CN110484522A - 一种重组酯酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组酯酶及其在催化邻苯二甲酸酯制备邻苯二甲酸中的应用，所述重组酯酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明重组酯酶可以降解多种PAEs底物，在30min内可将250mg/L的邻苯二甲酸二乙酯(DEP)完全催化为邻苯二甲酸(PA)，DBP可水解约96.8％，DMP可水解约46.4％，可应用于邻苯二甲酸酯污染的生物修复。

Description

一种重组酯酶及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种重组酯酶及其应用。

(二)背景技术

邻苯二甲酸酯(Phthate acid esters，PAEs)是世界上广泛使用的人工合成的难降解有机化合物，主要用于塑料增塑剂、涂料、油漆等的化工生产。已有证据表明，PAEs 是一类环境内分泌干扰物，其最明显的危害是使生殖机能下降，对动物及人类生殖系统有一定损害，可引起睾丸萎缩、精子减少、生殖细胞超微结构改变，且对胚胎发育有一定毒性。微生物降解被认为是自然环境中PAEs完全矿化的主要过程，过去的研究中已分离到多种微生物表现出了降解邻苯二甲酸酯的能力。经典的邻苯二甲酸酯降解途径认为，不管在有氧还是无氧条件下，邻苯二甲酸酯类在相关酯酶作用下先水解为邻苯二甲酸单酯，再进一步水解为邻苯二甲酸(PA)，在有氧环境下，邻苯二甲酸通过邻苯二甲酸双加氧酶反应生成二羟基邻苯二甲酸，经过脱氢和脱羧最后形成原儿茶酸；原儿茶酸可通过正位或偏位开环形成相应的有机酸，进而转化成丙酮酸、琥珀酸、草酰乙酸等进入三羧酸循环，最终转化为CO₂和H₂O。其中酯键的水解是一个共同的关键起始步骤，起始该过程的邻苯二甲酸酯水解酶(PAEs酯酶)也是PAEs降解途径的关键酶，是PAEs降解研究的重点关注对象。

本发明在对Arthrobacter sp.ZJUTW进行基因组测序的基础上，利用基因组挖掘技术分析该菌株中的PAEs代谢相关基因，根据基因组测序和功能注释信息结果，设计引物，扩增获得PAEs酯酶基因pehA，利用pET-28a表达系统在Escherichia coli BL21 (DE3)进行诱导表达和纯化，得到了重组纯化酯酶，对其进行生物信息学分析和功能验证，并考察了其基本酶学特性，野生菌株产酶能力不高、发酵周期长、易受环境影响，限制了其推广应用，而重组酯酶容易大量生产，并利用其耐碱性能力较强，有一定的耐温性，具有更好的应用前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种重组酯酶及其应用，可用于邻苯二甲酸酯的酶法降解。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组酯酶，所述重组酯酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种所述重组酯酶的编码基因，所述编码基因为SEQ ID NO.1中4174bp-4896bp所示。

本发明提供一种所述重组酯酶编码基因构建的重组载体，以及重组载体转化制备的重组基因工程菌，其中重组载体优选pET28a，宿主优选大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

本发明还提供一种重组酯酶在催化邻苯二甲酸酯制备邻苯二甲酸中的应用，所述的应用为：以含重组酯酶编码基因的工程菌诱导培养获得的湿菌体经超声破碎提取的纯酶为催化剂，以邻苯二甲酸酯为底物，以pH 7.0-10.0的PBS缓冲液为反应介质，在30-50℃条件下进行水解反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得邻苯二甲酸。

进一步，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DEHP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)或邻苯二甲酸二甲酯(DMP)。

