CN107190068A - 一种脑胶质瘤mgmt启动子基因甲基化的检测方法 - Google Patents

一种脑胶质瘤mgmt启动子基因甲基化的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，具体步骤如下：用组织DNA提取试剂盒对患者脑胶质瘤的组织提取DNA；用甲基化修饰试剂盒对提取DNA进行硫化处理；用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物对已经硫化修饰后的DNA位模板进行降落PCR；利用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物PCR扩增的产物稀释1000倍位模板，再以SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增；将SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳；将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；PCR产物的与T载体的连接转化及蓝白斑筛选：菌落PCR进行重组子的筛选：将阳性的克隆送到测序；将测序结果用biq‑analyzer软件分析。本发明具有检测准确度高、使用比较方便等优点。

Description

一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体来说是一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法。
背景技术
DNA甲基化是一种基因组DNA表观遗传修饰的主要形式和基因组功能调节的重要手段。DNA甲基化修饰的方式有很多，被修饰位点的碱基可以是腺嘌呤N-6位、胞嘧啶的N-4位，也可以是鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位。DNA甲基化具体是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合一个甲基基团。最近研究表明DNA甲基化在基因突变、表达调控、细胞增殖、分化、发育过程中发挥重要的作用，并且与肿瘤发生发展有密切关系。
通过调整DNA修饰机制来提高常规化疗药物疗效是肿瘤研究的一个重要领域,O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)在修饰O6-烷基鸟嘌呤损伤中的特殊作用机制及自杀性酶特性，使其在肿瘤早期诊断和预测肿瘤对烷化剂敏感性中具备重要意义。
MGMT基因结构功能的异常，特别是启动子过甲基化和肿瘤发生以及生物学上的联系，正成为关注的焦点,启动子区过甲基化是引起基因沉默的主要机制之一，可能影响基因功能的正常发挥,大量研究表明，MGMT基因甲基化与替莫唑胺(TMZ)疗效相关，MGMT基因启动子甲基化患者组生存时间明显长于非甲基化组。
目前甲基化的检测方法很多，如甲基化敏感的限制性内切酶-PCR/Southern法、直接测序法、甲基化特异性PCR(MSP)-电泳等,MGMT基因甲基化检测最常用的是MSP，该方法操作方便、适用性广，灵敏度约为10％,直接测序法的灵敏度低，要求受检材料的突变比例大于20％，且检测成本高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的检测精确度差、操作不便的缺陷，而提供一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，具体步骤如下：
(1)、用组织DNA提取试剂盒对患者脑胶质瘤的组织提取DNA，确保DNA浓度不低于50ng/ul，260/280＝1.8；
(2)、取20ul DNA，用甲基化修饰试剂盒对提取DNA进行硫化处理；
(3)、用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物对已经硫化修饰后的DNA位模板进行降落PCR，其中反应体系为25uL，其包括：模板：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSPbuffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL；
(4)、利用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物PCR扩增的产物稀释1000倍位模板，再以SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增，其中反应体系为25uL，其包括:模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO 4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL；
(5)、将SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳；
(6)、将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；
(7)、PCR产物的与T载体的连接转化及蓝白斑筛选：
(7.1)、插入的目的基因片断与载体的摩尔数比为3～8:1，反应体系如下：
混匀反应体系，整个反应体系置于22℃连接30min；
(7.2)、转化大肠杆菌：
在100μL的感受态细胞中加入10μL连接的产物，冰浴30min，将此混合物置于42℃水浴准确热激90s，迅速将反应物冰浴3min，加入400μL新鲜的LB液体培养基，于37℃，120rpm摇床温育60min，培养液悬浮细胞，全部涂布于LB/Ampicillin平板上，水平放置30min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养12～16h，直至出现单菌落，将培养皿置于4℃冰箱放置数小时，使其充分显色，即出现蓝、白斑，其中蓝色菌落为空载体，白色菌落即为含有外源基因片断的重组子；
(8)、菌落PCR进行重组子的筛选：
用接菌环挑取白色单菌落于1mL LB/Ampicillin液体培养基中，37℃，250r/min振荡培养3h，肉眼观察浑浊，取1μL菌液作为为模板，按照步骤(4)的PCR反应体系和条件进行菌落PCR扩增，PCR扩增产物1％琼脂糖电泳，紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆；
