CN104726561A

CN104726561A - Mgmt基因启动子甲基化检测试剂和方法

Info

Publication number: CN104726561A
Application number: CN201510074978.7A
Authority: CN
Inventors: 陈奕磊; 林筱剑; 王淑一
Original assignee: FUZHOU AIDIKANG MEDICAL INSPECTION CO LTD
Current assignee: FUZHOU AIDIKANG MEDICAL INSPECTION CO LTD
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2015-06-24

Abstract

本发明公开了一种检测MGMT基因启动子甲基化检测试剂和方法，包括：（1）特异性扩增引物SEQ NO1和SEQ NO2，其中SEQ NO2的5端标记生物素，以及特异性测序引物SEQ NO3；（2）PCR扩增反应试剂、亚硫酸盐处理试剂以及焦磷酸测序相关试剂。本发明具有检测周期短，特异性高，准确度高以及低污染风险等优点，可用于判断待测样本的MGMT基因启动子甲基化状态，检测结果将有助于预见相关肿瘤疾病的早期，同时可指导临床医生更好地依据病患的个体差异使用烷化剂药物，实现个体化治疗，也可指导医生进行相关疾病的预后治疗。

Description

MGMT基因启动子甲基化检测试剂和方法

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，是一种MGMT基因启动子甲基化检测试剂和方法。

背景技术

通过调整DNA修复机制来提高常规化疗药物疗效是肿瘤研究的一个重要领域。O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)在修复O⁶-烷基鸟嘌呤损伤中的特殊作用机制及自杀性酶特性，使其在肿瘤早期诊断和预测肿瘤对烷化剂药物敏感性中具备了重要意义。

MGMT作为一种DNA修复蛋白，能够移除DNA上鸟嘌呤O⁶位点的能致突变毒性和细胞毒性的烷基化加合物，使损伤的鸟嘌呤恢复，从而能够保护细胞对抗烷化基团的损害，而由启动子甲基化调控的MGMT基因表观沉默揭示了人类肿瘤发生的一个重要突变路径：MGMT基因启动子过甲基化导致MGMT表观沉默,由烷化剂引起的O⁶-MeG加合物不能被移除,就会导致基因突变，有报道称MGMT基因表观沉默导致p53和K-ras基因的突变率增加可能在整个基因组从始至终地存在，并且受其影响的不仅仅是基因组稳定所必需的基因，还包括更多的基因，因此启动子异常甲基化所致的基因沉默可能是肿瘤发生的一种早期事件。

此外，MGMT基因启动子甲基化状态也与烷化剂药物敏感性有一定相关性。烷化剂替莫唑胺(TMZ)、双氯乙基亚硝脲(BCNU)、嘧啶亚硝脲(ACNU)等作为化疗药物广泛应用于治疗人类肿瘤。这些烷化剂的一个重要作用位点为O⁶鸟嘌呤,而MGMT能够迅速移除O⁶鸟嘌呤上烷基化合物使烷化剂杀肿瘤疗效降低，导致肿瘤耐药。有研究表明在脑胶质瘤中发现MGMT活性降低的患者对烷化剂药物敏感性增强，随后证实MGMT基因CpG岛甲基化是MGMT在脑胶质瘤中缺失的最主要原因。MGMT基因甲基化的脑胶质瘤病人对烷化剂药物BCNU和TMZ更为敏感，同时这类病人总生存率明显改善，MGMT启动子甲基化状态与进行放疗联合TMZ化疗的脑胶质瘤患者中长期生存率呈正相关。所以，MGMT甲基化具有预测人类肿瘤对烷化剂化疗药物反应性的潜在价值，当然这不仅仅是限于预测脑胶质瘤对BCNU和TMZ等烷化剂反应性，还可应用于其它固体瘤和血液肿瘤。综上所述，检测MGMT基因启动子甲基化状态有可能成为早期肿瘤形成及预测肿瘤对烷化剂化疗药物敏感性的分子标记。