进一步，所述底物加入量以反应介质体积计为10-400mg/L(优选250mg/L)，所述催化剂加入量以反应介质体积计为0.15～0.6U/mL(优选0.6U/mL)。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含重组酯酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-pehA)接种于含50ng/mL卡那霉素(Kana)的LB培养基中，37℃，180r/min摇床培养至OD₆₀₀为0.6，于22℃，180r/min摇床放置30min后，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，22℃培养16-18h后，将菌体重悬到4℃预冷的结合缓冲液(binding buffer)(pH8.0)中，进行超声破碎；超声破碎的条件为：功率175W，工作3s，间歇3s，总工作时间为3min；将破碎后的细胞裂解液在4℃下12000rpm离心15min，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤后上镍柱(1ml Ni-NTA预装色谱柱)，待上清液流尽，加入3倍体积的洗脱缓冲液(Elutionbuffer)进行洗脱，将结合在镍柱上的目标蛋白洗脱并收集流出的洗脱液，获得纯化的重组酯酶；结合缓冲液(binding buffer)组成：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH 8.0；洗脱缓冲液(Elution buffer)组成：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0。

所述LB培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0，121℃灭菌20min。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明根据Arthrobacter sp.ZJUTW全基因组测序和生物信息学分析，获得了重组酯酶基因pehA，克隆并构建了重组表达质粒pET28a-pehA，转化到Escherichia coliBL21(DE3)中完成异源表达和纯化。该重组酯酶基因pehA全长723bp，编码240个氨基酸残基，蛋白分子量26.19kDa，无信号肽，pI值为4.2；blastn比对发现，在已报道的Arthrobacter属中无相似序列，系统发育分析显示与Gordonia QH-11的 alpha/betahydrolase处于同一分支；酶学性质分析结果显示，该酶的最适温度为50℃，最适pH为10.0，Fe³⁺对酶活有明显的促进作用，Ni²⁺则对酶活有抑制作用；该酯酶有较好的耐碱稳定性，在pH10.0条件下1小时后，仍具保留约70％的酶活性。本发明重组酯酶可以降解多种PAEs底物，在30min内可将250mg/L的邻苯二甲酸二乙酯 (DEP)完全催化为邻苯二甲酸(PA)，DBP可水解约96.8％，DMP可水解约46.4％，可应用于邻苯二甲酸酯污染的生物修复。

(四)附图说明

图1表达载体构建简要流程图。

图2电泳图，A为pehA基因扩增电泳图，B为pUCm-T-pehA载体的构建电泳图，C为pUCm-T-pehA载体的酶切鉴定电泳图，D为pET-pehA表达载体构建电泳图； M:DNA ladder5000Marker；1:pehA；2:pUCm-T-pehA；3:pUCm-T-pehA用BamHI 与HindIII双酶切；4,5:pET28a用BamHI与HindIII双酶切；6:成功构建的pET-pehA 表达载体。

图3实施例1步骤1.4.3中重组蛋白PehA诱导表达的SDS-PAGE图；M：蛋白分子量标准品；1：IPTG诱导后的细胞裂解液；3：未诱导的细胞裂解液；3：IPTG 诱导后用镍柱纯化的重组蛋白。

图4酯酶PehA的系统发育进化树。

图5PehA多序列比对分析图；

WP_005054944.1：alpha/beta hydrolase[Microbacterium]；

WP_024476681.1：alpha/beta hydrolase[Actinobacteria]；

WP_101851263.1：alpha/beta hydrolase[Kocuria flava]；

WP_062391170.1：alpha/beta hydrolase[Gordonia phthalatica]。

图6DEP标准曲线。

图7温度对重组酯酶PehA活性的影响。

图8pH对重组酯酶PehA活性的影响。

图9PehA的底物特异性。

图10pH对重组酯酶活力的影响。

图11重组酯酶PehA的底物特异性。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1.材料与方法

1.1菌株与质粒

节杆菌(Arthrobacter sp.)ZJUTW，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M2012246，保藏日期2012年6月24日，已在专利申请CN102864102A 中公开；大肠杆菌(Escherichia.coli)DH5α，大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3) 均购自Vazyme公司。质粒pUCm-T和pET-28a(+)均购自大连宝生物工程公司。

1.2试剂

邻苯二甲酸酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)均为分析纯(>98％)，均购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇(HPLC级)购自天津四友精细化学品有限公司；限制性内切酶BamHI、HindIII、 T₄DNA连接酶，DNA切胶回收试剂盒，pET-28a(+)均购自大连宝生物工程公司， Taq酶购自Vazyme公司。其余试剂均为分析纯。

