CN104726472A - 来自阿富汗链霉菌的l-谷氨酸氧化酶基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及来自阿富汗链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因及其应用，具体涉及一种从土壤中筛选获得能够产生L-谷氨酸氧化酶的阿富汗链霉菌，通过同源克隆方法从该菌中克隆编码L-谷氨酸氧化酶基因，将该基因人工合成并重组到大肠杆菌体内，得到的一种具有L-谷氨酸氧化酶活性的重组菌。所述的L-谷氨酸氧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1，全长2073bp，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO2。该基因所编码L-谷氨酸氧化酶能特异性的催化L-谷氨酸，可作为L-谷氨酸含量检测用酶，应用于食品工业和临床生化检测领域。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种来自淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因及其制备方法和应用。
背景技术
1983年，日本人Kamei等首次从浅紫链霉菌(Streptomyces violascens)麦麸培养基抽提物中发现一种能催化谷氨酸氧化产生α-酮戊二酸和过氧化氢的酶，该酶是典型的氧化酶而不是脱氢酶，NAD+，NADP+不能作为该酶的电子受体，因此将其命名为L-谷氨酸氧化酶(L-Glutamateoxidase，LGOX)。该酶的分子量约为60KD，具有黄素蛋白(FAD)的特征性吸收光谱(吸收峰为490nm)，每摩尔酶中含有1个摩尔的FAD(Chemical&pharmaceutical bulletin，1983，31，1307-1314)。底物特异性研究表明，在pH5.0-6.5范围内，它能有效地催化L-谷氨酸的氧化，并且对L-谷氨酰胺、L-酪氨酸和L-组氨酸有微弱的氧化作用；在pH6.8时，对L-谷氨酰胺和L-组氨酸的相对活性分别为L-谷氨酸的32.1％和13.1％，Km值分别3.3和5.0mM。在pH5.0时，对L-谷氨酸和L-谷氨酰胺的Km值分别为1.1mM和10mM。该酶的稳定性尚好，在pH3.0-7.0范围内，37℃可稳定1小时(Chemical&pharmaceutical bulletin，1983，31，3609-3616)。
同年，Kusakabe等从另外一株链霉菌X-119-6(Streptomyces sp.X-119-6)菌株中分离出特异性更好的L-谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸为底物的Km值仅为0.2mM。该酶分子量大约为140000，由三个亚基组成，每个酶分子上结合有2个FAD。最适pH为7.0-8.0。该酶耐热性较强，在pH5.5的条件下，65℃加热15分钟不失活；75℃加热15分钟，活性为87％；85℃加热15分钟，活性仍能保留47％。该酶除催化L-谷氨酸氧化外，仅对L-天冬氨酸有微弱的催化作用(在pH7.4时，相对活性为L-谷氨酸的0.6％)(Agricultural and Biological Chemistry，1983，47，1323-1328)。1989年，德国Bohmer等从内涂链霉菌(Streptomyces endus)中分离纯化到对L-谷氨酸完全特异的L-谷氨酸氧化酶。其分子量为90000，由两个亚基构成，亚基分子量为50000，每个亚基含有一个非共价结合的FAD。在pH7.0时对L-谷氨酸km值为1.1mM(EuropeanJournal of Bi℃hemistry，1989，182，327-332)。2001年，台湾Chen等从普拉特链霉菌NTU3304(Streptomyces platensis NTU3304)纯化获得L-谷氨酸氧化酶，该酶对L-谷氨酸专化性好，用作生物传感器时只对L-谷氨酸反应(Canadian Journal of Microbiology，2001，47，269-275)；2004年俄罗斯Sukhacheva等筛选到一株产L-谷氨酸氧化酶的链霉菌Streptomycessp.Z-11-6，经过亚硝酸诱变，酶的比活为50.8U/mg，该酶特异性好，只氧化L-谷氨酸，不受其它氨基酸的影响(Applied Bi℃hemistry and Microbiology，2004，40，146-150)。2004年，泰国Wachiratianchai等从另一株链霉菌Streptomyces sp.18G中纯化获得了一个新的L-谷氨酸氧化酶，该酶由两个亚基组成分子量为120000，最适pH为pH7.0，对L-谷氨酸底物比较专一，对D-谷氨酸和D-天冬氨酸的相对活性只有0.79％和0.53％(Journal of Biotechnology，2004，7，277-284)。