目前对于MGMT启动子甲基化检测的常规方法有：甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)、荧光定量法。其中MSP法是使用PCR扩增检测来判断样本是否存在甲基化，该法实用且普遍，但不能做到定量检测，并且存在较高的假阳性风险；BSP法主要是通过PCR联合sanger测序技术来检测甲基化状态，但由于其操作繁琐，因此不适合大批量检测，同时挑选克隆的数目可能会影响检测结果，因此BSP只能算是半定量法；MS-HRM是通过将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，从而判断是否存在甲基化，这种方法对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，同时该法只能分析检测片段整体甲基化状态，而不能明确每个CpG位点的甲基化状态；荧光定量法是基于MSP开发的技术，主要是在检测中加入了TaqMan探针，从而保证了较高的灵敏度和准确度，但其对于多个甲基化位点的检测，也只能做到整体化分析，同时探针成本较高，因此该法较适用于少数位点大量样本检测。

本发明采用的检测方法为PCR联合焦磷酸测序技术。目前，焦磷酸测序法已被认为是甲基化检测的金标准。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，其原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。依据这一原理，在检测时，只需根据单个所检位点内C和T的荧光信号强度，即可确定该位点的甲基化状态，使得检测结果更加直观。因此该方法不仅可定性，也能实现定量，甚至结合相关软件可以精确的分析所检片段区域的甲基化状态。同时，焦磷酸测序仪可在30min左右内可完成96例样本的测序，因此具备了准确性高、检测通量高、检测周期短等优势。

由于DNA序列在经亚硫酸盐处理后，其部分C碱基会转变为T，导致序列区域内CG含量和TM值发生较大程度的变异，进而影响常规引物设计软件在其序列上获得理想的引物序列。因此，本发明中PCR采用的扩增引物以及测序引物均为自行设计，其中测序引物3端的结合位点直接位于所检第一个位点的前一个碱基，这使得扩增产物上机测序时大大缩短了测序检测周期。同时，扩增引物的使用比例经过多次优化实验，相对于其它文献和软件设计的引物具备了更加理想的扩增效率(见图5)。此外，由于亚硫酸盐处理过程中，样本DNA会受到一定程度的降解，从而影响后期检测，因而本发明采用两轮PCR，提高检出率。

因此，本发明的检测方法具备了检测出率高，检测周期短，通量高，准确度高以及低污染风险等优势。检测结果将有助于预见相关肿瘤疾病的早期，同时可指导临床医生更好的依据病患的个体差异使用烷化剂药物，实现个体化治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种MGMT基因启动子甲基化检测试剂，包括特异性扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO2的5端标记生物素，以及测序引物SEQ NO 3，其碱基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GYGTTTYGGATATGTTGG-3’；

SEQ NO 2：5’-CRAAACRACCCAAACACTCAC-3’；

SEQ NO 3：5’-GATAGTTYGYGTTTTTAGAA-3’。

进一步地，特异性扩增引物包括第一轮PCR扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2和第二轮PCR扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2。

进一步地，SEQ NO 1:SEQ NO 2的使用浓度之比为0.25uM:0.35uM。

本发明还提供了一种检测MGMT基因启动子甲基化的方法包括：

(i)提取样本中的DNA；

(ii)将模板DNA进行亚硫酸盐处理，并纯化回收；

(iii)以步骤(ii)中的纯化回收产物为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQ NO1、SEQ NO 2)进行两轮PCR扩增；

(iiii)将PCR产物进行单链纯化之后，将其置于焦磷酸测序仪中测序；

(iiiii)依据相关软件获得样本的MGMT启动子甲基化状态。

进一步地，步骤(iii)中所述的第一轮扩增条件为：95℃15min预变性；94℃30s，48℃30s，72℃1min，49个循环，72℃10min；所述的第二轮扩增循环数设为38个，其余反应条件不变。

进一步地，步骤(iiiii)以亚硫酸盐处理后的MGMT启动子序列为标准序列，并将其输入甲基化检测软件PyroMark CpG，通过该软件分析获得样本的MGMT启动子甲基化状态。

