-20h，降低发酵环境的温度到24-26℃后继续培养22-26h得到发酵液；所述菌种为施氏假单胞菌、产黄青霉、解淀粉芽孢杆菌以及毕氏酵母；

优选的，所述菌种接种前需要活化，活化步骤为：将菌株分别按照梯度稀释法接入含有卡那霉素的平板培养基中培养，再挑取单菌落接种到新的培养基中摇瓶培养，再接种后摇瓶培养，重复接种摇瓶培养1-3次；

更优选的，发酵培养的条件为30-40℃、pH6.0-7.5。

进一步，所述S1步骤中，菌种或菌株的接种量均为1％-5％，优选3％；

任选的，所述卡那霉素的含量为15-25mg/L；

任选的，所述发酵培养的条件为35℃和7.0。

进一步，所述S1步骤中，NaCl溶液的浓度为0.5～1％；湿菌泥与NaCl溶液的质量比例为1：1.5。

进一步，所述S2步骤中，交联剂包括聚乙烯亚胺、双偶氮联苯胺、环氧聚胺、聚丙烯酰胺、戊二醛、甲醛、丁二醛、乙醛中的至少一种；交联剂的用量为12～15mL/100g，优选13mL/100g；

任选的，改性硅藻土的加量为，菌泥的干物质含量与改性硅藻土的质量比为1g：(0.5-1.5)g；优选的，质量比为1g：0.5g；

任选的，所述二价金属离子溶液选自Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ca²⁺的至少一种；浓度为1～20mmol/L。

进一步，所述S2步骤改性硅藻土的制备中，盐酸溶液的浓度为5-20％，优选15％；氢氧化钠溶液浓度为5-15％，优选10％；

任选的，硅藻土与盐酸溶液的投料比例为1-5g:5-15mL，优选1g:5mL；

任选的，酸改性后的硅藻土与氢氧化钠溶液投料比例为3-10g:10-25mL，优选4g：12mL；

任选的，刻蚀的时间为2-5h，优选3h；

任选的，高温烘干的温度为110℃。

进一步，所述S3步骤中，底物溶液的配方为为，10-110mMD-核糖、1-140mM烟酰胺、1-70mM ATP、1-50mM焦磷酸钾、1-40mM MgSO₄、1-35mM ZnSO₄，pH为6.0-7.5；

任选的，固定化细胞的添加量为每升底物溶液中含有多磷酸激酶1-100g、核酮糖-5-磷酸异构酶1-100g、磷酸核糖焦磷酸合成酶1-100g和烟酰胺磷酸核糖转移酶1-100g；

任选的，反应的条件为35℃反应6h。

本发明的有益效果：

(1)本发明使用改性硅藻土作为固定化载体来制备微生物催化剂，再以此催化β-NMN合成反应，该生物催化剂具有催化效率高、催化工艺相对简单等优点。

(2)本发明将硅藻土进行酸、碱预处理，得到改性硅藻土。相比其他改性方法，本发明所采用的酸碱处理法操作更简单、更易制备，在现有的酸碱改性方法中，大多是酸或碱与有机溶剂、金属氧化物搭配使用来改性载体，酸与碱搭配使用目前未见，从电镜图可知在经过酸碱工序处理后硅藻土的表面结构发生明显的表观特征变化，在固定化过程中其吸附力显著增强，固体酶循环使用次数增加，以改性硅藻土为吸附载体制备的固定化细胞的机械强度大、不易被微生物降解、细胞吸附牢固不易脱落、可实现多次连续循环使用、显著降低生产成本。

(3)本发明酶催化底物中添加了焦磷酸钾、硫酸锌、Binding Buffer。现有技术在NMN转化实验中普遍添加六偏磷酸钠，本发明以焦磷酸钾取代之，焦磷酸根与偏磷酸根水解都会产生反应所需的磷酸根，但钾离子对酶活有良好的促进作用；硫酸根离子对磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性基团有稳定作用，可防止其结构因反应环境变化而改变，具有维持酶活性的作用，与添加现有技术普遍添加的氯化锌相比更有利于反应进行；Binding Buffer对核酸及小分子蛋白具有亲和性，可以除去反应体系中因细胞破损产生的内容物杂质。