结合缓冲液(binding buffer)组成：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑， pH8.0。

洗脱缓冲液(Elution buffer)组成：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑， pH8.0。

1.3培养基

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0，121℃灭菌20min。

LB固体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为蒸馏水，琼脂20g/L，pH 7.0，121℃灭菌20min。

1.4方法

1.4.1Arthrobacter sp.ZJUTW基因组DNA制备与测序、组装与注释

Arthrobacter sp.ZJUTW接种于LB液体培养基中，30℃振荡培养24h后离心收集菌体，提取总DNA。基因组DNA提取后由浙江天科公司完成测序工作。采用Illumina Hiseq2000测序平台完成基因组扫描图测序，采用拼接软件velvet1.2.10完成序列拼接。利用Glimmer 3.02软件进行细菌的基因预测，将预测得到的基因序列分别于Nr、Swiss-prot、COG、GO和KEGG数据库进行blast比对，从而获得预测基因的注释信息。分析注释后基因组系列中特定酶及基因族的保守区序列，进而预测酶的保守功能域，从而发现降解邻苯二甲酸酯的相关基因。

1.4.2重组表达质粒构建方案

对Arthrobacter sp.ZJUTW进行全基因组测序并进行基因注释，在质粒DNA的20646bp-21368bp存在一个注释为水杨酸酯酶的基因序列，针对该基因序列设计上、下游引物，PehA-BamHI-f：CGCGGATCCATGGAGATCGTACTGGTGCA和 pehA-HindIII-r：CCCAAGCTTCCAGTCCTGTTAGGCAATGAC。重组质粒构建如图1 所示。

以Arthrobacter sp.ZJUTW基因组为模板，使用引物PehA-BamHI-f和 pehA-HindIII-r，扩增pehA基因片段，扩增条件为：94℃5min，94℃45s，55℃45s， 72℃90s，32个循环；72℃10min。将扩增得到的pehA片段克隆到载体pUCm-T上，热激法导入E.coli DH5α后，采用蓝白斑筛选，挑取阳性菌落，提取重组质粒 pUCm-T-pehA。用限制性内切酶BamHI与HindIII酶切重组质粒pUCm-T-pehA及表达载体pET28a。经过1％琼脂糖凝胶电泳回收及DNA凝胶纯化回收试剂盒回收后， T4连接酶将酶切产物pehA与酶切后的pET28a于16℃连接12h，获得重组质粒 pET28a-pehA，并转化到Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，接种至LB液体培养基中37℃扩大培养12h后，涂布于含50ng/mL卡那霉素(kana)的LB固体平板培养基上，37℃培养12h后，挑取单克隆，在含有50μg/mL卡那霉素(kana) 的LB液体培养基中活化，提取重组质粒并测序验证，获得含重组质粒pET28a-pehA 的大肠杆菌BL21(DE3)，记为重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-pehA。

1.4.3重组蛋白的表达、纯化与电泳鉴定

将重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-pehA接种于含50ng/mL Kana的LB培养基中，37℃，180r/min摇床培养至OD₆₀₀为0.6，放置于22℃，180r/min摇床30min后，加入终浓度为1mM的IPTG，22℃诱导培养16h后，将菌体重悬到40mL、4℃预冷的结合缓冲液(bindingbuffer)(pH8.0)中，进行超声破碎，超声破碎的条件为：功率175W，工作3s，间歇3s，总工作时间为3min；将破碎后的细胞裂解液在4℃下12000rpm离心 15min，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤后上镍柱(1ml Ni-NTA预装色谱柱)，待上清液流尽，加入3倍体积的洗脱缓冲液(Elution buffer)进行洗脱，将结合在镍柱上的目标蛋白洗脱，并收集所有流出的洗脱液，获得重组酯酶酶液，采用Bradford法测定蛋白质含量，并用SDS-PAGE电泳检测。

