CN104726471A - 一种来自淀粉酶产色链霉菌的l-谷氨酸氧化酶基因及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来自淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因及其制备方法和应用，具体涉及一种从土壤中筛选获得的淀粉酶产色链霉菌克隆、编码L-谷氨酸氧化酶基因，将该基因人工合成并重组到大肠杆菌体内，得到的一种具有L-谷氨酸氧化酶活性的重组菌。所述的L-谷氨酸氧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1，全长1974bp，其编码的蛋白质序列如SEQ ID No.2。该基因所编码L-谷氨酸氧化酶能特异性的催化L-谷氨酸，可作为L-谷氨酸含量检测用酶，应用于食品工业和临床生化检测领域。

Description

一种来自淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种来自淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因及其制备方法和应用。

背景技术

L-谷氨酸氧化酶(LGOX)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的黄素蛋白酶类，能专一地催化谷氨酸氧化成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢，通过过氧化氢含量的变化可以方便地测定谷氨酸的含量，利用L-谷氨酸氧化酶研制出谷氨酸检测试剂盒和生物传感器，在食品工业和临床生化检测领域有着广泛的应用(李玲等.L-谷氨酸氧化酶的分离纯化及酶学性质的研究.中国酿造.2012，31(1)：140-143)。

1983年，Kusakabe等从一株链霉菌X-119-6(Streptomyces sp.X-119-6)菌株中分离出底物特异性的L-谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸为底物的Km值仅为0.2mM，该酶耐热性较强，除催化L-谷氨酸氧化外，仅对L-天冬氨酸有微弱的催化作用(Kusakabe H et al.Purification andpurification of a new enzyme，l-glutamate oxidase，from Streptomycessp.X-119-6grown on wheatbran.Agric Biol Chem.1983，47：1323-1328)，2006年日本Yamasa公司构建了链霉菌X-119-6基因组文库，通过探针筛选获得了LGOX基因，该基因长2103bp，编码701个氨基酸，含有14个信号肽序列，成熟的蛋白也是由α、β、γ三个亚基组成，一般组成二聚体形式，分子量大约为140KDa。他们构建大肠杆菌强启动子调控LGOX基因表达的载体，转化到大肠杆菌中，实现了LGOX前体蛋白在大肠杆菌的高效表达，表达的前体蛋白经过内切蛋白酶处理后可以变成活性蛋白(US patent7109008)。目前该产品转由Kikkoman公司生产并垄断了市场。

由于LGOX生产被国外企业控制，我国在上述领域研究相对滞后，而至今所筛选到的L-谷氨酸氧化酶产生菌的产酶能力大多很低，即使经过诱变，产酶能力也不高，因此获得新型LGOX基因并实现基因工程化生产成为解决该酶来源的根本途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来自淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因及其制备方法和应用，利用基因合成法制备淀粉酶产色链霉菌L-谷氨酸氧化酶基因，并对该基因进行表达和酶的底物谱分析，以证明其能特异性催化L-谷氨酸，具有作为L-谷氨酸含量检测用酶的前景。

本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的来自淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，其编码的蛋白质序列如SEQ ID No.2。

所述的淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的获取方法如下：

利用含50ppm重铬酸钾的高氏一号培养基(高氏一号培养基：可溶性淀粉20g/L，KNO₃lg/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，NaCl0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.01g/L，琼脂20g/L，pH＝7.4)，从土壤微生物中筛选产L-谷氨酸氧化酶的菌株，菌株在显色液(0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.5)，0.07％的4-氨基安替吡啉，0.8％的L-谷氨酸，0.1％的苯酚，2000U/L的辣根过氧化物酶)中显红色即为产L-谷氨酸氧化酶。

将筛选得到的菌落提取总DNA，根据L-谷氨酸氧化酶保守盒子序列设计引物

Primer A：5’-AGTACGCGGAGGCCGGCGCCAT-3’和Primer B：

5’-GCTGAACTCCAGCAGCACCTTGGT-3’为扩增引物，以总DNA为模板，获得一段984bp的PCR片段。以此序列为基础，采用Genome Walking Kit试剂盒(大连宝生物公司)获取其两侧的未知序列，查找完整的开放阅读框，从而获得该L-谷氨酸氧化酶基因的全序列。