早在90年代初华东理工大学李友荣教授在寻找L-谷氨酸氧化酶产生菌方面做了一系列工作，他们报道从土壤分离到能产生L-谷氨酸氧化酶链霉菌菌株，其后通过对该菌株进行诱变，理性化筛选获得了稳定的高产菌株N14，经发酵后，每毫升发酵液中酶活性可达14.83U(华东化工学院学报，1993，19(5)，567-573)，远远高于国外报道的产酶量，可惜对酶的性质等未做进一步的研究报道，该菌种也没有开发出产品。
酶法分析是国际公认的谷氨酸分析方法，已经被多个国际权威组织采纳：如国际果汁生产协会(IFU)、欧盟果蔬汁及饮料生产联盟(AIJN)、中欧酿造分析委员会(MEBAK)等均利用酶法进行谷氨酸检测。然而，在谷氨酸酶法检测中使用最多的是谷氨酸脱氢酶，如美国Bio Vision公司谷氨酸检测试剂盒、Sigma公司推出的谷氨酰胺和谷氨酸检测试剂盒、台湾Abnova公司谷氨酸检测试剂盒等等。以L-谷氨酸氧化酶进行谷氨酸监测很早就在食品和医疗卫生领域开展。如1986年，Kamei等就利用自己提取的LGOX建立起测定丙氨酸氨基转氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基转氨酶(AST)的荧光分析方法，以高香草酸为色原，在过氧化物酶的催化下，H202与高香草酸反应形成荧光物质，通过测定荧光强度而求得酶活性(Chemical&pharmaceutical bulletin，1986，34，409-412)。我国至今还没有研发出谷氨酸检测试剂盒，苏州艾杰生物科技有限公司2007年曾试图开发以谷氨酸氧化酶为基础的谷氨酸测定试剂盒(中国专利2007100233857)，但是至今没有应用，一个重要的制约因素为L-谷氨酸氧化酶的供给问题没有解决。
L-谷氨酸氧化酶还可以广泛地应用于生物传感器，由于谷氨酸在LGOX催化下产生H2O2，H2O2在一定的电位下能氧化，导致局部pH的变化，因此通过测定H2O2氧化电流的增加就能间接地测定谷氨酸的含量。最早日本人Karube利用微型氧电极研制出谷氨酸氧化酶电极，利用此电极测定溶液中谷氨酸含量范围在5-50mM，但是该电极响应时间长达5分钟(Biosensors，1987，2，471)；1989年德国Wollenberger研制的基于谷氨酸氧化酶的酶电极，响应时间短、选择性较好，利用该LGOX生物传感器能在谷氨酸生产过程中进行有效的监测(Biosensors，1989，4，381)。由于谷氨酰胺能在转氨酶催化下产生谷氨酸，将转氨酶与LGOX共同固定在电极膜上，也能用于测定液体中谷氨酰胺含量(US patent4780191)。在动物细胞培养中，谷氨酰胺对细胞的生长非常关键，利用双酶法研制的传感器在动物细胞培养中得到很好的应用(US patent5411866)。利用LGOX制成的更精细的生物传感器还可以用于脑组织中谷氨酸含量测定[14]，如：2011年美国人Braeken将丙氨酸氨基转氨酶和LGOX结合，制造出双酶电极传感器，由于L-谷氨酸在LGOX氧化产生的α-酮戊二酸可以作为转氨酶的底物，导致底物循环利用，从而使信号增强，该电极可以用于测定脑细胞中谷氨酸的变化，诊断精神疾病(US patent20110003322A1)。其它一些转氨酶如ALT和AST都能将氨基转化到α-酮戊二酸上，产生L-谷氨酸，因此这些酶的活性均可以通过谷氨酸氧化酶电极测定出来，L-谷氨酸氧化酶在诊断医学中的应用前景非常。
寻找L-谷氨酸氧化酶产生菌的研究至今方兴未艾，然而，至今所筛选到的L-谷氨酸氧化酶产生菌的产酶能力都很低，即使经过诱变，产酶能力也不高，因此实现基因工程化生产成为解决该酶来源的根本途径。
2000年，台湾国防医学院Yu-Tien Liu教授首先通过筛库法获得了普拉特链霉菌NTU3304中的LGOX基因，该基因长2130bp，在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中表达的前体蛋白为78KDa，且含有信号肽序列，成熟的LGOX由三个亚基组成，分别称为α、β、γ，分子量分别为39，19和16KDa。三种亚基在前体多肽链中从N端到C端的排列顺序是α-γ-β。此酶属于黄素酶类，活性中心含一分子FAD(Canadian Journal of Microbiology，2001，47，269-275)。2006年日本Yamasa公司构建了链霉菌X-119-6基因组文库，通过探针筛选获得了LGOX基因，该基因长2103bp，编码701个氨基酸，含有14个信号肽序列，成熟的蛋白也是由α、β、γ三个亚基组成，一般组成二聚体形式，分子量大约为140KDa。他们构建大肠杆菌强启动子调控LGOX基因表达的载体，转化到大肠杆菌中，实现了LGOX前体蛋白在大肠杆菌的高效表达，表达的前体蛋白经过内切蛋白酶处理后可以变成活性蛋白(US patent7109008)。目前该产品转由Kikkoman公司生产并垄断了市场。