提供一种MGMT基因启动子甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括一对特异性扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO2的5端标记生物素，以及测序引物SEQ NO 3，其碱基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GYGTTTYGGATATGTTGG-3’；

SEQ NO 2：5’-CRAAACRACCCAAACACTCAC-3’；

SEQ NO 3：5’-GATAGTTYGYGTTTTTAGAA-3’；

进一步的，SEQ NO 1：SEQ NO 2的使用浓度之比为0.25uM：0.35uM。

具体的，MGMT基因启动子甲基化检测试剂盒还包括如下试剂：

(1)PCR扩增试剂：10*PCR Buffer、2mM dNTP、5*Q Solution Buffer、5U/ul Taq酶、10uM扩增引物(SEQ NO1、SEQ NO 2)以及灭菌水；

(2)亚硫酸盐处理试剂：Bisulfite Mix、RNase free water、DNA Protect Buffer；

(3)单链纯化试剂：链亲和素beads、70％(V/V)乙醇、8mg/ml NaOH溶液、1×Wash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；

(4)测序试剂：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP及测序引物(SEQ NO3)。

本发明的有益效果：本发明的主要技术路线为PCR联合焦磷酸测序，通过特异性引物扩增目的区域，并利用焦磷酸测序分析样本MGMT启动子甲基化状态。该方法不但可同时实现对于位点甲基化的定性和定量，同时相对其它常规检测方法具备了高准确度、高检出率、高通量、检测周期短以及低污染风险等优势。检测结果可有利于临床医生更好的开展相关疾病的治疗。

附图说明

图1是MGMT基因启动子经亚硫酸盐处理后的部分序列，其中方框标记处为5个所检的甲基化位点。

图2是样本A的焦磷酸测序结果。该样本所检五个位点的甲基化百分比分别为53％、46％、50％、53％及31％(图2测序图谱中阴影部分即为所检五个位点，阴影部分上方对应框内的数值即为其甲基化百分比，下同)；该样本的MGMT启动子甲基化百分比为47％(图2右下角虚线框标记处即为该值，下同)。

图3是样本B的焦磷酸测序结果。该样本的所检五个位点的甲基化百分比分别为0％、0％、5％、0％及5％；该样本的MGMT启动子甲基化百分比为2％。

图4是样本C的焦磷酸测序结果。该样本的所检五个位点的甲基化百分比分别为58％、54％、56％、59％及34％；该样本的MGMT启动子甲基化百分比为52％。

图5是本发明采用的引物与文献及软件设计的引物之间的PCR扩增成功率对比结果。

图6是样本C在SEQ NO 1及SEQ NO 2的不同使用浓度配比下PCR扩增结果对比图。结果显示样本C通过本发明所描述的引物使用浓度配比进行PCR扩增后，其扩增效果要优于其余浓度比。

图7是样本D在SEQ NO 1及SEQ NO 2的不同使用浓度配比下PCR扩增结果对比图。结果显示样本C通过本发明所描述的引物使用浓度配比进行PCR扩增后，其扩增效果要优于其余浓度比。

图8是1～8号样本的一轮PCR结果，结果显示只有2号及5号样本出现较弱的电泳条带，扩增效果不理想。

图9是1～8号样本的两轮PCR结果，结果显示所有均扩增成功，扩增效果理想。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测MGMT启动子甲基化的引物包括一对特异性扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO2的5端标记生物素，以及测序引物SEQ NO 3，其碱基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GYGTTTYGGATATGTTGG-3’；

SEQ NO 2：5’-CRAAACRACCCAAACACTCAC-3’；

SEQ NO 3：5’-GATAGTTYGYGTTTTTAGAA-3’；

设计引物时考虑到DNA序列在经亚硫酸盐处理后，其部分C碱基会转变为T，导致序列区域内CG含量和TM值发生较大程度的变异，进而影响常规引物设计软件在其序列上获得理想的引物序列。因此，本发明中PCR采用的扩增引物以及测序引物均为自行设计，充分考虑了经亚硫酸盐处理后的DNA的特点，并且测序引物3端的结合位点直接位于所检第一个位点的前一个碱基。