所述的碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的L-谷氨酸氧化酶基因可通过化学合成方法得到。即采用大量重叠的引物通过两步PCR进行全基因的合成(PTDS)(Nucleic AcidsResearch，2004，32：e98)。

具体合成方法包括以下步骤：

引物设计：设计长度大概为60bp左右的覆盖整个L-谷氨酸氧化酶基因的寡核苷酸的序列49个，其中每相邻的两个寡核苷酸序列有20个碱基的重复。

PCR扩增：利用PCR进行L-谷氨酸氧化酶基因扩增。以SLG1-SLG12；SLG13-SLG24；SLG25-SLG36；SLG37-SLG48为引物，利用PCR进行扩增SLG1、SLG2、SLG3、SLG4片段，在50μl反应体系中，其中内侧引物SLG2-SLG11、SLG14-SLG23、SLG26-SLG35、SLG38-SLG47引物的添加量为2ng，外侧引物SLG1、SLG12、SLG13、SLG24、SLG25、SLG36、SLG37、SLG48个引物添加量为30ng(引物序列见实施例4)，扩增条件为：94℃预热1mm；94℃，30s，50℃，30s，72℃，lmin。共25个循环。扩增片断通过琼脂糖凝胶回收，然后作为模版进行拼接，扩增小片段SLG1、SLG2、SLG3、SLG4各1μg，以SLG1和SLG49为引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，3min。共25个循环。转化：PCR结束后，用1％琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，在DH5a感受态中高效转化，获得长度为1974bp的SEQ ID No.1序列的阳性克隆，即为本发明的L-谷氨酸氧化酶基因，经序列测定，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

将上述获得的阳性克隆利用BamH I和Sac I进行双酶切后，通过T4DNA连接酶将该基因与载体pET-28a(NEB公司)4℃连接2小时，得到重组质粒pET-pGOX，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)，将菌液涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基(15g/L琼脂，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，磷酸缓冲液pH＝7.0)，37℃过夜培养。次日，挑取单菌落，接种于50ml液体LB培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，磷酸缓冲液pH＝7.0)中，37℃摇床直到菌液的浓度达到OD₆₀₀为0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃诱导12h。9000rpm离心去上清，收集湿细胞。取湿细胞用生理盐水洗涤两次，再悬浮于pH6.5、100mM的磷酸-磷酸钠缓冲液中(1g湿细胞/10ml缓冲液)得悬浮液，用超声波处理悬浮液(功率为400W，超声4s，间歇6s，重复99轮)，9000rpm离心取上清，即得粗酶液。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP(AmershamBiosciences公司)对其进行蛋白表达纯化，获得L-谷氨酸氧化酶前体蛋白，然后加入千分之一当量的Factor Xa蛋白酶(New England Biolabs公司)在4℃下处理6h，即得本发明的具有活性的L-谷氨酸氧化酶蛋白。

本发明的有益效果在于：本发明从土壤中筛选获得一株产L-谷氨酸氧化酶的淀粉酶产色链霉菌，并通过培养、提取总DNA和PCR扩增后，得到了如SEQ ID No.1所示的L-谷氨酸氧化酶基因。该L-谷氨酸氧化酶底物专一性很强，能特异性地催化L-谷氨酸，可适用于L-谷氨酸含量检测。

附图说明

图1为本发明的L-谷氨酸氧化酶基因的PCR扩增产物电泳图。

图2为本发明的L-谷氨酸氧化酶的SDS-PAGE电泳图，其中1为用FactorXa蛋白酶处理过后的L-谷氨酸氧化酶蛋白，含亚基α、β、γ，2代表用HisTrap HP试剂盒纯化的在大肠杆菌BL21(DE3)过量表达的L-谷氨酸氧化酶前体蛋白，3为蛋白分子量MARKER。

具体实施方式

以下结合具体实施方式详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书【J.萨姆布鲁克、E.F弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社】。