(4)本发明使用多磷酸激酶、核酮糖-5-磷酸异构酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶以及烟酰胺磷酸核糖转移酶四种酶的组合用于催化反应，取得了良好的协同作用，相对于只使用其中的部分酶，催化效果更显著。

(5)本发明采用固定化细胞作为生物催化剂，以廉价的D-核糖为底物生成D-5-磷酸核糖，固定化细胞在重复使用九十次后转化率仍高于80％，最后合成β-NMN时的转化率达到95％。整个催化体系的实验难度较低、整体转化效率较高、成本进一步降低。

附图说明

图1的a、b、c分别为酸处理、酸碱处理和未处理的硅藻土颗粒表面结构扫描电镜图；

图2为β-NMN标准品定位分析图；

图3为固定化细胞合成β-NMN的结果分析图；

图4为固定化细胞重复使用次数和转化率、残余酶活变化示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

所述产酶菌株为：施氏假单胞菌(产多磷酸激酶)、产黄青霉(产核酮糖-5-磷酸异构酶)、解淀粉芽孢杆菌(产磷酸核糖焦磷酸合成酶)、毕氏酵母(产烟酰胺磷酸核糖转移酶)。

实施例1：发酵液制备

(1)菌株活化：在无菌环境下，将多磷酸激酶、核酮糖-5-磷酸异构酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶以及烟酰胺磷酸核糖转移酶的生产菌株(施氏假单胞菌、产黄青霉、解淀粉芽孢杆菌以及毕氏酵母)分别按照梯度稀释法接入含有15-25mg/L卡那霉素的平板培养基(配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂12g/L、卡纳霉素15-25mg/L，pH＝7.0)中，在35℃下培养20h，进行活化。

(2)种子液制备：分别从培养好的平板中挑取任一单菌落，按照3％接种量再分别接入到装有培养基(配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂12g/L，pH＝7.0)的摇瓶内，放入摇床后按照35℃、180r/min的条件培养15h。再以3％接种量接入到种子罐中，按照相同的条件继续培养1-3代，进行菌株复壮，得到罐发酵所需种子液。

(3)发酵培养：将培养好的种子液分别按3％接种量接入发酵罐中，在温度35℃、pH7.0的条件下进行发酵培养，并在发酵全程监测发酵液OD值以及pH的变化，实时调节pH使其保持在7.0±0.5范围。当培养时间达到18h时，降低发酵罐温度到25℃，继续培养到24h时放罐。

实施例2硅藻土改性处理

酸处理：配制15％盐酸溶液与硅藻土(所用硅藻土为市售FS-500工业级，硅藻土颗粒表面结构扫描电镜图见图1的c)按照5mL:1g的比例进行混合，搅拌均匀后浸泡3h。然后进行过滤，滤饼用超纯水冲洗至滤液呈中性，并于110℃下烘干后过80目筛备用。其得到的硅藻土颗粒表面结构扫描电镜图见图1的a。

碱处理：配置10％氢氧化钠溶液，按照12mL:4g的比例与上述烘干后的滤液进行混合并浸泡3h。然后进行过滤，滤饼用超纯水冲洗至滤液呈中性，并于110℃下烘干后过100目筛，即可得到改性硅藻土。其得到的硅藻土颗粒表面结构扫描电镜图见图1的b。