2009年Arima以蛇毒中的氨基酸氧化酶为模板建模，获得了链霉菌X-119-6中LGOX的三维结构模型。通过与氨基酸氧化酶结构比较发现：LGOX三维结构表面比氨基酸氧化酶多3个区域，其中一个区域构成LGOX的第二个底物入口；LGOX底物入口到活性中心处的过道更加狭长；此外在LGOX中，由于氨基酸氧化酶活性位点的异亮氨酸和甘氨酸分别由空间结构更大的色氨酸和精氨酸取代，使得LGOX活性区域更加狭小，这些结构的变化导致LGOX的底物更专一(FEBS Journal，2006，276，3894-3903)。Utsumi等人近来对该区域进行了初步研究，他们将精氨酸突变为丙氨酸后发现，LGOX的底物专化性消失，此时，LGOX变化为氨基酸氧化酶，可以催化多种氨基酸氧化(Bi℃hemical and Biophysical Research Communications，2012，417，951-955)。
由于LGOX生产被国外企业控制，我国在上述领域研究相对滞后，而至今所筛选到的L-谷氨酸氧化酶产生菌的产酶能力大多很低，即使经过诱变，产酶能力也不高，因此获得新型LGOX基因并实现基因工程化生产成为解决该酶来源的根本途径。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种L-谷氨酸氧化酶基因，该基因源自于阿富汗链霉菌。
本发明的另一个目的在于提供一种L-谷氨酸氧化酶基因的原核表达载体。
本发明的还有一个目的在于提供一种原核表达L-谷氨酸氧化酶在L-谷氨酸含量检测中的应用方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
所述的来自阿富汗链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No1，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO2。
所述的淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的获取方法如下：
利用含50ppm重铬酸钾的高氏一号培养基(高氏一号培养基：可溶性淀粉20g/L，KNO31g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，琼脂20g/L，pH＝7.4)，从黑龙江省牡丹江土壤微生物中筛选产L-谷氨酸氧化酶的菌株，菌株在显色液(0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.5)，0.07％的4-氨基安替安替吡啉，0.8％的L-谷氨酸，0.1％的苯酚，2000U/L的辣根过氧化物酶)中显红色即为产L-谷氨酸氧化酶。
将筛选得到的菌落提取总DNA，根据L-谷氨酸氧化酶保守盒子序列设计引物Primer A：5'-AGTACGCGGAGGCCGGCGCCAT-3’和Primer B：5'-GCTGAACTCCAGCAGCACCTTGGT-3’为扩增引物，以总DNA为模板，获得一段984bp的PCR片段。以此序列为基础，采用Genome Walking Kit试剂盒(大连宝生物公司)获取其两侧的未知序列，查找完整的开放阅读框，从而获得该L-谷氨酸氧化酶基因的全序列。
所述如序列表中SEQ ID No.1所示的L-谷氨酸氧化酶基因可通过化学合成方法得到。即设计大量重叠的引物通过两步PCR进行全基因的合成(PTDS)(Nucleic Acids Research，2004，32：e98)。具体合成方法包括以下步骤：
引物设计：设计长度约定为60bp的覆盖整个L-谷氨酸氧化酶基因的寡核苷酸的序列52个，其中每相邻的两个寡核苷酸序列有20个碱基的重复。
PCR扩增：利用PCR进行L-谷氨酸氧化酶基因扩增。其中，在100μl反应体系中，P2～P32共31个引物的添加量为2ng，两个外侧引物P1和P33的添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min，94℃30s，50℃30s，72℃10min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25个循环。