实施例1  菌种分离

称取土壤样品1g，加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取100μL溶液涂布于含有50ppm重铬酸钾的高氏一号培养基中，30℃下培养4天。根据菌落形态和大小挑取菌落分别对应地接入对照与显色两种平皿中(平皿中均为高氏一号培养基)，30℃下培养3天，取显色平皿，将显色液浸过的滤纸置于其菌落上，标记显色快、红色深的菌落在对照平皿上对应菌落，挑取该菌落在高氏一号培养基上划线分离，30℃下培养3天，挑取单菌落保藏备用。

实施例2  总DNA提取及菌种鉴定

将分离获得的菌株接种于20mL液体培养基(酵母粉3g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉5g/L，大豆蛋白胨5g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L，pH＝7.0)中，30℃下培养3天，培养液以8000r/min速度离心5分钟，得到菌体沉淀。

取0.15g新鲜菌体于研钵(-20℃预冷)中，反复液氮研磨至细粉状，迅速装入1.5mL离心管中，加入TE缓冲液550μL，65℃预热的20％(w/v)SDS溶液30μL，斡旋震荡5分钟，接着加入浓度为20mg/mL的蛋白酶K20μL，混匀，37℃水浴1小时，加等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v/v)抽提，轻轻颠倒混匀，10000r/min速度离心10分钟；吸取上清至新离心管中，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)抽提，10000r/min速度离心5分钟，吸取上清与等体积异丙醇(4℃预冷)混匀，10000r/min速度离心5分钟，弃上清。沉淀用70％(v/v)酒精冲洗，干燥，加40μL TE缓冲液溶解，所得总DNA于-20℃保存。

以抽提的总DNA为模板，利用细菌的16s rRNA特异性引物进行扩增。扩增的引物为P16SF：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’和P16SR：5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'。以KODPlus(Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30s，55℃30s，72℃120s，扩增30个循环。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，取10μL直接与T/A载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。将连接产物转化入大肠杆菌在DH5α感受态细胞中，获得阳性克隆，测序。测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到菌株与淀粉酶产色链霉菌中的16s rRNA有99％的同源性，说明该菌株为淀粉酶产色链霉菌。

实施例3  淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的获取

根据L-谷氨酸氧化酶保守盒子序列设计引物：

Primer A：5’-AGTACGCGGAGGCCGGCGCCAT-3’和

Primer B：5’-GCTGAACTCCAGCAGCACCTTGGT-3’为扩增引物，以总DNA为模板，获得一段984bp的PCR片段。PCR反应条件为：94℃30s，55℃30s，72℃90s，扩增30个循环。用1％琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，在DH5a感受态中高效转化，获得阳性克隆，测序。以此序列为基础，采用GenomeWalking Kit试剂盒(大连宝生物公司)获取其两侧的未知序列，查找完整的开放阅读框，从而获得该L-谷氨酸氧化酶基因的全序列。

为扩增5’端未知序列，设计引物：FSP1：5’-AGTTGCCGCGCTTGTCGGGTTCAC-3’，FSP2：5’-TGAAGGAGGTGTACGTCACCG-3’和FSP3：5’-AGTCCGAGCTTGTCGACGAG-3’。以总DNA为模板，FSP1和试剂盒中的AP3Primer为引物，进行第一轮PCR反应。反应条件为：94℃1min，98℃1min；[94℃30s，68℃1min，72℃2min(5个循环)]；94℃30s，25℃3min，72℃2min；[94℃30s，68℃1min，72℃2min，94℃30s，68℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min(15个循环)]；72℃10min。

取第一轮PCR反应产物1μL作为模板，以FSP2和试剂盒中的AP3Primer为引物，进行第二轮PCR反应。反应条件为：[94℃30s，68℃1min，72℃2min，94℃30s，68℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min(15个循环)]；72℃10min。

取第二轮PCR反应产物1μL作为模板，以FSP3和试剂盒中的AP3Primer为引物，进行第三轮PCR反应。反应条件为：[94℃30s，68℃1min，72℃2min，94℃30s，68℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min(15个循环)]；72℃10min。将第三轮PCR反应的产物用1％琼脂糖胶回收，测序，获得5’端未知序列682bp。