从图1可以看出，经过酸碱工序处理后得到的改性硅藻土的表面结构发生明显的表观特征变化：由图1的c可知，硅藻土颗粒在未经改性处理前，颗粒边缘的包裹物质较多、表面可见孔隙较少导致整体比表面积较小。而且表面堆积和吸附的杂质较多，堵塞了表面孔隙，进一步降低其吸附性能。经过酸处理后硅藻土颗粒表面结构发生明显变化，如图1的a所示，颗粒边的包裹物质以及表面的细小杂质在酸处理过程中被有效去除，使得许多被堵塞覆盖的孔隙暴露出来，比表面积相比酸处理之前显著增大，但颗粒表面还有部分较大杂质未被去除。酸处理后的硅藻土再经碱溶液处理后其表面的微观结构进一步发生改变，由图1的b可知，最明显的变化就是残留于表面的较大杂质基本都被去除，表面的可见孔隙增多，相比未处理的硅藻土而言酸碱处理后的硅藻土表面结构发生显著变化。

硅藻土经酸碱处理改性后能从两方面提高其吸附性能，第一，无机酸能够通过蚀刻作用去除硅藻土颗粒表面及孔道中的杂质，同时H⁺还能置换孔道中原有的粒径较大的Ca^{2 +}、Mg²⁺等阳离子，因此无机酸可以有效的拓宽孔道内径并增加比表面积。第二，经氢氧化钠处理后可以去除一部分硅藻土颗粒上的Si，降低硅藻土的硅铝比，还可以捕获部分碱金属离子，使得颗粒表面带有正电荷，减少表面杂质粘连，更有利于细胞吸附。总而言之，硅藻土经酸碱处理后比表面积增加、吸附位点增加、表面活性增大、吸附性增强。因此，改性硅藻土拥有更强的吸附力。

表1硅藻土改性前后参数表

实施例3固定化细胞制备

将实施例1所得的菌种发酵液分别于5000r/min的条件下离心5min后收集下层菌泥，用适量去离子水洗涤菌泥，在相同条件下离心6min，目的是除去菌泥中残留的发酵液和其他杂质。离心后将湿菌泥与0.6％NaCl溶液按比例混合均匀，分别制成浓度为25％(v/v)的菌悬液。分别加入聚乙烯亚胺(PEI)溶液搅拌均匀后交联30-50min，再加入戊二醛溶液搅拌交联30min，最后按照菌泥的干物质含量与硅藻土的质量比为1g：0.5g加入实施例2所得的改性硅藻土进行吸附处理，静置1-2h后用8-15mM/L MgCl₂溶液洗涤15min过滤，滤饼溶于8-15mM/L MgCl₂、10-20mM/L六偏磷酸钠、5-10mM/L MnCl₂溶液中加热到50-70℃热处理15-30min后离心即可得到四种固定化细胞。

实施例4烟酰胺单核苷酸合成反应

制备底物溶液，该底物溶液的组成为10mM的D-核糖、1mM的烟酰胺、1mM的ATP、1mM的焦磷酸钾、1mM的MgSO4、1mM的ZnSO4以及40mM的Binding Buffer缓冲液，调节其pH至6.0-7.5。

然后向底物溶液中加入实施例3所得的四种参与催化反应的固定化细胞，每升底物溶液中固定化细胞的加量达到：多磷酸激酶1g、核酮糖-5-磷酸异构酶1g、磷酸核糖焦磷酸合成酶1g，以及烟酰胺磷酸核糖转移酶1g，将所需固体酶全部加完后搅拌至质地均匀，并在整个反应过程中使搅拌速度维持在70rpm，控制反应体系的温度在35℃，用15％碳酸氢钠溶液调节pH，使其保持在6.0-7.5之间。反应6h后取样用HPLC测定其含量，将得到的烟酰胺单核苷酸粗品溶液进行过滤、浓缩、脱色、纯化、真空干燥等后续操作即得烟酰胺单核苷酸纯品。结果见图3，图3为固定化细胞合成β-NMN的结果分析图。图2为β-NMN标准品定位分析图，通过比较可以看出，同一色谱条件下，β-NMN标准品在5.031min出现单一吸收峰，而样品图谱5中4.984min时出现最大单一吸收峰，样品与标准品出峰时间均在5min左右，因此可以定性其为β-NMN特征吸收峰。