转化：PCR结束后，用1％琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，在DH5α感受态中高效转化，获得长度为1974bp的SEQ ID NO1序列的阳性克隆，即为本发明的L-谷氨酸氧化酶基因，经序列测定，其核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。
将上述获得的阳性克隆利用BamH I和Sac I进行双酶切得到，与表达载体相连接后转入大肠杆菌细胞中，能表达L-谷氨酸氧化酶。表达载体应当包含编码L-谷氨酸氧化酶以及至少一个能通过现有技术(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1994)构建的IPTG诱导的启动子(promoter)，含有能够通过亲和层析进行蛋白纯化的6个组氨酸。此外，表达载体还可以含有一些调节子(regulatory element)如：抑制子(repressor)、抗生素标记(如：氨苄青霉素、卡那霉素或新霉素等)或荧光标记(如：绿色荧光蛋白GFP)等。
一种表达载体，包括L-谷氨酸氧化酶基因SEQ ID No：1序列。
一种SEQ ID No：1序列转入原核生物细胞的方式，将SEQ ID No：1序列通过BamH I和Sac I进行双酶切与原核表达载体相连，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)，37℃摇床培养直到菌液的浓度达到OD600为0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃诱导12h。9000rpm离心去上清，收集湿细胞。取湿细胞用生理盐水洗涤两次，再悬浮于pH6.5、100mM的磷酸-磷酸钠缓冲液中(1g湿细胞/10ml缓冲液)得悬浮液，用超声波处理悬浮液(功率为400W，超声4s，间歇6s，重复99轮)，9000rpm离心取上清，即得粗酶液。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP(Amersham Biosciences公司)对其进行蛋白表达纯化，获得L-谷氨酸氧化酶前体蛋白，然后加入千分之一当量的蛋白酶(肠激酶、Factor Xa、Sgmp和凝血酶)在4℃下处理6-24h，即得本发明的具有活性的L-谷氨酸氧化酶蛋白。
L-谷氨酸氧化酶活力测定：反应体系为1ml，包含pH6.5、100mM磷酸钠缓冲液，1mM的4-氨基安替安替吡啉，10mM的L-谷氨酸，10mM的苯酚，2000U/L的辣根过氧化物酶，在37℃下反应10min，使用分光光度计测定505nm处吸光值。酶活定义为，每分钟反应生成1tmol过氧化氢所需的酶量为一个酶活单位U。按照谷氨酸氧化酶活力测定方法，检测发现源自阿富汗链霉菌谷氨酸氧化酶基因在大肠杆菌中表达的蛋白，以L-谷氨酸为底物最适的温度为40℃，最适pH值为8.0，该重组蛋白对底物L-谷氨酸反应专一。
本发明的有益效果在于：本发明从土壤中筛选获得一株产L-谷氨酸氧化酶的阿富汗链霉菌，并通过培养、提取总DNA和同源克隆，得到了如SEQ ID No1所示的L-谷氨酸氧化酶基因。该基因通过大肠杆菌表达纯化并利用蛋白酶处理，可以获得具有活性的成熟蛋白，降低了该酶从原始菌种中提取成本。该L-谷氨酸氧化酶底物专一性很强，能特异性地催化L-谷氨酸，可适用于L-谷氨酸含量检测。
附图说明
图1为本发明的L-谷氨酸氧化酶基因的原核表达载体。
图2为本发明的L-谷氨酸氧化酶的SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白分子量Marker，2代表用HisTrap HP试剂盒纯化的在大肠杆菌BL21(DE3)过量表达的L-谷氨酸氧化酶前体蛋白，3为用Factor Xa蛋白酶处理过后的L-谷氨酸氧化酶蛋白。
图3为本发明的谷氨酸氧化酶最适反应温度检测。
图4为本发明的谷氨酸氧化酶最适反应pH检测。
具体实施方式
以下结合具体实施方式详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书【J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社】。
实施例1、菌种分离
