CN103571958A - 检测mgmt基因甲基化的引物和试剂盒及其使用方法 - Google Patents

检测mgmt基因甲基化的引物和试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测MGMT基因甲基化的引物和试剂盒及其使用方法，同时还公开了所述引物和试剂盒的应用。本发明所公开的引物是根据人类MGMT基因启动子区域序列设计特异性引物，可使用包含有所述引物的试剂盒，通过巢式PCR扩增结合DHPLC（变性高效液相色谱分析）检测，快速、准确、高灵敏度地检测MGMT基因甲基化。

Description

检测MGMT基因甲基化的引物和试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及基因检测的引物和试剂盒，尤其涉及一种用于检测MGMT基因甲基化的引物和试剂盒及其使用方法
背景技术
烷化剂是一种常见的诱变和致癌物质，烷化剂上许多活性基团能和DNA形成许多加合物，其中特别容易和鸟嘌呤形成O6-甲基鸟嘌呤，O6-甲基鸟嘌呤如果不能被及时发现和纠正，那么在DNA复制过程中，可能会使复制难以继续或者使复制发生突变，使基因组的序列发生改变，影响基因的表达。O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）是一种DNA修复酶，可以特异性修复因烷化剂导致的细胞损伤，是哺乳动物细胞修复烷化剂所造成DNA损伤的一个重要环节。如果肿瘤细胞中的MGMT水平过高可能会导致耐药，但对于正常细胞亦能减少其化疗的毒副作用，因此如何控制MGMT水平以达到最佳的化疗效果，是当今的一个研究热点。
MGMT基因结构功能的异常，特别是启动子过甲基化和肿瘤发生以及生物学上的联系，正成为关注的焦点。启动子区过甲基化是引起基因沉默的主要机制之一，可能影响基因功能的正常发挥。大量研究表明，MGMT基因甲基化与替莫唑胺（TMZ）疗效相关，MGMT基因启动子甲基化患者组生存时间明显长于非甲基化组。
目前甲基化的检测方法有多种，如甲基化敏感的限制性内切酶-PCR/Southern法、直接测序法、甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）-电泳等。MGMT基因甲基化检测最常用的是MSP，该方法操作方便、适用性广，灵敏度约为10%。直接测序法的灵敏度低，要求受检材料的突变比例大于20%，且检测成本也较高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于检测MGMT基因甲基化的引物，本发明还公开了包括有该引物的试剂盒及其使用方法。
本申请的发明人根据人类MGMT基因启动子区域序列设计特异性引物，通过巢式PCR扩增结合DHPLC（变性高效液相色谱分析）检测，可以快速、准确、高灵敏度地检测MGMT基因甲基化。
根据本发明的实施例，提供了一种用于检测MGMT基因甲基化的引物，所述引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示。
根据本发明的实施例，还提供了一种用于检测MGMT基因甲基化的试剂盒，其主要包括：1）上述用于检测MGMT基因甲基化的引物，所述引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示；2)甲基化处理试剂、PCR MIX反应液、去离子水、空白对照；3）分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。优选的，上述引物的浓度均为10pmol/μl。
其中，甲基化处理试剂可从北京天漠科技开发有限公司购买得到，其包括CT Conversion Reagent、M-Binding Buffer、M-Wash Buffer、M-DesulphonationBuffer、M-Elution Buffer、Zymo-Spin ICTMColumn和Collection Tube。
其中，PCR MIX反应液为本领域常规的PCR MIX反应液；优选的，所述PCR MIX反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2；其中，所述Taq DNA聚合酶的浓度为50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为400μM，所述MgCl2的浓度为3mM。本发明的引物和试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
（1）使用常规方法提取待测样本的基因组DNA；
（2）对DNA进行亚硫酸盐处理；
（3）进行巢式PCR：第一次PCR扩增以亚硫酸盐处理后的DNA为模板，使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；将第一次PCR扩增的产物稀释20倍作为模板，分两管进行第二次PCR扩增，A管使用的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；B管使用的引物序列如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示；
(4)按照DHPLC（变性高效液相色谱分析）常规操作方法，使用前先检查仪器状态是否正常，运行flush+equilibrate程序，除气泡并wash进样针2-3遍。上样前运行1-2针空白针（使用所需进样的检测方法），再将巢式PCR的甲基化扩增产物和非甲基化扩增产物及对应空白对照进行上机检测，判读结果。
通过以上技术方案，本发明的有益效果如下：
通过巢式PCR扩增结合DHPLC检测MGMT基因甲基化，灵敏度高，灵敏度可高达1～5%，操作流程简单，可降低检测人员的工作强度，减少误操作的可能性，提高检测的准确性，通过DHPLC自动化分析检测结果，检测的准确性高。
附图说明
图1为使用本发明的实施例的试剂盒检测某患者MGMT基因甲基化所得的DHPLC检测结果；
图中，1为100bp Marker，2为甲基化特异性引物扩增结果，3为非甲基化特异性引物扩增结果，4和5为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
用于检测MGMT基因甲基化的试剂盒及其使用
1.该用于MGMT基因甲基化的试剂盒中装有：
⑴引物，所述引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示，上述引物的浓度均为10pmol/μl。
⑵甲基化处理试剂（购自从北京天漠科技开发有限公司），其包括CTConversion Reagent、M-Binding Buffer、M-Wash Buffer、M-Desulphonation Buffer、M-Elution Buffer、Zymo-Spin ICTMColumn和Collection Tube。
(3)PCR MIX反应液，其包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2；其中，所述Taq DNA聚合酶的浓度为50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为400μM，所述MgCl2的浓度为3mM；
(4)去离子水
(5)空白对照
(6)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
2.试剂盒的使用方法如下：
⑴提取待测样本的基因组DNA：将石蜡包埋的组织切成5～10μm的薄片后置于1.5ml离心管中。二甲苯脱蜡。加入无水乙醇处理，室温晾干直至残留的乙醇已挥发完全。用真空干燥仪45度15分钟干燥，干燥组织经蛋白酶K消化及加入酚和氯仿提取DNA，收集DNA，提取的DNA浓度为100ng/μl左右，可直接用于检测或保存于-20度或-80度。
(2)对DNA进行亚硫酸盐处理，具体步骤如下：
A:在PCR管中添加130ul的CT Conversion Reagent到每20ulDNA样品中，将样品管放到循环变温器并按以下步骤操作:
98℃,10min→64℃,2.5h→4℃,20h；
B:添加600μl的M-Binding Buffer到Zymo-Spin ICTMColumn中，并将柱放入试剂盒所提供的Collection Tube中；
C:加入样品(从步骤B)到含有M-Binding Buffer的柱子中，盖上盖将柱颠倒数次来混合样品；
D:全速(>10,000×g)离心30秒，去除流出液；
E:添加200μl的M-Wash Buffer到柱中，全速离心30秒；
F:添加200μl的M-Desulphonation Buffer到柱中并且在室温(20℃～30℃)下放置培养15～20分钟，在培养后，全速离心30秒；
G:添加200μl的M-Wash Buffer到柱中，全速离心30秒，再添加200μl的M-Wash Buffer并且离心30秒；
H:直接添加10μl的M-Elution Buffer到柱基质中，将柱放置在1.5ml的管中，全速离心来洗脱DNA。
(3)进行巢式PCR；第一次PCR扩增以亚硫酸盐处理后的DNA为模板，使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；将第一次PCR扩增的产物稀释20倍作为模板，分两管进行第二次PCR扩增，A管使用的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；B管使用的引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；反应体系如下：
组分 体积（total25μl）
DNA模板 1.0μl
上游引物 1.0μl
下游引物 1.0μl
PCR MIX反应液 12.5μl
去离子水 9.5μl
第一次PCR扩增反应程序为：
95℃，10min，1个循环；
95℃，30sec→52℃,30sec→72℃,60sec，30个循环；
72℃，7min，1个循环。
第二次PCR扩增反应程序为：
95℃，10min，1个循环；
95℃，30sec→58℃,30sec→72℃,60sec，30个循环；
72℃，7min，1个循环。
(4)按照DHPLC（变性高效液相色谱分析）常规操作方法，使用前先检查仪器状态是否正常，运行flush+equilibrate程序，除气泡并wash进样针2-3遍。上样前运行1-2针空白针（使用所需进样的检测方法），将巢式PCR的甲基化扩增产物和非甲基化扩增产物及对应空白对照进行上机检测，判读结果。
判读依据：甲基化引物扩增产物峰位于100bp Marker左侧，非甲基化引物扩增产物峰位于100bp Marker右侧，空白对照无相应峰型出现，甲基化引物扩增产物出峰或非甲基化引物扩增产物和甲基化引物扩增产物均出峰，即为甲基化阳性；仅非甲基化引物扩增产物出峰，即为甲基化阴性。
如图1所示，该患者的检测样本检测出了MGMT甲基化。
上面已经举例说明了本发明的实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
Figure IDA0000407613000000021