(9)、将阳性的克隆送到测序；
(10)、将测序结果用biq-analyzer软件分析，得到甲基化结果。
作为优选，所述的步骤(3)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃至42℃退火30s每度2个cycle，最后再42℃退火30s 10个cycles，72℃延伸45s，共42个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
作为优选，所述的步骤(4)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共42个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
作为优选，所述的步骤(8)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共42个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存，反应体系为25uL体系，其包括:模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO 4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL。
作为优选，所述的步骤(3)-(5)中，所述的特异性扩增的引物SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3和SEQ NO 4，其碱基序列如下所示：
SEQ NO 1：GTTTAGYGAGGATGYGTAGATTGTT
SEQ NO 2：AAAAAAAACTAAACAACACCTAA
SEQ NO:3：TTTTTTTYGGGTTTYGTTTTAGTTT
SEQ NO:4：ACTCRCCCRAAATAAATAAAAATCA。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：
本发明的目的是提供检测脑胶质瘤MGMT基因启动子区甲基化状态的引物，即用于检测MGMT基因启动子区甲基化状态的引物，本发明的另一个目的是提供检测脑胶质瘤MGMT启动子区甲基化状态的方法，以此来对脑胶质瘤对烷化剂化疗药物敏感性做分子标记；
经过反复的实验与推敲，本发明选出了两对特异性很好的甲基化引物，第一对用于降落PCR用，第二对在第一对引物扩增产物内再设计的引物，并且建立了稳定的反应体系，摸索出理想的反应条件，应用敏感度较高的丙烯酰胺凝胶电泳技术作为结果检出手段，因此得出可靠地实验结果；
由上可知，本发明所述的脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，检测精度较高，灵敏度好，操作比较方便。
附图说明
图1为实施例1中将SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳的结果图；
图2为实施例1中的步骤(8)中菌落PCR进行重组子的筛选的检测结果图；
图3为实施例1中的将测序结果用biq-analyzer软件分析的分析结果图；
图4为实施例1中的将测序结果用biq-analyzer软件分析的分析图；
图5为实施例1中的将测序结果用biq-analyzer软件分析的结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1：
将脑胶质瘤A1患者进行MGMT启动子甲基化检测
(1)、用A1脑胶质瘤的组织用组织DNA提取试剂盒提取DNA确保DNA浓度为100ng/ul，260/280＝1.82。
(2)、取20ul DNA用甲基化修饰试剂盒对提取DNA进行硫化处理；
(3)、用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物对已经硫化修饰后的DNA位模板进行降落PCR，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃至42℃退火30s每度2个cycle，最后再42℃退火30s 10个cycles，72℃延伸45s，共42个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存，反应体系为25uL体系，其包括:模板(硫化产物)：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL；
(4)、利用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物PCR扩增的产物稀释1000倍位模板以SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共42个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存，反应体系为25uL体系，其包括:模板(SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物扩增产物)：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO 4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot starttaq：0.5ul、去离子水：16uL；
(5)、将SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳；
(6)、将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收378bp目的条带；
(7)、PCR产物的与T载体的连接转化及蓝白斑筛选
(7.1)、插入的目的基因片断与载体的摩尔数比为3～8:1，反应体系如下：
混匀反应体系，整个反应体系置于22℃连接30min；
(7.2)、转化大肠杆菌
在100μL的感受态细胞中加入10μL连接的产物，冰浴30min，将此混合物置于42℃水浴准确热激90s，迅速将反应物冰浴3min，加入400μL新鲜的LB液体培养基，于37℃，120rpm摇床温育60min，培养液悬浮细胞，全部涂布于LB/Ampicillin平板上，水平放置30min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养12～16h，直至出现单菌落，将培养皿置于4℃冰箱放置数小时，使其充分显色，即出现蓝、白斑，其中蓝色菌落为空载体，白色菌落即为含有外源基因片断的重组子。