称取土壤样品1g，加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取100μL溶液涂布于含有50ppm重铬酸钾的高氏一号培养基中，30℃下培养4天。根据菌落形态和大小挑取菌落分别对应地接入对照与显色两种平皿中(平皿中均为高氏一号培养基)，30℃下培养3天，取显色平皿，将显色液浸过的滤纸置于其菌落上，标记显色快、红色深的菌落在对照平皿上对应菌落，挑取该菌落在高氏一号培养基上划线分离，30℃下培养3天，挑取单菌落保藏备用。
实施例2、总DNA提取及菌种鉴定
将分离获得的菌株接种于20mL液体培养基(酵母粉3g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉5g/L，大豆蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，pH＝7.0)中，30℃下培养3天，培养液以8000r/min速度离心5分钟，得到菌体沉淀。
取0.15g新鲜菌体于研钵(-20℃预冷)中，反复液氮研磨至细粉状，迅速装入1.5mL离心管中，加入TE缓冲液550μL，65℃预热的20％(w/v)SDS溶液30μL，斡旋震荡5分钟，接着加入浓度为20mg/mL的蛋白酶K20μL，混匀，37℃水浴1小时，加等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v/v)抽提，轻轻颠倒混匀，10000r/min速度离心10分钟；吸取上清至新离心管中，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)抽提，10000r/min速度离心5分钟，吸取上清与等体积异丙醇(4℃预冷)混匀，10000r/min速度离心5分钟，弃上清。沉淀用70％(v/v)酒精冲洗，干燥，加40μLTE缓冲液溶解，所得总DNA于-20℃保存。
以抽提的总DNA为模板，利用16s rRNA两端引物进行扩增。扩增的引物为16SR1：5’CAATGAGCTCGATACCCACT3’和16SF：5'TACGGCTACCTTGTTACGACTTC3’。以KODPlus(Toyobo日本)为TaqDNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30秒，55℃30秒，72℃120秒，扩增30个循环。循环结束后，加入2个单位的rtaq酶(宝生物工程(大连)有限公司)，72℃延伸300秒，扩增片段长1442bp(如下)。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。再将该载体转化入DH5α感受态中。克隆获得阳性质粒，利用通用引物测定克隆序列，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到菌株与阿富汗链霉菌中的16s rRNA有99％的同源性，说明该菌株为阿富汗链霉菌。
实施例3、阿富汗链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的获取
根据L-谷氨酸氧化酶保守盒子序列设计引物：Primer A：5’-AGTACGCGGAGGCCGGCGCCAT-3’和Primer B：5’-GCTGAACTCCAGCAGCACCTTGGT-3’为扩增引物，以总DNA为模板，获得一段984bp的PCR片段。PCR反应条件为：94℃30s，55℃30s，72℃90s，扩增30个循环。用1％琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，在DH5α感受态中高效转化，获得阳性克隆，测序。以此序列为基础，采用GenomeWalking方法获取其两侧的未知序列，查找完整的开放阅读框，从而获得该L-谷氨酸氧化酶基因的全序列。
为扩增5’端未知序列，设计兼并引物：P144：5′ATGACCGARSATCACSMRGYKG和巢式引物P148：5′CGCTTCTTCAGGCCGAACTGG3’和P149：5'TCGGTCAGGAAGCGGAACATCG3’。以总DNA为模板，P144和P149为引物，进行第一轮PCR反应。反应条件为：94℃1min，98℃1min；[94℃30s，64℃1min，72℃2min(5个循环)]；94℃30s，60℃3min，72℃2min25个循环；72℃10min。
取第一轮PCR反应产物1μL作为模板，以P144和P149为引物，进行第二轮PCR反应。反应条件为：94℃30s，64℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。
将第二轮PCR反应的产物用1％琼脂糖胶回收，测序，获得5’端未知序列179bp。