1.4.4重组酯酶酶学性质分析

通过改变温度、pH、金属离子、有机试剂、底物浓度等条件对重组酯酶的酶学特性进行分析，HPLC检测DEP降解情况，计算酶活力。以邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 为底物，用二甲基亚砜(DMSO)配制成11.20mg/mL的DEP母液。

(1)温度对重组酯酶活力的影响

在带盖子的10ml离心管中，加入2.92ml Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)，加入50μL、0.9U/mL重组酯酶酶液和30μL DEP母液(11.20mg/mL)，总反应体系3ml，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃反应10min，反应结束后置于沸水浴煮沸10min终止反应，10000rpm离心10min后取上清液，利用HPLC检测底物含量。根据DEP标准曲线计算酶活力，以最高酶活力为100％，计算各温度下的相对酶活力。对照组加入灭活的50μL重组酯酶酶液，其它条件同实验组。

DEP标准曲线的制作：在50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)中加入DEP母液，使终浓度为10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L、400mg/L。利用HPLC 检测，制定峰面积为纵坐标，底物浓度为横坐标的标准曲线(图6)。

(2)热稳定性

将50μL(0.9U/mL)重组酯酶分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中处理30min，冷却至30℃，加入2.92ml Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)和 30μL DEP母液(11.20mg/mL)，总体系3ml，在30℃反应10min，每组设置3个平行，反应结束后置于沸水浴煮沸10min终止反应，10000rpm离心10min后取上清液，利用HPLC检测底物含量。根据DEP标准曲线计算酶活力，以最高酶活力为100％，计算各温度下的相对酶活力。对照组加入灭活的50μL重组酯酶酶液，其它条件同实验组。

(3)pH对重组酯酶活力的影响

分别在50mM HAc-NaAc(pH4.0-6.0)，50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH6.0-8.0)， 50mMTris-HCl(pH8.0-9.0)，50mM glycine-NaOH(pH9.0-11.0)，50mM Na₂HPO₄-NaOH (pH11.0-12.0)的2.92ml缓冲液体系(图10)中，加入相同50μL(0.9U/mL)重组酯酶酶液和30μLDEP母液(11.20mg/mL)，总体系3ml，30℃反应10min，反应结束后置于沸水浴煮沸10min终止反应，10000rpm离心10min后取上清液，利用HPLC检测底物含量。根据DEP标准曲线计算酶活力，以最高酶活力为100％，计算各温度下处理后的相对酶活力。

(4)pH稳定性

取50μL(0.9U/mL)重组酯酶酶液分别置于50mM HAc-NaAc(pH4.0-6.0)、50mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH6.0-8.0)、50mM Tris-HCl(pH8.0-9.0)、50mM glycine-NaOH (pH9.0-11.0)、50mM Na₂HPO₄-NaOH(pH11.0-12.0)的2.92ml缓冲液体系(图10) 中处理60min，然后将pH调整到8.0，加入30μL DEP母液(11.20mg/mL)，30℃反应10min，反应结束后置于沸水浴煮沸10min终止反应，10000rpm离心10min后取上清液，利用HPLC检测底物含量。根据DEP标准曲线计算酶活力，以最高酶活力为100％，计算各不同pH条件下处理后的相对酶活力。

(5)金属离子对重组酯酶活力的影响

将NiCl、MgSO₄、CoCl₂、BaSO₄、ZnSO₄、CaCl₂、CuSO₄、MnSO₄、FeCl₃、 KCl、AlCl₃、Pb(CH₃COO)₂·3H₂O配制成离子浓度均为10mM的离子溶液，在2.92ml Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中分别加入以上金属离子溶液，使反应时终浓度为1mM，加入 50μL(0.9U/mL)重组酯酶酶液和30μL DEP(11.20mg/mL)母液，总反应体系3mL，在30℃反应10min，反应结束后置于沸水浴煮沸10min终止反应，10000rpm离心10min 后取上清液，利用HPLC检测底物含量。根据DEP标准曲线计算酶活力，以不加金属离子的酶液作为对照，其反应的酶活力为100％，计算不同金属离子处理后的相对酶活力。根据标准曲线计算其酶活力。