实施例5烟酰胺单核苷酸合成反应

制备底物溶液，该底物溶液的组成为60mM的D-核糖、20mM的烟酰胺、15mM的ATP、30mM的焦磷酸钾、24mM的MgSO₄、18mM的ZnSO₄以及40mM的Binding Buffer缓冲液，调节其pH至6.0-7.5。

然后向底物溶液中加入实施例3所得的各种参与催化反应的固定化细胞，每升底物溶液中固定化细胞的加量达到：多磷酸激酶20g、核酮糖-5-磷酸异构酶35g、磷酸核糖焦磷酸合成酶50g，以及烟酰胺磷酸核糖转移酶40g，将所需固体酶全部加完后搅拌至质地均匀，并在整个反应过程中使搅拌速度维持在70rpm，控制反应体系的温度在40℃，用15％碳酸氢钠溶液调节pH，使其保持在6.0-7.5之间。反应6h后取样用HPLC测定其含量，将得到的烟酰胺单核苷酸粗品溶液进行过滤、浓缩、脱色、纯化、真空干燥等后续操作即得烟酰胺单核苷酸纯品。

实施例6烟酰胺单核苷酸合成反应

制备底物溶液，该底物溶液的组成为110mM的D-核糖、140mM的烟酰胺、70mM的ATP、50mM的焦磷酸钾、40mM的MgSO₄、35mM的ZnSO₄以及40mM的Binding Buffer缓冲液，调节其pH至6.0-7.5。

然后向底物溶液中加入实施例3所得的各种参与催化反应的固定化细胞，每升底物溶液中固定化细胞的加量达到：多磷酸激酶20g、核酮糖-5-磷酸异构酶35g、磷酸核糖焦磷酸合成酶50g，以及烟酰胺磷酸核糖转移酶40g，将所需固体酶全部加完后搅拌至质地均匀，并在整个反应过程中使搅拌速度维持在70rpm，控制反应体系的温度在35℃，用15％碳酸氢钠溶液调节pH，使其保持在6.0-7.5之间。反应8h后取样用HPLC测定其含量，将得到的烟酰胺单核苷酸粗品溶液进行过滤、浓缩、脱色、纯化、真空干燥等后续操作即得烟酰胺单核苷酸纯品。

实施例7固定化细胞重复使用

在实施例3的催化反应结束后把反应液以5000r/min的条件将离心7min，分离得到反应产物和固定化细胞，再使用去离子水冲洗固定化细胞两次，按照上述的反应体系再次投料进行反应，反应结束后取样测定每批次的转化率和残余活性，第九十次反应的残余酶活与第一次反应的比值就是重复使用九十次后的残留酶活，以此来考察固定化细胞的催化效率以及残留活性随使用次数增加的变化情况。结果见图4。可以看出，固定化细胞在重复使用九十次后转化率仍高于80％，最后合成β-NMN时的转化率最高达到92％。整个催化体系的实验难度较低、整体转化效率较高、成本进一步降低。

对比例1烟酰胺单核苷酸合成反应

按照实施例4制备底物溶液，然后向底物溶液中加入实施例3所得的各种参与催化反应的固定化细胞，每升底物溶液中固定化细胞的加量达到：磷酸核糖焦磷酸合成酶1g、烟酰胺磷酸核糖转移酶1g，其他反应条件同实施例4。经检测，最后合成β-NMN时的转化率为0，说明单纯使用上述两种固定化细胞作为催化剂无法合成目标产物。

对比例2烟酰胺单核苷酸合成反应

按照实施例4制备底物溶液，然后向底物溶液中加入实施例3所得的各种参与催化反应的固定化细胞，每升底物溶液中固定化细胞的加量达到：多磷酸激酶1g、磷酸核糖焦磷酸合成酶1g、烟酰胺磷酸核糖转移酶1g，其他反应条件同实施例4。经检测，最后合成β-NMN时的转化率为0，说明单纯使用上述几种固定化细胞作为催化剂无法合成目标产物。

