CN113308453B

CN113308453B - 酰胺水解酶SaAH及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN113308453B
Application number: CN202110708502.XA
Authority: CN
Inventors: 刘建国; 李静; 王淼; 谭雯斐; 辛文
Original assignee: China University of Petroleum East China
Current assignee: China University of Petroleum East China
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2041-06-23
Also published as: CN113308453A

Abstract

本发明公开了酰胺水解酶SaAH及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，来源于盐螺旋菌JH(Salinispirillum sp.JH)，是一种酰胺水解酶，命名为SaAH蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还保护SaAH蛋白作为酰胺水解酶的应用。

Description

酰胺水解酶SaAH及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉酰胺水解酶SaAH及其编码基因和应用。

背景技术

酰胺水解酶是水解酶超家族中的一员，能够催化酰胺水解为相应的羧酸和氨。该反应不仅可以用于制备光学纯的药物及化学中间体，还能消除环境中卤代酰胺类除草剂的残留。到目前为止，人们对酰胺水解酶的研究报道相对较少。

此外，目前已报道的酰胺水解酶的性质较差，不能满足其应用的需要。如大部分已发现的微生物来源的酰胺水解酶的活性较低、热稳定性较差。因此，寻找性质优良的酰胺水解酶及其新的来源，并通过异源表达提高其产酶水平，是目前生物转化酰胺类化合物的重要任务。本发明提供了新颖来源的酰胺水解酶SaAH及其编码基因和应用。

发明内容

本发明的目的是提供酰胺水解酶SaAH及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，来源于盐螺旋菌JH(Salinispirillum sp.JH)，是一种酰胺水解酶，命名为SaAH蛋白，氨基酸序列由序列表中序列1所示。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有序列表中序列1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其突变体，只要其与前述氨基酸序列具有99％以上同源性，且具有酰胺水解酶功能，均属于本发明保护范围。具体的，所述改变包括氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和/或替换。

SaAH蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

优选的，所述基因的碱基序列如序列表中序列2所示，该基因序列来源于盐螺旋菌JH(Salinispirillum sp.JH)，由906个碱基组成。由于核苷酸序列的特殊性，任何序列表中序列2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物均属于本发明的保护范围。

本发明还保护SaAH蛋白作为酰胺水解酶的应用。应用SaAH蛋白作为酰胺水解酶时，采用的温度为30-70℃，采用的pH为3-11。应用SaAH蛋白作为酰胺水解酶时，采用的温度为40℃，采用的pH为6。

本发明提供的酰胺水解酶SaAH具有较高的酶活力，反应温度宽泛，反应pH宽泛，底物谱广。

盐螺旋菌JH(Salinispirillum sp.JH)已于2020年7月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020375。

附图说明

图1为菌株JH的照片。

图2为菌株JH的系统发生树。

图3为SaAH蛋白溶液的电泳图。

图4为检测最适pH时的相对酶活结果。

图5为检测最适反应温度时的相对酶活结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、盐螺旋菌JH的分离、鉴定和保藏

一、分离

取碱湖样品50μL，加入碱湖滤液450μL，吹打混匀得到10^-1浓度样品，依次稀释得到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5浓度的样品。取碱湖水样原液20μL、40μL及稀释得到的样品，分别涂布到YMAH、TSAH、LBH、2216EH等固体培养基中，在35℃恒温培养箱中培养3-4d后，观察生长情况。挑取颜色不同、形态差异的菌落，通过三区划线法进行纯化和培养，重复划线纯化过程3-4次后，得到纯种的菌落。

二、鉴定

将纯化后的菌株于LBH固体培养基中进行三区划线，35℃培养2d，使用透射电子显微镜观察细胞的形态、大小、有无鞭毛等特征。挑取LBH固体平板上的单菌落按照标准方法进行革兰氏染色处理，使用倒置荧光显微镜观察细菌的革兰氏染色情况。采用穿刺法将菌株置入半固体培养基中进行接种，然后放入37℃的培养箱中培养2d，观察菌株的运动性和好氧性情况。

配制不同浓度NaCl(0％、1.0％、3.0％、5.0％和10.0％(w/v))的LBH液体培养基，接种后置于35℃的摇床中振荡培养7d，每隔24h取一次样，使用UV-2450分光光度计在OD₆₀₀处检测细菌的生长情况，以确定菌株的最适盐度以及盐度生长范围；对于菌株pH值的测定，需配制不同pH值(7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、11.5、12.0)的液体LBH培养基。接种后，置于37℃摇床中培振荡培养7d，每隔24h取一次样，以培养条件相同的不接菌培养基作为空白对照，以确定最佳生长pH范围；分别设置温度梯度为4℃、10℃、25℃、28℃、30℃、37℃、40℃、45℃和50℃，以确定菌株的最佳生长温度范围。