(6)有机试剂对重组酯酶活力的影响

在2.89ml Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)缓冲液中分别加入30μL有机溶剂，加入50μL(0.9U/mL)重组酯酶酶液和30μL DEP母液(11.20mg/mL)，总反应体系 3mL，其中有机溶剂为1％(V/V)，30℃反应10min，反应结束后置于沸水浴煮沸 10min终止反应，10000rpm离心10min后取上清液，利用HPLC检测底物含量。测试的有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、DMSO、甲醛、乙腈、三氯甲烷、吐温-80。根据DEP标准曲线计算其酶活力，以不加有机溶剂的反应体系的酶活为100％，计算不同有机溶剂处理后的相对酶活力。

1.4.5底物特异性

在2.77ml Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)缓冲液中，加入200μL(0.9U/mL) 重组酯酶酶液，再分别加入邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DEHP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)或邻苯二甲酸二甲酯(DMP)(终浓度均为250mg/L)作为底物，总反应体系3mL，30℃反应10min，反应结束后置于沸水浴煮沸10min终止反应，10000rpm离心10min后取上清液，HPLC检测DEP和DMP含量，对于DBP 和DEHP则将水相用等体积二氯甲烷进行两次萃取，将两次萃取的有机相合并，旋转蒸发仪上蒸干后用1ml甲醇溶解，以10μL进样，用Agilent1260HPLC检测DBP和 DEHP底物残留量。

1.4.6酯酶活力测定

在2.92ml Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)缓冲液中，加入50μL(0.9U/mL) 重组酯酶酶液和30μL DEP母液(11.20mg/mL)，总反应体系3mL，30℃反应10min，反应结束后置于沸水浴煮沸10min终止反应，10000rpm离心10min后取上清液，HPLC 测定反应起始底物峰面积和反应10min后峰面积，根据DEP标准曲线计算出10min 内酯酶所利用的DEP的量，从而计算出酯酶的活力。酶活力单位(U)定义为：pH8.0， 30℃时，每分钟利用底物1μmol所需要的酶量。

1.4.7重组酯酶PehA的动力学常数

分别配置以DMSO溶解的DEP(浓度11.20mg/mL)、DMP(浓度11.92mg/mL)、 DBP(浓度10.465mg/mL)母液，按表1-3加入反应体系，在30℃反应10min，反应结束后置于沸水浴煮沸10min终止反应，10000rpm离心10min后取上清液，HPLC 检测DEP和DMP含量；对于DBP，则将水相用等体积二氯甲烷进行两次萃取，将两次萃取的有机相合并，旋转蒸发仪上蒸干后用1ml甲醇溶解，以10μl进样，用Agilent 1260HPLC检测DBP残留量。根据DEP、DMP和DBP各自标准曲线，计算反应初速度，并计算三种底物条件下该酶的Km和Vmax值。

DMP和DBP各自标准曲线的制作同DEP标准曲线。

表1重组酯酶酶学性质测定加样表(DEP为底物)

表2重组酯酶酶学性质测定加样表(DBP为底物)

表3重组酯酶酶学性质测定加样表(DMP为底物)

1.4.8HPLC法检测PAEs含量

取经不同处理的反应液，加入等体积二氯甲烷，剧烈振荡后静置30min，将水相再次用等体积二氯甲烷萃取，将两次萃取的有机相合并，旋转蒸发仪上蒸干后用1ml 甲醇溶解，以10μl进样，用Agilent 1260HPLC检测，检测条件为：流动相90％甲醇+10％H₂O，流速1.0ml/min，Hypersil BDS C18色谱柱，二极管阵列(DAD)检测器，检测波长235nm。

1.4.9目标蛋白序列分析

使用BLASTp在线工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行在线数据库同源比对；使用Signal P 4.1在线工具(www.cbs.dtu.dk/services/Signal P)预测信号肽；运用邻接法进化树构建，使用分子进化遗传分析软件MEGA(version 7.0)；多序列比对使用软件ESPript；蛋白结构预测分析使用软件I-TASSER server；二硫键预测使用在线工具件DIANNA1.1。