对比例3烟酰胺单核苷酸合成反应

按照实施例4制备底物溶液，然后向底物溶液中加入实施例3所得的各种参与催化反应的固定化细胞，每升底物溶液中固定化细胞的加量达到：核酮糖-5-磷酸异构酶1g、磷酸核糖焦磷酸合成酶1g、烟酰胺磷酸核糖转移酶1g，其他反应条件同实施例4。经检测，最后合成β-NMN时的转化率为45％，说明使用上述几种固定化细胞作为催化剂可以合成目标产物，但转化率低于实施例4。

对比例4烟酰胺单核苷酸合成反应

按照实施例4制备底物溶液，但与实施例4不同的是在每升底物溶液中只加入实施例3所得的磷酸核糖焦磷酸合成酶1g，其他反应条件同实施例4。经检测，最后合成β-NMN时的转化率为0，说明只使用上述一种固定化细胞作为催化剂不能合成目标产物。

对比例5烟酰胺单核苷酸合成反应

按照实施例4制备底物溶液，但与实施例4不同的是在每升底物溶液中只加入实施例3所得的烟酰胺磷酸核糖转移酶1g，其他反应条件同实施例4。经检测，最后合成β-NMN时的转化率为0，说明只使用上述一种固定化细胞作为催化剂不能合成目标产物。

对比例6烟酰胺单核苷酸合成反应

按照实施例4制备底物溶液，但与实施例4不同的是在每升底物溶液中只加入实施例3所得的多磷酸激酶1g，其他反应条件同实施例4。经检测，最后合成β-NMN时的转化率为0，说明只使用上述一种固定化细胞作为催化剂不能合成目标产物。

对比例7烟酰胺单核苷酸合成反应

按照实施例4制备底物溶液，但与实施例4不同的是在每升底物溶液中只加入实施例3所得的核酮糖-5-磷酸异构酶1g，其他反应条件同实施例4。经检测，最后合成β-NMN时的转化率为0，说明只使用上述一种固定化细胞作为催化剂不能合成目标产物。

对比例8烟酰胺单核苷酸合成反应

制备底物溶液，与实施例4不同的是将底物溶液中的焦磷酸钾用等量的偏磷酸钠代替，其他条件同实施例4。将得到的烟酰胺单核苷酸粗品溶液进行过滤、浓缩、脱色、纯化、真空干燥等后续操作即得烟酰胺单核苷酸纯品。经检测，最后合成β-NMN时的转化率为72％。

对比例9烟酰胺单核苷酸合成反应

制备底物溶液，与实施例4不同的是将底物溶液中的ZnSO₄用等量的ZnCl₂代替，其他条件同实施例4。将得到的烟酰胺单核苷酸粗品溶液进行过滤、浓缩、脱色、纯化、真空干燥等后续操作即得烟酰胺单核苷酸纯品。经检测，最后合成β-NMN时的转化率为79％。

对比例10烟酰胺单核苷酸合成反应

制备底物溶液，与实施例4不同的是将底物溶液中的Binding Buffer缓冲液用等量的PBS缓冲液代替，其他条件同实施例4。将得到的烟酰胺单核苷酸粗品溶液进行过滤、浓缩、脱色、纯化、真空干燥等后续操作即得烟酰胺单核苷酸纯品。经检测，最后合成β-NMN时的转化率达到69％。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种以改性硅藻土为载体的固定化全细胞催化制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.发酵液预处理：将各菌株单独发酵所得到的发酵液离心后收集下层菌泥，用适量去离子水洗涤菌泥，离心除去菌泥中残留的发酵液和其他杂质，离心后分别将四种湿菌泥与NaCl溶液按比例混合均匀，制成菌悬液；

