CN114181922A

CN114181922A - 一种重组酯酶、基因、重组菌及降解邻苯二甲酸酯的应用

Info

Publication number: CN114181922A
Application number: CN202111508072.3A
Authority: CN
Inventors: 范新炯; 刘艳艳; 赵萌
Original assignee: Anhui Medical University
Current assignee: Anhui Medical University
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2041-12-10
Also published as: CN114181922B

Abstract

本发明适用于酶工程技术领域，提供了一种重组酶酯、基因、重组菌及降解邻苯二甲酸酯的应用，重组酶酯的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。该重组酶酯其低温稳定性好，可以作为生物酶制剂的活性组分，对PAEs包括DMP、DEP、DPrP、DBP、BBP和DPP有强降解作用，因此在去除PAEs残留方面有广阔的应用前景。

Description

一种重组酯酶、基因、重组菌及降解邻苯二甲酸酯的应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种重组酯酶、基因、重组菌及降解邻苯二甲酸酯的应用。

背景技术

邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类新型持久性环境污染物的总称，在塑料生产中广泛用作增塑剂和软化剂，以提高弹性和柔韧性，PAEs还用于建筑材料、医疗器械、电线电缆和其他行业。由于PAEs与塑料以非共价键的形式结合，所以它们很容易从聚合物中释放渗透到周围环境中，污染环境。美国环境保护署(EPA)、欧盟和中国国家环境监测中心将多种PAEs列为优先控制污染物。因此，在自然分解能力无法满足人类安全需求的形势下，寻找高效降解PAEs的新方法，降低PAEs的毒负作用已成为一个重要研究领域。

生物法尤其是生物酶在处理PAEs残留问题上具有处理简便、安全高效、应用范围广且无二次污染等优点，日益受到重视。因此，急需具有优良性能的生物催化剂PAEs降解酶。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种重组酶酯，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

本发明的酶酯基因是从毛豆腐中克隆所得到的，以毛豆腐为样本构建宏基因组文库，酯酶基因能够分解酯酶平板筛选上三丁酸甘油酯形成透明圈，提取含有酯酶基因的菌落进行测序，确定酯酶基因，设计引物对上面所筛选到的基因进行特异性扩增，获取酯酶基因，以pET为载体在大肠杆菌中异源表达，能够水解邻苯二甲酸酯的酶可在邻苯二甲酸酯筛选平板上形成透明圈，通过实验获得能够分解邻苯二甲酸酯的酯酶基因，命名为est1260。

本发明实施例是这样实现的，一种重组酶酯Est1260，其氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。

本发明实施例还提供了一种酶酯基因est1260，编码所述的重组酶酯Est1260，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明实施例还提供了一种酶酯基因est1260构建的重组载体，所述重组载体的表达载体为pET-32a(+)。

本发明实施例还提供了一种重组载体转化制备的重组菌。

作为本发明实施例的一个优选方案，将表达载体pET-32a(+)和酶酯基因est1260经BamH I和HindⅢ双酶切后连接，并转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组菌。

本发明实施例还提供了一种制备重组酶酯Est1260的方法，包括以下步骤：

用所述的表达载体转化宿主细胞，得到重组菌；

经IPTG诱导，得到重组酯酶Est1260。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述IPTG终浓度为10-1000μM，诱导温度为16～30℃。

本发明实施例还提供了一种重组酶酯Est1260在降解邻苯二甲酸酯上的应用。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基卞酯或邻苯二甲酸二戊酯。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述降解温度为0-40℃；降解时的pH为6.47-9.18。

本发明实施例提供的一种重组酶酯Est1260，其低温稳定性好，可以作为生物酶制剂的活性组分，用于降解PAEs；

将酯酶基因est1260序列进行异源表达，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下：

(1)在大肠杆菌表达体系中，该重组蛋白具有高效可溶性表达；

(2)用对硝基苯酚乙酸酯为底物，测得重组蛋白的最适反应温度为35℃，在0℃仍保留70％左右的酶活性，说明此酶是一种冷适应性酯酶；在温度低于30℃非常稳定，4℃保温24h后，保留80％的相对酶活性；最适反应pH为8.5，在pH 5.0-9.0下处理24h，剩余酶活性均大于80％，说明其具有较好的酸碱耐受性。