2.结果与分析

2.1酯酶基因pehA的克隆与表达

提取Arthrobacter sp.ZJUTW全基因组DNA后由浙江天科公司完成测序工作，并进行基因注释，基因组的大小3.84Mb，其GC含量为63％，编码3504个基因。在基因组序列的20646bp-21368bp存在一个注释为水杨酸酯酶的基因序列，根据该段序列设计引物(PehA-BamHI-f、pehA-HindIII-r)。以Arthrobacter sp.ZJUTW基因组为模板，使用引物PehA-BamHI-f和pehA-HindIII-r，PCR扩增得到该酯酶基因pehA，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，电泳检测产物长度与理论大小一致(图2中A)。将扩增得到的pehA片段克隆到载体pUCm-T 上，热激法导入E.coli DH5α后，提取质粒电泳检测结果如图2中B，将质粒进行测序验证。与基因组相应序列一致。用BamHI与HindIII酶切重组质粒pUCm-T-pehA 及表达载体pET28a，T4连接酶将酶切产物pehA与酶切后的pET28a于16℃连接12h，成功获得重组质粒pET28a-pehA(图2中C、D)。

将测序验证的含有表达质粒pET-28a-pehA的大肠杆菌BL21(DE3)，利用IPTG和低温诱导表达，经细胞破碎后进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示：采用IPTG可以成功诱导目的蛋白的表达，目的蛋白存在于细胞破碎后的上清中，为可溶性蛋白。

2.2序列分析

重组酯酶基因pehA含723bp的ORF(GENBANK中的登录号为MG736085)， NucleotideBLAST和系统发育进化树分析结果显示(图4)，Gordonia sp.QH-11的 alpha/betahydrolase与PehA基因序列高度相似，而Gordonia sp.QH-11并没有对该序列进行功能验证。pehA基因编码241个氨基酸残基(氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)，推测编码的蛋白质大小为26.17kDa。利用信号肽软件预测该ORF的信号肽，结果显示该水解酶不具有信号肽，蛋白理论等电点4.42。序列中还含有由 S75-D194-H221组成的催化三联体结构，具有G-H-S-G-G排列(图5)，与酯酶家族典型的保守域(G-X-S-X-G)相符，且归属于Family V家族。

2.3温度和pH对重组酯酶PehA的影响

DEP标准曲线如图6所示，经拟合后方程为y＝35.764x+69.096，R²＝0.9954，线性关系良好。

DBP标准曲线如图7所示，经拟合后方程为y＝28.787x+514.78，R²＝0.9941，线性关系良好。

DMP标准曲线如图8所示，经拟合后方程为y＝53.558x+140.22，R²＝0.994，线性关系良好。

温度对重组酯酶PehA的影响如图9所示，50℃时重组酯酶PehA的相对酶活力较高，即最适温度为50℃，当温度上升至60℃以上时，酶活力急剧下降。

温度稳定性结果显示，在30℃，40℃和50℃处理30min，酶活性依旧保持80％以上，60℃保温30min后，相对酶活约为50％，60℃保温30min后，在70℃高温下，依然保持30％的相对酶活力，总体来看，该酶对高温有不错的耐受性。

酶催化反应受到的影响是因为酶的活性区域是由一些离子化的基团构成的，合适的离子化对于保持酶活性区域正确的构象、底物的结合、催化反应的进行都是必不可少的。在不同pH值的缓冲液体系中测定PehA酯酶的活力，结果如图10所示，当pH 为10.0时酶活最高，为最适pH。pH在8.0-10.0缓冲液中处理60min后时，酯酶PehA 的相对酶活力仍在70％以上，说明该酶具有较强的耐碱性。

2.4金属离子和有机溶剂对重组酯酶PehA活性的影响

以DEP为底物，在酶促反应体系中分别加入终浓度为1mmol/L不同的金属离子及1％(V/V)不同的有机溶剂，以不加任何物质的反应体系作为对照，结果如表4 所示，Ni²⁺对酶活有抑制作用，而Mg²⁺、K⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Al³⁺对酶活影响较小，Co²⁺、 Cu²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺对酶活有激活作用，其中以Fe³⁺激活效果最高，相对酶活达到163％。甲醇、乙醇、丙酮对对酶活有激活作用，DMSO、甲醛、乙腈、三氯甲烷、吐温80 对酶活有抑制作用，其中甲醛抑制作用最强，相对酶活只剩下22％。