利用Biolog GEN III鉴定板检测菌株对不同碳源的利用情况。

使用API 20NE和API 32GN试剂盒对菌株进行鉴定，如硝酸盐还原试验、亚硝酸盐还原试验、酶活特性及碳源利用试验等。菌株Salinispirillum sp.JH和参考菌株Salinispirillum marinum GCWy1^T的结果见表1。

表1

利用基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，并利用PCR技术扩增菌株的16SrDNA序列。本实验采用的PCR体系为：4μL模板DNA、1μL引物27F、1μL引物1492R、5μL 10×TaqBuffer、4μL dNTP、0.8μL Taq DNA聚合酶、34.2μL灭菌超纯水。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行验证，若条带大小符合预期实验结果，则将PCR扩增产物送商业测序。如果测序结果正确，则对PCR扩增产物进行切胶回收，并利用pClone007 Simple Vector Kit克隆试剂盒克隆目的条带，再将克隆后的目的基因与质粒pMD18-T连接，最后将重组质粒转入大肠杆菌E.coli DH5α中，转化过程严格按照感受态细胞E.coli DH5α的使用操作说明进行。将测得的16S rDNA序列结果上传至https://www.ezbiocloud.net/网站进行序列对比分析，确定分离细菌的种属，并下载与菌株亲缘性较高的细菌的16S rDNA序列。通过选择合适的外群，并基于分离菌株及其相关菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA 7.0软件构建菌株的系统发育树。使用近邻连接法(NJ)进行细菌的系统发育分析。基于1000次重复，使用Bootstrap分析确定系统发生树的拓扑结构。见图2。

以上鉴定结果表明，菌株JH属于糖螺旋菌科(Saccharospirillaceae)，盐螺旋菌属(Salinispirillum)。

三、保藏

实施例2、酰胺水解酶(SaAH蛋白)的制备

经过大量序列分析、比对和功能验证，从盐螺旋菌JH中发现一个新蛋白，将其命名为SaAH蛋白，如序列表的序列1所示。将盐螺旋菌JH中编码SaAH蛋白的基因命名为SaAH基因，其编码框如序列表的序列2所示。

一、构建重组质粒

1、以盐螺旋菌JH的基因组DNA为模板，采用AH-F和AH-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

AH-F：5’-CGGATCCATGACCAGCCAAC-3’；

AH-R：5’-CCAAGCTTCTAAACCAACCGG-3’。

2、取步骤1得到的PCR扩增产物，与pET-28a载体连接，得到重组质粒pET-28a-SaAH。

pET-28a载体(pET-28a Vector)：Novagen，产品目录号69864-3。

经测序，重组质粒pET-28a-SaAH中具有序列表的序列2所示的DNA分子。

二、制备重组菌

将重组质粒pDE1-SaAH导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌甲。

将pET-28a载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌乙

三、表达蛋白

1、将重组菌接种至含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、150rpm振荡培养12h，得到种子液。

2、将1体积份种子液接种至99体积份含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀值约为0.6，此时加入IPTG诱导剂并使其在体系中的浓度为0.5mmol/L，然后25℃、200rpm振荡培养6h(诱导表达)，然后4℃、8000×g离心10min，收集菌体沉淀。

3、取步骤2得到的沉淀，用Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH 7.5)洗涤，然后悬浮于Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH 7.5)并进行超声破碎(超声破碎参数：功率200W，每超声3s停3s，总时间为30min)，然后4℃、10000×g离心20min，收集上清液。

重组菌甲进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液甲。

重组菌乙进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液乙。

四、纯化蛋白

取步骤三得到的粗酶液甲，用孔径为0.22μm的微滤滤膜过滤，收集滤液。取滤液，采用Superdex^TM 200 10/60凝胶层析柱进行分离纯化。将Superdex^TM 200 10/60凝胶层析柱连接到快速蛋白液相系统，以1×PBS缓冲液(pH 8.0)作为流动相，流速为0.05mL/min。收集保留体积为18-20mL对应洗脱峰的过柱后溶液,即为SaAH蛋白溶液。SaAH蛋白溶液的电泳图见图3，仅一条蛋白带，且符合预估分子量(约34kDa)。

实施例3、酰胺水解酶(SaAH蛋白)的酶学性质

Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.4)：称取6.06g Tris，溶于超纯水中，用HCl调节pH至7.5。

底物溶液(1.0M丁酰胺)：称取8.7g丁酰胺，采用Tris-HCl缓冲液溶解，并定容至100mL。

一、pH对酰胺水解酶活性的影响

1、最适pH

取实施例2制备的SaAH蛋白溶液，Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.4)至2倍体积，将稀释液作为供试液。