用同样的方法扩增3’端未知序列，设计引物：

RSP1：5’-TGGAGACCGTCGCCGAGAACG-3’，RSP2：5’-ATCGTCACCATCCCGTTCTCCG-3’和RSP3：5’-TACGACTCGGCCACCAAGGTGCT-3’。对第三轮PCR反应的片段进行测序，获得3’端未知序列759bp。

对三段序列进行拼接和分析，寻找阅读编码框，其中包含了一个1974bp的阅读框，即为本发明的L-谷氨酸氧化酶基因，其序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

在阅读框的左右两侧设计引物：Primer C：5’-GGATCCATGACCGAGACTCCACGG和Primer D：5’-GAGCTC TCAGGCCGTGTGGACCTCC为扩增引物，以总DNA为模板，对1974bp的阅读框进行PCR扩增。将回收片段用BamHI和SacI双酶解，与pG251表达载体连接。

实施例4  基因合成法合成来源于淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因

通过基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)合成本发明的淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，所用的引物如下：

SLG1  ATGACCGAGACTCCACGGGACAACTCCGCCACCCGTGCACGCTGGCAGACGTGTCTCAAG

SLG2  CCTTGTCGTCCGGCCCGACGAGGAGGAGTTCGCGGGCGAGCTTGAGACACGTCTGCCAGC

SLG3  CGTCGGGCCGGACGACAAGGACCTCAAACTCAGCTATCTCCACACCCTGATCGACACGGG

SLG4  GAGGATCTTCTTGCGTGGGTGGTGGGTGGGGCCGAGGCGGCCCGTGTCGATCAGGGTGTG

SLG5  ACCCACGCAAGAAGATCCTCGTCATCGGCGCCGGCATCACCGGCCTCGTCGCCGGCCGCC

SLG6  GCCTCGATGATGGTGACGTCGTAGCCGGCGTCCTTGAGCAGGCGGCCGGCGACGAGGCCG

SLG7  GACGTCACCATCATCGAGGCCAATGAAAGCCGCGTCGGCGGACGCATCAAGACCTTCCGC

SLG8  ACTGGGCGGCGTCGTCGAAGGGCTGGTGGTGCTTGGTGGCGCGGAAGGTCTTGATGCGTC

SLG9  CTTCGACGACGCCGCCCAGTACGCGGAGGCCGGCGCCATGCGGCTGCCCGACTTCCACCC

SLG10 TCGGCCGAGTCCGAGCTTGTCGACGAGGGCGAGGACGAGCGGGTGGAAGTCGGGCAGCCG

SLG11 ACAAGCTCGGACTCGGCCGACGCCAGTTCTACAACGTGGACGTGGGCCCCTCCACCGGCA

SLG12 GAGGTGTACGTCACCGGGGGTACGGGGACCTCGGGGCCGCTGCCGGTGGAGGGGCCCACG

SLG13 CCCCCGGTGACGTACACCTCCTTCACCGGCCAGACGTGGACCAACGGCGACGACAGTCCC

SLG14 GGATCCAGGAGTTGCCGCGCTTGTCGGGTTCACGGAAGTCGGGACTGTCGTCGCCGTTGG

SLG15 GCGCGGCAACTCCTGGATCCGCGCCAACCGCGTCCAGGTGCGGAGGGCCGACTACACCGC

SLG16 GCCGGTGAGGTGGAAGCCCTCGTTGATCCGCTCAGGACTCGCGGTGTAGTCGGCCCTCCG

SLG17 AGGGCTTCCACCTCACCGGCGACGAGGTCCGCGCCCCCGTCGTGAAGATGGTCGACGACG

SLG18 TCGACGACGTCGGAGTAGTAGTCGCGCACGCTCTCCAGCGCGTCGTCGACCATCTTCACG

SLG19 TACTACTCCGACGTCGTCGACGGCAAGCGTGTCAACAAGCCGTTCGACGAGTGGGTCGAG

SLG20 TGGAGTAGCCGTCGAAGTCGCGGATCACCCGGGCCCAGCCCTCGACCCACTCGTCGAACG