用同样的方法扩增3’端未知序列，设计兼并引物：P145：5′TCASGCSSKGTGGAYCTCCAG3’和巢式引物P146：5’TGCGGCCTCCAACAGGTCTACG3’P147：5’GGTTCATGTTCCACCCGTCCCA3’。以总DNA为模板，P145和P147为引物，进行第一轮PCR反应。反应条件为：94℃1min，98℃1min；[94℃30s，64℃1min，72℃2min(5个循环)]；94℃30s，60℃3min，72℃2min25个循环；72℃10min。
取第一轮PCR反应产物1μL作为模板，以P145和P146为引物，进行第二轮PCR反应。反应条件为：94℃30s，64℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。
将第二轮PCR反应的产物用1％琼脂糖胶回收，测序，获得5’端未知序列910bp。
对三段序列进行拼接，以P144和P145为引物，PCR反应条件为：94℃30s，60℃1min，72℃3min，30个循环，将PCR扩增产物进行克隆和序列分析，寻找阅读编码框，其中包含了一个2073bp的阅读框，即为本发明的L-谷氨酸氧化酶基因，其序列如SEQ ID No1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。
实施例4、基因合成法合成来源于阿富汗链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因
通过基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)合成本发明的阿富汗链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，所用的引物如下：
以SaGOX1-SaGOX13；SaGOX14-SaGOX26；SaGOX27-SaGOX39；SaGOX40-SaGOX52为引物，利用PCR进行扩增SaGOX1、SaGOX2、SaGOX3、SaGOX4片段，在50μl反应体系中，其中内侧引物SaGOX2-SaGOX12、SaGOX15-SaGOX25、SaGOX28-SaGOX38、SaGOX41-SaGOX52引物的添加量为2ng，外侧引物SaGOX1和SaGOX13；SaGOX14和SaGOX26；SaGOX27和SaGOX39；SaGOX40和SaGOX50引物添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，1min。共25个循环。扩增片断通过琼脂糖凝胶回收，然后作为模版进行拼接，扩增小片段SaGOX1、SaGOX2、SaGOX3、SaGOX4各1μg，以SaGOX1和SaGOX52为引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，3min，共25个循环。通过上述引物及PCR扩增可以获取阿富汗链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因。
实施例5 L-谷氨酸氧化酶基因的大肠杆菌表达
在阅读框的左右两侧设计引物：P150：5'-GGATCCATGTCCCCGTCTTCGCTCCTTCGA和P151：5'-GAGCTCTTAGGCGCGG TGGACCTCCAGGGA为扩增引物，以总DNA为模板，对2073bp的阅读框进行PCR扩增。将外加酶切位点的L-谷氨酸氧化酶基因用BamHI和SacI酶切后，与载体pET-32a(NEB公司)连接得到重组质粒pET-SaGOX(参看附图1)，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)，将转化子涂布于LB固体培养基中37℃培养16h。挑取单菌落接种于50mL含氨苄(终浓度100mg/L)的LB液体培养基中，37℃振荡培养5h，OD600约为0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃诱导12h。将所得发酵培养液9000rpm离心去上清，收集湿细胞。取湿细胞用生理盐水洗涤两次，再悬浮于pH6.5、100mM的磷酸-磷酸钠缓冲液中(1g湿细胞/10ml缓冲液)得悬浮液，用超声波处理悬浮液(功率为400W，超声4s，间歇6s，重复99轮)，9000rpm离心取上清，即得粗酶液。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP(Amersham Biosciences公司)对其进行蛋白表达纯化，获得L-谷氨酸氧化酶前体蛋白，然后加入千分之一当量的蛋白酶(肠激酶、FactorXa、Sgrnp和凝血酶)在4℃下处理6-24h，获得具有活性的L-谷氨酸氧化酶蛋白。