S2.细胞固定化：在所得四种菌悬液中分别加入交联剂搅拌交联30～120min，再加入改性硅藻土进行吸附处理，静置60～180min后用二价金属离子溶液洗涤、离心2～3次，即可得到四种固定化细胞；

所述改性硅藻土的制备：配制盐酸和氢氧化钠溶液，在盐酸溶液中加入硅藻土，浸泡刻蚀后用超纯水冲洗至滤液呈中性，再将酸改性后的硅藻土与氢氧化钠溶液混合刻蚀，冲洗，经高温烘干后过筛即得改性硅藻土；

S3.酶催化反应：向含有D-核糖、烟酰胺、ATP、焦磷酸钾、MgSO₄、ZnSO₄以及BindingBuffer缓冲液，pH为6.0-7.5的底物溶液中添加上述制备好的四种固定化细胞，搅拌至质地均匀，并在整个反应过程中使搅拌速度维持在70rpm，控制反应体系的温度在30-40℃，保持pH在6.0-7.5之间，反应3-8h后得到烟酰胺单核苷酸粗品。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，还包括将烟酰胺单核苷酸粗品过滤、浓缩、脱色、纯化、真空干燥得到烟酰胺单核苷酸纯品。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，S1中的发酵液的制备包括：将菌种分别接种到发酵液中进行发酵培养16-20h，降低发酵环境的温度到24-26℃后继续培养22-26h得到发酵液；所述菌种为施氏假单胞菌、产黄青霉、解淀粉芽孢杆菌以及毕氏酵母；

优选的，所述菌种接种前需要活化，活化步骤为：将菌株分别按照梯度稀释法接入含有卡那霉素的平板培养基中培养，再挑取单菌落接种到新的培养基中摇瓶培养，再接种后摇瓶培养，重复接种摇瓶培养1-3次；

更优选的，发酵培养的条件为30-40℃、pH6.0-7.5。

4.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述S1步骤中，菌种或菌株的接种量均为1％-5％，优选3％；

任选的，所述卡那霉素的含量为15-25mg/L；

任选的，所述发酵培养的条件为35℃和7.0。

5.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述S1步骤中，NaCl溶液的浓度为0.5～1％；湿菌泥与NaCl溶液的质量比例为1：1.5。

6.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述S2步骤中，交联剂包括聚乙烯亚胺、双偶氮联苯胺、环氧聚胺、聚丙烯酰胺、戊二醛、甲醛、丁二醛、乙醛中的至少一种；交联剂的用量为12～15mL/100g，优选13mL/100g；

任选的，改性硅藻土的加量为，菌泥的干物质含量与改性硅藻土的质量比为1g：(0.5-1.5)g；优选的，质量比为1g：0.5g；

任选的，所述二价金属离子溶液选自Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ca²⁺的至少一种；浓度为1～20mmol/L。

7.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述S2步骤改性硅藻土的制备中，盐酸溶液的浓度为5-20％，优选15％；氢氧化钠溶液浓度为5-15％，优选10％；

任选的，硅藻土与盐酸溶液的投料比例为1-5g:5-15mL，优选1g:5mL。

8.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述S2步骤改性硅藻土的制备中，酸改性后的硅藻土与氢氧化钠溶液投料比例为3-10g:10-25mL，优选4g：12mL；

任选的，刻蚀的时间为2-5h，优选3h；

任选的，高温烘干的温度为110℃。

9.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述S3步骤中，底物溶液的配方为为，10-110mMD-核糖、1-140mM烟酰胺、1-70mM ATP、1-50mM焦磷酸钾、1-40mM MgSO₄、1-35mM ZnSO₄，pH为6.0-7.5。

10.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述S3步骤中，所述固定化细胞的添加量为每升底物溶液中含有多磷酸激酶1-100g、核酮糖-5-磷酸异构酶1-100g、磷酸核糖焦磷酸合成酶1-100g和烟酰胺磷酸核糖转移酶1-100g；

任选的，所述反应的条件为35℃反应6h。

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