SLG21 CGACTTCGACGGCTACTCCATGGGCGGCTTCCTGCGCGACCACGCCGGGCTCAGCGACGA

SLG22 TGAGGACGTGTTCTCCAGGGTTCCGACGGCCTCGATCGCCTCGTCGCTGAGCCCGGCGTG

SLG23 CCCTGGAGAACACGTCCTCACGGCTGCATCTCTCCTTCTTCCACAGCTTCCTGAGCCGCA

SLG24 CCCGGTATCTCCCAGTAGCGGACGGTGGGGTTGATGTCGCTGCGGCTCAGGAAGCTGTGG

SLG25 CGCTACTGGGAGATACCGGGCGGCAGTTGGCGTCTGCCGCACGCCCTCCACGAGGGCCTG

SLG26 CGAGGCGGATCATGCGGTGCCCGAGCCGCACCTCGTCGCGCAGGCCCTCGTGGAGGGCGT

SLG27 GCACCGCATGATCCGCCTCGAATACCACGACCCCAGCCGCGACGCCGACCCCGAGGGCAC

SLG28 GGTCTCCACGGTCACGCCCCATCCGTCGGGTCCGACGGCGGTGCCCTCGGGGTCGGCGTC

SLG29 GGGGCGTGACCGTGGAGACCGTCGCCGAGAACGACCCGCAGGCCCCGCCTCGCCGGTGGA

SLG30 AGGGCGGAGAACGGGATGGTGACGATCGCCAGGTCCGCGGTCCACCGGCGAGGCGGGGCC

SLG31 ACCATCCCGTTCTCCGCCCTGCGCTTCGTGGAGATCGTCCCCTCGATGTCGTACAAGAAG

SLG32 TGGTGGCCGAGTCGTAGTGGGTCTCGACGATGGCGCGGCGCTTCTTGTACGACATCGAGG

SLG33 CCACTACGACTCGGCCACCAAGGTGCTGCTGGAGTTCAGCCACCGGTGGTGGGAGTTCAC

SLG34 CGGTGCGATCCTCTCCAGCTCCTCGCGCCAGTCGTCCTCGTGGTGGCCGAGTCGTAGTGG

SLG35 AGCTGGAGAGGATCGCACCGGGCGTCTACGAGTACTACCGGCTGGGCCCGGAGGCGGCCG

SLG36 GCGTCCGCCTCGGCGAGCGTGGGCATACGGGCGGGCTCGCCGGCCGCCTCCGGGCCCAGC

SLG37 ACGCTCGCCGAGGCGGACGCCGGCCTGCTCGGTGCCGCCGTCAAGGACAGCGGCGTCACC

SLG38 CGCGCAGCGGCATGGTGCTGCCGATCTGCCGCATCTCCTCGGTGACGCCGCTGTCCTTGA

SLG39 CAGCACCATGCCGCTGCGCGGTCCCGCCCTCCGCCCCGCCACTCACAGCTTCGGCGGGGG

SLG40 CGGGTAATACATGAACCGGTTGGGGTTGTCGGTGGCGGAGCCCCCGCCGAAGCTGTGAGT

SLG41 ACCGGTTCATGTATTACCCGTCGCACCGGGTCGAGGGCAGCACCGGCGGAGTGGTGCTCG

SLG42 GAGTCCCAGCGCGCGGCGTCGTCGGACCAGGAGTACGAGGCGAGCACCACTCCGCCGGTG

SLG43 GACGCCGCGCGCTGGGACTCGATGCGGAGCGCGGAGCGCTACGTCTACGCCCTGCGCAAC

SLG44 TGAAGAACACCTCGATGCGTCGGCCGTGCAGGGCCTGGAGGTTGCGCAGGGCGTAGACGT

SLG45 ACGCATCGAGGTGTTCTTCACCGGGCGCGGCGCCACCAAGAGCTGGGCCCGCGACCCGTA

SLG46 CATCTGGTGCGCGGTGTAGATCGCGGCCTCGCCGAAGGCGTACGGGTCGCGGGCCCAGCT

SLG47 TCTACACCGCGCACCAGATGACCAGCTTCCACCTGGACGCCTCCCGGCCCGAAGGCCCCG

SLG48 CATCTGGTGCGCGGTGTAGATCGCGGCCTCGCCGAAGGCGTACGGGTCGCGGGCCCAGCT

SLG49 TCAGGCCGTGTGGACCTCCAGGGCGCCCTCGATCCAGGCGTGCTTGAGGGAGGT