表4金属离子和有机溶剂对重组酯酶pehA活影响

2.6底物特异性

重组酯酶PehA的底物特异性如图11所示，终浓度250mg/L的4种(DMP、DEP、 DBP、DEHP)底物，该酶可在30min内将完全催化DEP的水解，而DBP可水解约 96.8％，DMP可水解约46.4％，对于DEHP则基本不能水解。

2.5重组酯酶PehA的动力学常数

Km等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km值越小则底物跟酶的亲和力跟更好。从表5可知，3种PAEs的亲和力顺序为DEP>DBP>DMP，即DEP为最适底物。Vmax表示在一定酶量下的最大反应速率，即酶完全被底物饱和时的反应速度。Kcat/Km称为酶的专一性常数，可以表示同一个酶对相互竞争的几种底物的专一性。Kcat/Km比值是对不同底物的优先权的一种衡量，Kcat/Km比值大者的底物是酶优先选择的对象。表2中，DBP和DEP为底物时的Kcat/Km值分别为0.213 和0.47，说明尽管DEP的Km低于DBP，但当两者同时存在时，DBP更具有优势，这也与该菌株是以DBP为唯一碳源筛选而得相符。该酯酶可在30min内可将250mg/L 的邻苯二甲酸二乙酯(DEP)完全催化为邻苯二甲酸(PA)，催化速率相较于全细胞催化速率更快。

表5重组酯酶pehA对不同底物的酶促动力参数

3结论

本研究通过对Arthrobacter sp.ZJUTW基因组进行测序和功能注释，发现了与PAEs代谢相关基因的关键酯酶基因pehA，根据其序列设计引物扩增获得了重组酯酶基因pehA，利用pET28a构建重组质粒在E.coli DH5α进行诱导表达和纯化，并对其进行生物信息学分析和功能验证，结果表明该基因编码240个氨基酸，分子量 26188Da，等电点为4.42，不含信号肽，系统发育进化树分析结果显示，该酯酶与 Gordonia QH-11的alpha/betahydrolase处于同一分支，属于α/β型水解酶超家族。酶学性质分析结果显示，该酶可以降解多种PAEs等底物，其最适温度为50℃，最适 pH为10.0，有较好的耐碱性能力；Fe³⁺对酶活有明显的促进作用，Ni²⁺则对酶活有抑制作用；1％(V/V)甲醇和乙醇对酶活有一定的促进作用。酶促动力学常数分析表明，该酯酶3种PAEs的亲和力顺序为DEP>DBP>DMP，并可在30min内可将250mg/L 的邻苯二甲酸二乙酯(DEP)完全催化为邻苯二甲酸(PA)，催化速率相较于全细胞催化速率更快。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组酯酶及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 723

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atggagatcg tactggtgca cggcggatgg gtaggcggct gggtgtggga cggcgtcgcc 60

gacgaattgc gcagaatggg gcacgaggtg atcgcgccga cgctgcgcgg tctcgaagac 120

ggtgacgtgg accgctccgg cgtcacgatg agcatgatgg cgcgcgatct gatcgatcag 180

gtaagagagc tcacccagct cgacatcgtg ctcgtcggtc atagcggcgg aggtccgctc 240

atccaactcg tcgctgaggc gatgcccgag cgcatcggcc gggtcgtctt cgtcgacgcc 300

tgggtgctgc gcgacggcga gaccattaac gacgtgctcc ccgatccgtt ggtcgcagcg 360

acgaaggcgc ttgcgagtca gtccgacgac aacaccatcg tcatgccgcc tgagctctgg 420

gccgcgtcta tgcaggacat gtccccgttc gagcagcagc agctcgccgc gctcgagccg 480

aggctcgtcc catcgccggc aggctggtcc gatgagccga tccgcctcga ccggttctgg 540

gcgagcagca tcccgtcaag ttatgtgttc ctcgctcagg accaggccgt tcccgctgag 600

atctaccagg ccgcggccgg gcggcttgat agtccgcgca cgatcgagat cgacggaagc 660

catttggtga tgctcacgca tccggagagg ctcgcacggg ccctcgacgc cgtcattgcc 720

taa 723

<210> 2

<211> 240

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Glu Ile Val Leu Val His Gly Gly Trp Val Gly Gly Trp Val Trp