(8)、菌落PCR进行重组子的筛选
用接菌环挑取5个白色单菌落于1mL LB/Ampicillin液体培养基中，37℃，250r/min振荡培养3h，肉眼观察浑浊，取1μL菌液作为为模板，按照4.4的PCR反应体系和条件进行菌落PCR扩增，PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳，紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆；
(9)、将阳性的克隆测序；
(10)、将测序结果用biq-analyzer软件分析。
参照图3，MGMT基因原始序列与B9MGMT启动子基因比对结果如图3可以清楚发现有两处发生甲基化；
参照图4，圆圈代表CpG，白色圆圈表示未甲基化的，黑色圆圈表示甲基化；
参照图5，柱子代表CpG，蓝色柱子表示未甲基化的CpG位置，黄色柱子表示甲基化CpG位置。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)、用组织DNA提取试剂盒对患者脑胶质瘤的组织提取DNA，确保DNA浓度不低于50ng/ul，260/280＝1.8；
(2)、取20ul DNA，用甲基化修饰试剂盒对提取DNA进行硫化处理；
(3)、用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物对已经硫化修饰后的DNA位模板进行降落PCR，其中反应体系为25uL，其包括：模板：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL；
(4)、利用SEQ NO 1和SEQ NO 2甲基化引物PCR扩增的产物稀释1000倍位模板，再以SEQNO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增，其中反应体系为25uL，其包括:模板：2uL、SEQ NO3:1uL、SEQ NO 4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL；
(5)、将SEQ NO 3和SEQ NO 4引物进行普通PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳；
(6)、将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；
(7)、PCR产物的与T载体的连接转化及蓝白斑筛选：
(7.1)、插入的目的基因片断与载体的摩尔数比为3～8:1，反应体系如下：
混匀反应体系，整个反应体系置于22℃连接30min；
(7.2)、转化大肠杆菌：
在100μL的感受态细胞中加入10μL连接的产物，冰浴30min，将此混合物置于42℃水浴准确热激90s，迅速将反应物冰浴3min，加入400μL新鲜的LB液体培养基，于37℃，120rpm摇床温育60min，培养液悬浮细胞，全部涂布于LB/Ampicillin平板上，水平放置30min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养12～16h，直至出现单菌落，将培养皿置于4℃冰箱放置数小时，使其充分显色，即出现蓝、白斑，其中蓝色菌落为空载体，白色菌落即为含有外源基因片断的重组子；
(8)、菌落PCR进行重组子的筛选：
用接菌环挑取白色单菌落于1mL LB/Ampicillin液体培养基中，37℃，250r/min振荡培养3h，肉眼观察浑浊，取1μL菌液作为为模板，按照步骤(4)的PCR反应体系和条件进行菌落PCR扩增，PCR扩增产物1％琼脂糖电泳，紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆；
(9)、将阳性的克隆送到测序；
(10)、将测序结果用biq-analyzer软件分析，得到甲基化结果。
2.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，其特征在于：所述的步骤(3)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃至42℃退火30s每度2个cycle，最后再42℃退火30s 10个cycles，72℃延伸45s，共42个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
3.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共42个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
4.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，其特征在于：所述的步骤(8)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共42个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存，反应体系为25uL体系，其包括:模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO 4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mMdNTP：2ul、Hot start taq：0.5ul、去离子水：16uL。
5.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤MGMT启动子基因甲基化的检测方法，其特征在于：所述的步骤(3)-(5)中，所述的特异性扩增的引物SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3和SEQNO 4，其碱基序列如下所示：
SEQ NO 1：GTTTAGYGAGGATGYGTAGATTGTT
SEQ NO 2：AAAAAAAACTAAACAACACCTAA
SEQ NO:3：TTTTTTTYGGGTTTYGTTTTAGTTT
SEQ NO:4：ACTCRCCCRAAATAAATAAAAATCA。
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