以SLG1-SLG12；SLG13-SLG24；SLG25-SLG36；SLG37-SLG48为引物，利用PCR进行扩增SLG1、SLG2、SLG3、SLG4片段，在50μl反应体系中，其中内侧引物SLG2-SLG11、SLG14-SLG23、SLG26-SLG35、SLG38-SLG47引物的添加量为2ng，外侧引物SLG1、SLG12、SLG13、SLG24、SLG25、SLG36、SLG37、SLG48个引物添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，1min。共25个循环。扩增片断通过琼脂糖凝胶回收，然后作为模版进行拼接，扩增小片段SLG1、SLG2、SLG3、SLG4各1μg，以SLG1和SLG49为引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，3min。共25个循环。

实施例5  L-谷氨酸氧化酶基因的大肠杆菌表达

将实施例4合成的L-谷氨酸氧化酶基因用BamH I和Sac I酶切后，与载体pET-28a(NEB公司)连接得到重组质粒pET-pGOX，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)，将转化子涂布于LB固体培养基中37℃培养16h。挑取单菌落接种于50mL含氨苄(终浓度100mg/L)的LB液体培养基中，37℃振荡培养5h，OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃诱导12h。将所得发酵培养液9000rpm离心去上清，收集湿细胞。取湿细胞用生理盐水洗涤两次，再悬浮于pH6.5、100mM的磷酸-磷酸钠缓冲液中(1g湿细胞/10ml缓冲液)得悬浮液，用超声波处理悬浮液(功率为400W，超声4s，间歇6s，重复99轮)，9000rpm离心取上清，即得粗酶液。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP(Amersham Biosciences公司)对其进行蛋白表达纯化，获得L-谷氨酸氧化酶前体蛋白，然后加入千分之一当量的Factor Xa蛋白酶(New England Biolabs公司)在4℃下处理6h，获得具有活性的L-谷氨酸氧化酶蛋白。

经SDS-PAGE电泳检测，前体蛋白大小约70kDa，用Factor Xa蛋白酶处理后得三个亚基α、β、γ，分子量分别约为42kDa，16kDa和10kDa，与预测值相符(参看图1)。

实施例6  L-谷氨酸氧化酶基因的酶活测定

L-谷氨酸氧化酶活力测定：反应体系为1ml，包含pH6.5、100mM磷酸钠缓冲液，1mM的4-氨基安替安替吡啉，10mM的L-谷氨酸，10mM的苯酚，2000U/L的辣根过氧化物酶)在30℃下反应，使用分光光度计测定505nm处吸光值。酶活定义为，每分钟反应生成1pmol过氧化氢所需的酶量为一个酶活单位U。蛋白含量采用Brandford法测定。

采用上述方法测定实施例5所得经Factor Xa蛋白酶处理后L-谷氨酸氧化酶活力，结果为：L-谷氨酸氧化酶的反应活力为29.8U/mg。

实施例7、L-谷氨酸氧化酶的底物谱

反应体系为1ml：取实施例5制得的经Factor Xa蛋白酶处理后的L-谷氨酸氧化酶10μL，加入包含pH6.5、100mM磷酸钠缓冲液，1mM的4-氨基安替安替吡啉，10mM的苯酚，2000U/L的辣根过氧化物酶的反应液中，分别加入各种底物(10mM)，30℃下反应2min，使用分光光度计测定505nm处吸光值。结果如表1所示。

表1  L-谷氨酸氧化酶的底物谱

根据表1的底物谱研究所示：本发明的L-谷氨酸氧化酶，底物专一性很强，能特异性地催化L-谷氨酸，可适用于L-谷氨酸含量检测。

Claims (4)

1.一种源于淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)的L-谷氨酸氧化酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的L-谷氨酸氧化酶基因，其特征在于，其编码的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。

3.权利要求1或2所述的L-谷氨酸氧化酶基因的制备方法，其特征在于，是将淀粉酶产色链霉菌中的L-谷氨酸氧化酶基因利用基因合成法制备而成。

4.权利要求1或2所述的L-谷氨酸氧化酶基因在L-谷氨酸含量检测中的应用。