重组酯酶Est1260对PAEs包括DMP、DEP、DPrP、DBP、BBP和DPP有强降解作用，因此在去除PAEs残留方面有广阔的应用前景。

附图说明

图1为在E.coli中表达的重组酯酶Est1260的SDS-PAGE分析，其中，M为标准蛋白分子量maker，1为重组蛋白粗提物，2为纯化的重组蛋白；

图2为以对硝基苯酚乙酸酯为底物重组酯酶的最适温度结果的折线图；

图3为以对硝基苯酚乙酸酯为底物重组酯酶的热稳定性结果的折线图；

图4为以对硝基苯酚乙酸酯为底物重组酯酶的最适pH结果的折线图；

图5为以对硝基苯酚乙酸酯为底物重组酯酶的pH稳定性结果的折线图；

图6为重组酶酯对底物DMP、DEP、DPrP、DBP、BBP和DPP降解液相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例1

酯酶基因的克隆与大肠杆菌表达

1、基因片段的克隆

根据酯酶基因est1260的基因序列设计引物如下：

est1260-F’:5'-TTATTGGATCCATGATGCCCGGAGCGGCAAC-3'(如序列表SEQ ID NO.3所示)；

est1260-R’:5'-ATTAAGCTTTCATCGCGTTGCCCCCAGGTCG-3'(如序列表SEQ ID NO.4所示)。

以质粒pUC118-est1260为模板、est1260-F’和est1260-R’为引物，对est1260基因进行PCR扩增，体系如下：

PCR反应条件如下：预变性：98℃，5min；变性：98℃，30s，退火：63℃，10s，延伸：72℃，10s；其中，重复变性-退火-延伸过程30个循环；再延伸：72℃，10min。PCR扩增结束后，取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分放于-20℃保存备用。

用胶回收试剂盒将PCR产物纯化并用BamH I和HindⅢ于30℃双酶切8h，与用BamHI和HindⅢ双酶切的pET-32a(+)表达载体进行连接，取5μL连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化液涂布含氨苄青霉素钠(100μg/mL)的LB固体培养基，37℃培养过夜，随机挑取5株单菌落接种提取质粒DNA，双酶切验证后，送交测序。

2、重组酯酶粗酶液的获得及分子量检测

将重组工程菌划线至含氨苄青霉素钠(100μg/mL)的LB固体培养基中，37℃培养过夜活化，随机挑取一株重组菌接种至含氨苄青霉素钠(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养过夜，按1:100的接种量转接至50mL的含氨苄青霉素钠(100μg/mL)的LB液体培养基中，当菌体密度OD600＝0.5-0.6时加入IPTG至终浓度0.1mM，30℃、200rpm摇床培养10h。14000rpm离心5min，弃上清，将菌体重悬于50mL，100mM的磷酸钾(pH＝6.8)缓冲液中，用超声波破碎仪(Sonics公司)破碎细胞。4℃，14000rpm离心10min，收集上清，得到粗重组蛋白，将粗重组蛋白用Ni-NTA(上海生工)亲和柱纯化重组蛋白，亲和柱具体操作步骤按上海生工产品说明书进行。

将获得的粗重组蛋白和纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳(10％)将粗酶液中蛋白的各个组分分开，用考马斯亮蓝G-250染色，蛋白maker估计酶蛋白的大小。通过蛋白纯化试剂盒纯化酶蛋白，SDS-PAGE电泳得到一条单一的蛋白条带。SDS-PAGE电泳结果表明，SEQ ID NO.1所述核苷酸序列所编码的多肽在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达，且所有重组蛋白均是可溶的，无包涵体形成，初步估计重组蛋白的分子量约为63.0kDa(其中含17kDa融合标签)，如附图1所示。

实施例2

重组酯酶的酶学性质研究

1、重组酯酶最适反应温度及热稳定性

将重组酯酶的酶液在0-45℃下进行酶促反应，反应体系为410μL，其组成为400μL含40uM的对硝基苯乙酸酯的磷酸钾溶液(pH6.8)和10μL酶溶液。该反应体系在不同温度下反应5min，随后于405nm波长处测定该过程中释放的对硝基苯酚的吸光度，同时做不加酶液的空白对照。测定其酶活性，得到其最适反应温度(以酶活力最高时记为100％)；

检测结果如附图2所示，重组蛋白的最适反应温度为35℃，在0℃保留70％以上的活性。

在100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.8)，将重组酯酶酶液分别置于不同0℃、20℃、25℃、30℃、40℃和45℃保温一定的时间，测定残余酶活，以未经热处理的酶液酶活力为100％；