检测方法：加入供试液100μL、底物溶液900μL，反应在40℃下进行30min，然后加入100μL TCA(15％的三氯乙酸)溶液终止反应。反应混合物在10000×g离心10min，取上清液100μL，加入100μL奈氏试剂和800μL蒸馏水混合，测定OD_425nm值。

分别采用如下缓冲液：pH 3.0的柠檬酸盐缓冲液、pH 4.0的柠檬酸盐缓冲液、pH5.0的柠檬酸盐缓冲液、pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液、pH 6.0的磷酸盐缓冲液、pH 7.0的磷酸盐缓冲液、pH 8.0的磷酸盐缓冲液、pH 8.0的碳酸盐缓冲液、pH 9.0的碳酸盐缓冲液、pH10.0的碳酸盐缓冲液、pH 11.0的碳酸盐缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的配方见表2。磷酸盐缓冲液的配方见表3。碳酸盐缓冲液的配方见表4。

表2

pH	0.05M柠檬酸水溶液(mL)	0.05M柠檬酸钠水溶液(mL)
			3.0	37.2	2.8
4.0	26.2	13.8
			5.0	16.4	23.6
6.0	7.6	32.4

表3

pH	0.2M磷酸氢二钠水溶液(mL)	0.2M磷酸二氢钠水溶液(mL)
			6.0	61.5	438.5
7.0	305	195
			8.0	473.5	26.5

表4

pH	0.05M碳酸钠水溶液(mL)	0.05M碳酸氢钠水溶液(mL)
			8.0	50	450
9.0	150	350
			10.0	300	200
11.0	450	50

SaAH蛋白的最适pH为6。将采用最适pH对应的缓冲液时的OD_450nm值作为100％，计算采用各种缓冲液时的相对值，作为相对酶活。结果见图4。

二、温度对酰胺水解酶活性的影响

1、最适反应温度

取实施例2制备的SaAH蛋白溶液，用Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.4)稀释至2倍体积，然后作为供试液。

检测方法：加入供试液100μL、底物溶液900μL，反应在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃分别进行30min，然后加入100μL TCA(15％的三氯乙酸)溶液终止反应。反应混合物在10000×g离心10min，取上清液100μL，加入100μL奈氏试剂和800μL蒸馏水混合，测定OD_425nm值。

最适反应温度为40℃。将采用最适反应温度时的OD_425nm值作为100％，计算采用各种反应温度时的相对值，作为相对酶活。结果见图5。

三、酰胺水解酶的底物特异性

取实施例2制备的SaAH蛋白溶液，用Tris-HCl缓冲液(50mM、pH 7.4)稀释至2倍体积，然后作为供试液。

以丁酰胺作为底物时相应的OD_425nm值作为100％，分别计算对于各种底物的相对酶活。

底物1分别见表5。底物在1mL体系中的浓度为100mM。结果见表5。

表5

四、酶活力的测定

酶活(1U)定义为：在40C下每分钟形成1μmol氨所需的酶量。

采用实施例2制备的粗酶液甲作为供试液，酶活为214U/mL。

采用实施例2制备的粗酶液乙作为供试液，酶活为0U/mL。

采用实施例2制备的SaAH蛋白溶液作为供试液，检测单位体积供试液的酶活。检测实施例2制备的SaAH蛋白溶液中的蛋白浓度。将单位体积供试液的酶活除以单位体积供试液的蛋白含量，得到蛋白比活力，数值为2861U/mg。

实施例4、酰胺水解酶(SaAH蛋白)用于制备苯甲酸

1、实验过程

(1)取实施例2制备的SaAH蛋白溶液，用磷酸盐缓冲液(50mM、pH 6.0)稀释至450U/mL，作为供试液；

(2)反应物总体积为50mL，含有150mM的苯甲酰胺、450U/mL的SaAD蛋白溶液，采用PBS缓冲液(50mM、pH 6.0)，反应温度为40℃，搅拌速率为120rpm，反应时间为10h。

2、酰胺水解酶(SaAH蛋白)用于制备苯甲酸

反应结束后，经分析得知，苯甲酰胺的转化率为92.4％，这说明该酶在苯甲酸的制备方面具有较大的应用潜力。

序列表

<110> 中国石油大学（华东）

<120> 酰胺水解酶SaAH及其编码基因和应用

<130> 2021.6.8

<141> 2021-06-23

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 309

<212> PRT

<213> 盐螺旋菌(Salinispirillum sp.)