Claims (8)

1.一种用于检测MGMT基因甲基化的引物，其特征在于：所述引物的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示，
SEQ ID NO:15’-AGTTCGCGTTTTTAGAACG-3’
SEQ ID NO:25’-AATCCAAAAACCCCAAACC-3’
SEQ ID NO:35’-TAGAATGTTTTGTGTTTTGATGTTTGTAG-3’
SEQ ID NO:45’-ACTCTTCCAAAAACAAAACAACCCAAACA-3’
SEQ ID NO:55’-CGTTTGCGTTTCGACGTTCGTAG-3’
SEQ ID NO:65’-CTTCCGAAAACGAAACGACCCA-3’。
2.一种用于检测MGMT基因甲基化的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：1）如权利要求1所述的引物；2）甲基化处理试剂、PCR MIX反应液、去离子水、空白对照；3）分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
3.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述引物的浓度均为5～10pmol/μl。
4.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：甲基化处理试剂可从北京天漠科技开发有限公司购买得到，其包括：CT Conversion Reagent、M-BindingBuffer、M-Wash Buffer、M-Desulphonation Buffer、M-Elution Buffer、Zymo-SpinICTMColumn和Collection Tube。
5.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR MIX反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2；其中，所述Taq DNA聚合酶的浓度为50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为400μM，所述MgCl2的浓度为3mM。
6.权利要求1所述引物的使用方法，包括以下步骤：
（1）使用常规方法提取待测样本的基因组DNA；
（2）对DNA进行亚硫酸盐处理；
（3）进行巢式PCR：第一次PCR扩增模板为经亚硫酸盐处理的DNA，使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；以第一次PCR扩增的产物为模板，分两管进行第二次PCR扩增，A管使用的引物序列如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示；B管使用的引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示；
（4）按照DHPLC（变性高效液相色谱分析）常规操作方法，将巢式PCR产物进行上机检测，判读检测结果。
7.按照权利要求1所述的引物在诊断MGMT基因甲基化中的应用。
8.按照权利要求2～5中任一所述的试剂盒在诊断MGMT基因甲基化中的应用。
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