经SDS-PAGE电泳检测，前体蛋白大小约70kDa，用Factor Xa蛋白酶处理后得三个亚基，分子量分别约为46kDa，14kDa和10kDa，与预测值相符(参看附图2)。
实施例6 L-谷氨酸氧化酶的活性测定
L-谷氨酸氧化酶活力测定：反应体系为1ml，包含pH6.5、100mM磷酸钠缓冲液，1mM的4-氨基安替安替吡啉，10mM的L-谷氨酸，10mM的苯酚，2000U/L的辣根过氧化物酶，在37℃下反应10min，使用分光光度计测定505nm处吸光值。酶活定义为，每分钟反应生成1μmol过氧化氢所需的酶量为一个酶活单位U。蛋白含量采用Brandford法测定。
分别配制0，0.02，0.04，0.1，0.2，0.3，0.4mM L-谷氨酸底物，根据米氏曲线计算谷氨酸氧化酶的米氏常数。缓冲液使用pH为8.0的磷酸缓冲液，反应温度为37℃，反应时间为10min，每个反应浓度重复3次。采用上述方法测定实施例5所得经Factor Xa蛋白酶处理后L-谷氨酸氧化酶活力，结果为：L-谷氨酸氧化酶的反应活力为10.2U/mg。
实施例7 L-谷氨酸氧化酶基因的最适反应温度和pH值
按照20-80℃设置反应温度。反应体系为1ml，包含pH6.5、100mM磷酸钠缓冲液，1mM的4-氨基安替安替吡啉，10mM的L-谷氨酸，10mM的苯酚，2000U/L的辣根过氧化物酶，在37℃下反应10min，使用分光光度计测定505nm处吸光值，检测酶的相对活性，经过检测发现，40℃下反应下，酶的活性最高(参看附图3)。
利用醋酸钠缓冲液、磷酸缓冲液以及甘氨酸-氢氧化钠缓冲液分别配制pH3-6；6-8.5；8.5-10.5反应液，检测酶的相对活性。得知该酶在pH8时候，酶活性最高(参看附图4)。
实施例8 L-谷氨酸氧化酶的底物谱
分别配制100mM L-谷氨酸L-glutamate，D-谷氨酸D-glutamate，L-谷氨酰胺L-glutamine，L-天冬氨酸L-aspartate，L-天冬酰胺L-Asparagine，L-甘氨酸L-glycine，L-精氨酸L-arginine，L-脯氨酸L-proline，L-组氨酸L-histidine，L-酪氨酸L-Tyrosine，L-半胱氨酸L-cysteine作为反应底物，加入上述谷氨酸酶活检测反应体系，最终在反应体系中的各种氨基酸的终浓度为10mM。
反应体系为1ml：取实施例5制得的经Factor Xa蛋白酶处理后的L-谷氨酸氧化酶10μL，加入包含pH6.5、100mM磷酸钠缓冲液，1mM的4-氨基安替安替吡啉，10mM的苯酚，2000U/L的辣根过氧化物酶的反应液中，分别加入各种底物(10mM)，30℃下反应2min，使用分光光度计测定505nm处吸光值。结果如表1所示。
表1 L-谷氨酸氧化酶的底物谱
根据表1的底物谱研究所示：本发明的L-谷氨酸氧化酶，底物专一性很强，能特异性地催化L-谷氨酸，可适用于L-谷氨酸含量检测。
Claims (5)
1.一种源于阿富汗链霉菌(Streptomyces afghaniensis)的L-谷氨酸氧化酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.根据权利要求1所述的L-谷氨酸氧化酶基因，其特征在于，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO2所示。
3.权利要求1或2所述的L-谷氨酸氧化酶基因的制备方法，其特征在于，将阿富汗链霉菌中的L-谷氨酸氧化酶基因利用基因合成法制备而成。
4.权利2所述的L-谷氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于，将权利要求3中制备的基因与原核表达载体连接，转化大肠杆菌，通过大肠杆菌表达获得。
5.权利要求1或2所述的L-谷氨酸氧化酶基因在L-谷氨酸含量检测中的应用。
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| CN106916834A (zh) * | 2015-12-24 | 2017-07-04 | 武汉臻智生物科技有限公司 | 化合物的生物合成基因簇及其应用 |
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2014
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