1 5 10 15

Asp Gly Val Ala Asp Glu Leu Arg Arg Met Gly His Glu Val Ile Ala

20 25 30

Pro Thr Leu Arg Gly Leu Glu Asp Gly Asp Val Asp Arg Ser Gly Val

35 40 45

Thr Met Ser Met Met Ala Arg Asp Leu Ile Asp Gln Val Arg Glu Leu

50 55 60

Thr Gln Leu Asp Ile Val Leu Val Gly His Ser Gly Gly Gly Pro Leu

65 70 75 80

Ile Gln Leu Val Ala Glu Ala Met Pro Glu Arg Ile Gly Arg Val Val

85 90 95

Phe Val Asp Ala Trp Val Leu Arg Asp Gly Glu Thr Ile Asn Asp Val

100 105 110

Leu Pro Asp Pro Leu Val Ala Ala Thr Lys Ala Leu Ala Ser Gln Ser

115 120 125

Asp Asp Asn Thr Ile Val Met Pro Pro Glu Leu Trp Ala Ala Ser Met

130 135 140

Gln Asp Met Ser Pro Phe Glu Gln Gln Gln Leu Ala Ala Leu Glu Pro

145 150 155 160

Arg Leu Val Pro Ser Pro Ala Gly Trp Ser Asp Glu Pro Ile Arg Leu

165 170 175

Asp Arg Phe Trp Ala Ser Ser Ile Pro Ser Ser Tyr Val Phe Leu Ala

180 185 190

Gln Asp Gln Ala Val Pro Ala Glu Ile Tyr Gln Ala Ala Ala Gly Arg

195 200 205

Leu Asp Ser Pro Arg Thr Ile Glu Ile Asp Gly Ser His Leu Val Met

210 215 220

Leu Thr His Pro Glu Arg Leu Ala Arg Ala Leu Asp Ala Val Ile Ala

225 230 235 240

Claims (10)

1.一种重组酯酶，其特征在于所述重组酯酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.一种权利要求1所述重组酯酶的编码基因，其特征在于所述编码基因为SEQ ID NO.1中4174bp-4896bp所示。

3.一种权利要求1所述重组酯酶编码基因构建的重组载体。

4.一种权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。

5.如权利要求4所述工程菌，其特征在于所述工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主构建而成。

6.一种权利要求1所述重组酯酶在催化邻苯二甲酸酯制备邻苯二甲酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：以含重组酯酶编码基因的工程菌诱导培养获得的湿菌体经超声破碎提取的纯酶为催化剂，以邻苯二甲酸酯为底物，以pH7.0-10.0的PBS缓冲液为反应介质，在30-50℃条件下进行水解反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得邻苯二甲酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二乙酯或邻苯二甲酸二甲酯。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述底物加入量以反应介质体积计为10-400mg/L，所述催化剂加入量以反应介质体积计为0.15～0.6U/mL。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含重组酯酶编码基因的工程菌接种于含50ng/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，180r/min摇床培养至OD₆₀₀为0.6，于22℃，180r/min摇床放置30min后，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，22℃培养16-18h后，将菌体重悬到4℃预冷的pH8.0结合缓冲液中，超声破碎；超声破碎的条件为：功率175W，工作3s，间歇3s，总工作时间为3min；将破碎后的细胞裂解液在4℃下12000rpm离心15min，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤后上镍柱，待上清液流尽，加入3倍体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集流出的洗脱液，获得纯化的重组酯酶；所述结合缓冲液组成：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH 8.0；所述洗脱缓冲液组成：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0。