检测结果如附图3所示，在温度低于30℃非常稳定，0℃保温24h后，保留80％以上的相对酶活性。

2、重组酯酶最适反应pH及pH稳定性

以对硝基苯酚乙酸酯为底物，在最适温度下检测不同pH值(pH 5.91～9.18)条件下检测重组酯酶的最适反应pH；

结果如附图4所示，重组酯酶的最适pH为8.5。

取等量的酶液，分别在不同pH值的缓冲液(pH 5.91～9.18)中30℃静置24h，确定Est1260的pH稳定性，以酶活力最高者为100％，计算相对酶活；

经过在各pH值的缓冲液中放置24h后，结果如附图5所示，重组蛋白在pH 5.91～9.18的范围内可以保持80％以上的酶活力，表现出较好的pH稳定性。

实施例3

重组酯酶Est1260对邻苯二甲酸酯的降解能力测定

1、反应体系

(1)配置终浓度为5mM的DMP、DEP、DPrP、DBP、BBP和DPP的反应液；

(2)取1mL上述反应溶液，分别加入100μL粗酶液，以灭活酶作为空白对照，30℃反应1h；

(3)向(2)中加入100μL 1M的HCl终止反应后，加入等体积的乙酸乙酯充分涡旋混匀，萃取上层有机相重复萃取过程3次；

(4)将上述溶液蒸干，利用500μL甲醇重悬后，进行高效液相色谱分析。

2、检测条件

HPLC检测条件：采用C18(4.6x 250mm)色谱柱，流动相为15％(10mM)甲酸：85％甲醇，流速：0.8mL/min，检测波长：254nm，进样量：10μL。检测邻苯二甲酸二乙酯时更换流动相为20％(10mM)甲酸：80％甲醇。

如图6所示，经HPLC检测分析，大肠杆菌表达的重组酯酶在30℃对DMP、DEP、DPrP、DBP、BBP和DPP的降解率分别为51.61％、56.64％、42.18％、36.58％、39.56％、46.85％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽医科大学

<120> 一种重组酯酶、基因、重组菌及降解邻苯二甲酸酯的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgcccg gagcggcaac cggctttttg cagcgccgcg cgctgcctaa cgtggcgggc 60

ctctccccac ggatcaccat gatgaatgcc gctctttccc ttgaacctgc accgacgctg 120

ccttcggtgc agcggctgct gcagcaggtc catccgttgc gcctggttgg tgcggtggtg 180

ctggtgcgcg agcacggcgt gctgcgccat gccagcgcga gcgggctggc cgaccgcgag 240

tcggccaggc cgatgctgcg cgatcagctg ttccggctgg catcggtcag caagccgttg 300

ctggccacgg tgatcctgcg cctggtggct gaaggcgtgc tcgacctcga cgcgccggtg 360

cagcgctggc tgccggactt ccgcccggcg ctggccgatg gcagcacgcc gccgatcagc 420

ctgcgccagc tgctcagcca cagcagcgga ctgggctatc gcttcctgga ggcggatgcg 480

gagggaccct acgcgcgcgc tggcgtcagc gatggcatgg atgccaaccc ggtgtccctg 540

gccgagaacg tgcgccgcat cgcgcaggtg ccactgctgt tcgcaccggg cagccagtgg 600

ctttactcgt tgggcgtgga cgtggccggt gcggtggccg aagccgcgac cggtgaaacg 660

ctgcaggcgc tgttccagcg tctgctggct gccccgttgg gcctgcgcga taccgcgttc 720

gttacgcgcg atgcagagcg gctggccacg ccgtatgtga gcgacaggcc gcaaccgcat 780

cgcctgcagg aaggcgaggt ggtcgcacct ttcgagggaa cgctgggcat cgagttcagt 840

cccgcacgtg ccaccgacgc cagtcggttc gcttcggccg gcgccggcct ggtcggtacc 900

gccgatgagg tgatggcggt gctggaggct ttgcgcgacg tgcaacgctc cggcctgctg 960

ccgcccgcgc tggcggcgca gatggccagc ccgcaggtgg gcgagcaggg gcccccggaa 1020

ccggccggct ggggcttcgg gctgggcttt gcggtactgc gcgatgccgc cgccagcggc 1080

acaccacagc gcgaaggcag ctggcgctgg ggcggtgcct acgggcacag ctggttcgtc 1140

gacccgtcgc gtgggctgag cgtggtggcg ctgaccaaca ccctgtacga agggatggat 1200

ggcgttttcg tcgatgacct gcgcgatgcg atttatgccg acctgggggc aacgcgatga 1260

<210> 2

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Met Pro Gly Ala Ala Thr Gly Phe Leu Gln Arg Arg Ala Leu Pro