<400> 1

Met Ser Val Glu Ser Ser Phe Thr Val Thr Pro Gly Trp Leu Asn Trp

1 5 10 15

Tyr Asp Gly Pro Ala Lys Pro Lys Phe Lys Val Pro Ala Gly Ala Val

20 25 30

Asp Ala His Cys His Val Phe Gly Pro Gly Glu Gln Phe Pro Phe Ala

35 40 45

Pro Glu Arg Lys Tyr Thr Pro Cys Asp Ala Ser Lys Asp Gln Leu Phe

50 55 60

Ala Leu Arg Asp His Leu Gly Phe Ala Arg Asn Val Val Val Gln Ala

65 70 75 80

Thr Cys His Gly Ala Asp Asn Ser Ala Met Val Asp Ala Leu Gln His

85 90 95

Ser Asn Gly Met Ala Arg Gly Ile Ala Thr Val Lys Arg Ser Ile Ser

100 105 110

Asp Ala Glu Leu Gln Ala Leu Asp Ala Ala Gly Val Arg Gly Val Arg

115 120 125

Phe Asn Phe Val Lys Arg Leu Val Asp Phe Thr Pro Lys Glu Glu Leu

130 135 140

Met Glu Ile Ala Gln Arg Ile Ala Pro Leu Gly Trp His Ile Val Ile

145 150 155 160

Tyr Phe Glu Ala Val Asp Leu Pro Glu Leu Trp Asp Phe Phe Thr Ala

165 170 175

Leu Pro Thr Thr Val Val Val Asp His Met Gly Arg Pro Asp Val Thr

180 185 190

Lys Pro Val Asp Gly Glu Glu Phe Gln Arg Phe Val Arg Leu Met Asp

195 200 205

Glu His Glu Asn Ile Trp Ser Lys Val Ser Cys Pro Glu Arg Leu Ser

210 215 220

Val Ser Gly Pro Lys Ala Leu Asn Gly Glu Gln Gln Ala Tyr Gln Asp

225 230 235 240

Val Val Pro Phe Ala Arg Phe Leu Val Glu Arg Phe Pro Asp Arg Val

245 250 255

Leu Trp Gly Thr Asp Trp Pro His Pro Asn Leu Lys Asp His Met Pro

260 265 270

Asp Asp Gly Leu Leu Val Asp Phe Ile Pro His Ile Ala Pro Thr Ala

275 280 285

Glu Leu Gln His Lys Leu Leu Ile Asp Asn Pro Met Arg Leu Tyr Trp

290 295 300

Pro Glu Glu Val Lys

305

<210> 2

<211> 930

<212> DNA

<213> 盐螺旋菌(Salinispirillum sp.)

<400> 2

atgagtgttg agagtagttt tactgtgacg cccggctggt tgaattggta tgacggcccg 60

gcgaaaccca agtttaaggt gccagcaggt gccgtagacg cgcactgcca cgtgtttggc 120

cctggcgagc agttcccgtt tgcgcccgag cgcaaataca ccccgtgcga cgcgtcgaaa 180

gaccagttgt ttgccttgcg tgaccacctg ggctttgccc gcaatgtagt ggtgcaggcc 240

acctgtcacg gtgcagacaa cagcgccatg gtcgacgcct tgcagcattc caacggcatg 300

gcgcgcggta ttgcgaccgt gaaacgcagc atctcagacg cggaactgca ggcgttggac 360

gccgccggcg tgcgcggcgt acgatttaac ttcgtgaagc ggttggtgga ttttacgccg 420

aaagaagagc tgatggagat cgcccagcgc atcgcgccct tgggctggca cattgtcatc 480

tattttgaag cggtcgacct gcctgagctg tgggacttct tcaccgcctt accgaccacc 540

gtggtggtcg accacatggg gcggccggat gtcaccaagc cggttgacgg cgaagagttc 600

cagcgctttg tgcgcttgat ggacgagcac gagaatatct ggtcgaaggt gagctgccct 660

gagcgcttga gcgtcagtgg gcctaaagcg ttgaacggcg aacagcaggc gtatcaagat 720

gtggtgccct ttgcgcgctt tttggttgaa cgcttccctg accgtgtgtt gtggggcacc 780

gactggccgc acccgaactt gaaagaccac atgccagacg acggcctgct ggtggatttc 840

attccgcaca tcgcgccaac ggccgaattg caacacaaat tattgatcga caaccccatg 900

cgattgtact ggccggaaga ggttaaataa 930

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cgcggatcca tgagtgttga g 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ccgctcgagt tatttaacct cttcc 25

Claims

1.一种酰胺水解酶基因编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列由序列表中序列1所示。

2.一种编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.权利要求2所述基因的核苷酸序列如序列表2所示。

4.权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物。

5.权利要求1所述蛋白质作为酰胺水解酶的应用。