1 5 10 15

Asn Val Ala Gly Leu Ser Pro Arg Ile Thr Met Met Asn Ala Ala Leu

20 25 30

Ser Leu Glu Pro Ala Pro Thr Leu Pro Ser Val Gln Arg Leu Leu Gln

35 40 45

Gln Val His Pro Leu Arg Leu Val Gly Ala Val Val Leu Val Arg Glu

50 55 60

His Gly Val Leu Arg His Ala Ser Ala Ser Gly Leu Ala Asp Arg Glu

65 70 75 80

Ser Ala Arg Pro Met Leu Arg Asp Gln Leu Phe Arg Leu Ala Ser Val

85 90 95

Ser Lys Pro Leu Leu Ala Thr Val Ile Leu Arg Leu Val Ala Glu Gly

100 105 110

Val Leu Asp Leu Asp Ala Pro Val Gln Arg Trp Leu Pro Asp Phe Arg

115 120 125

Pro Ala Leu Ala Asp Gly Ser Thr Pro Pro Ile Ser Leu Arg Gln Leu

130 135 140

Leu Ser His Ser Ser Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Leu Glu Ala Asp Ala

145 150 155 160

Glu Gly Pro Tyr Ala Arg Ala Gly Val Ser Asp Gly Met Asp Ala Asn

165 170 175

Pro Val Ser Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Ile Ala Gln Val Pro Leu

180 185 190

Leu Phe Ala Pro Gly Ser Gln Trp Leu Tyr Ser Leu Gly Val Asp Val

195 200 205

Ala Gly Ala Val Ala Glu Ala Ala Thr Gly Glu Thr Leu Gln Ala Leu

210 215 220

Phe Gln Arg Leu Leu Ala Ala Pro Leu Gly Leu Arg Asp Thr Ala Phe

225 230 235 240

Val Thr Arg Asp Ala Glu Arg Leu Ala Thr Pro Tyr Val Ser Asp Arg

245 250 255

Pro Gln Pro His Arg Leu Gln Glu Gly Glu Val Val Ala Pro Phe Glu

260 265 270

Gly Thr Leu Gly Ile Glu Phe Ser Pro Ala Arg Ala Thr Asp Ala Ser

275 280 285

Arg Phe Ala Ser Ala Gly Ala Gly Leu Val Gly Thr Ala Asp Glu Val

290 295 300

Met Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Asp Val Gln Arg Ser Gly Leu Leu

305 310 315 320

Pro Pro Ala Leu Ala Ala Gln Met Ala Ser Pro Gln Val Gly Glu Gln

325 330 335

Gly Pro Pro Glu Pro Ala Gly Trp Gly Phe Gly Leu Gly Phe Ala Val

340 345 350

Leu Arg Asp Ala Ala Ala Ser Gly Thr Pro Gln Arg Glu Gly Ser Trp

355 360 365

Arg Trp Gly Gly Ala Tyr Gly His Ser Trp Phe Val Asp Pro Ser Arg

370 375 380

Gly Leu Ser Val Val Ala Leu Thr Asn Thr Leu Tyr Glu Gly Met Asp

385 390 395 400

Gly Val Phe Val Asp Asp Leu Arg Asp Ala Ile Tyr Ala Asp Leu Gly

405 410 415

Ala Thr Arg

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttattggatc catgatgccc ggagcggcaa c 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attaagcttt catcgcgttg cccccaggtc g 31

Claims

1.一种重组酶酯Est1260，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.一种酶酯基因est1260，编码权利要求1所述的重组酶酯Est1260，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.一种如权利要求2所述的酶酯基因est1260构建的重组载体，其特征在于，所述重组载体的表达载体为pET-32a(+)。

4.一种如权利要求3所述的重组载体转化制备的重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，是将表达载体pET-32a(+)和酶酯基因est1260经BamH I和HindⅢ双酶切后连接，并转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，获得重组菌。

6.一种制备重组酶酯Est1260的方法，其特征在于，包括以下步骤：

用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞，得到重组菌；

经IPTG诱导，得到重组酯酶Est1260。

7.根据权利要求7所述的制备重组酶酯Est1260的方法，其特征在于，所述IPTG终浓度为10-1000μM，诱导温度为16～30℃。

8.一种如权利要求1所述的重组酶酯Est1260在降解邻苯二甲酸酯上的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基卞酯或邻苯二甲酸二戊酯。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述降解温度为0-40℃；降解时的pH为6.47-9.18。