MGMT启动子甲基化检测试剂盒，包括：一对特异性扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO2的5端标记生物素，以及测序引物SEQ NO 3，其碱基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GYGTTTYGGATATGTTGG-3’；

SEQ NO 2：5’-CRAAACRACCCAAACACTCAC-3’；

SEQ NO 3：5’-GATAGTTYGYGTTTTTAGAA-3’；

MGMT基因启动子甲基化检测试剂盒还包括如下试剂：

(4)测序试剂：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP及测序引物(SEQ NO3)；

(5)阳性对照品：含有经亚硫酸盐处理后的MGMT启动子DNA；阴性对照品：不含有经亚硫酸盐处理后的MGMT启动子DNA

实施例2：MGMT启动子甲基化检测方法

1.MGMT启动子甲基化检测方法如下步骤：

(1)提取样本中的DNA；

(2)将模板DNA进行亚硫酸盐处理，并纯化回收；

(3)以步骤(2)中的纯化回收产物为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQ NO1、SEQ NO2)进行两轮PCR扩增；

(4)将PCR产物进行单链纯化之后，将其置于焦磷酸测序仪中测序；

(5)依据相关软件获得样本的MGMT启动子甲基化状态。

2.步骤(1)DNA提取：可以选择业内技术人员熟知的提取试剂进行DNA抽提，也可使用生物技术公司开发的试剂盒来进行DNA抽提。

3.步骤(2)亚硫酸盐处理及纯化回收方法如下：

一例样本的亚硫酸盐处理反应体系为140ul：10ul DNA、10ul RNase free water、85ulBisulfite Mix、35ul DNA Protect Buffer。

亚硫酸盐处理反应程序为：95℃5min，60℃25min，95℃5min，60℃85min，95℃5min，60℃175min。

一例样本的纯化回收方法如下：向上述亚硫酸盐反应混合液中加入310ul Buffer BL(其中包含10ug/ml carrier RNA)，振荡混匀；加入250ul无水乙醇，振荡15s，低速离心混匀；将上述混合液移至EpiTect spin columns，全速离心1min，弃废液；加入500ul Buffer BW，全速离心1min，弃废液；加入500ul Buffer BD，室温放置15min，全速离心1min，弃废液；加入500ul Buffer BW，全速离心1min，弃废液；全速离心1min，弃废液；打开离心柱盖子，并置于金属浴中，56℃5min；将离心柱置于一个干净的1.5mL离心管上，向膜中央滴加20μLBuffer EB，12000rpm 1min，收集得到的液体进行下一步PCR或放置-20℃保存。

4.步骤(3)所述的PCR扩增方法如下：

一例样本的第一轮PCR体系为25ul：10*PCR Buffer 2.5ul、2mM dNTP 2.5ul、5*Q SolutionBuffer 5ul、10uM引物SEQ NO10.5ul、10uM SEQ NO20.7ul、5U/ul Taq酶0.125ul、灭菌水11.675ul、模板2ul。

第一轮PCR反应程序：94℃30s，48℃30s，72℃1min，49个循环，72℃10min。

一例样本的第二轮PCR体系为50ul，其中所有PCR试剂组分均扩大1倍；第二轮扩增循环数设为38个，其余反应条件不变。

由于亚硫酸盐处理过程中，样本DNA会受到一定程度的降解，从而影响后期检测，因而本发明采用两轮PCR，这样的设计大大提高检出率。

5.步骤(4)所述的具体步骤为：将得到的50ul PCR产物与3ul链亲和素bead及47ul结合缓冲液混合，室温孵育10～15min，期间震荡2～3次，以免bead下沉。然后使用Vaccuum prepworkstation中的Vaccuum prep tool吸取bead，将带有bead的Vaccuum prep tool先后放进70％(V/V)乙醇、Denaturation Solution、1×Wash Buffer中清洗10s左右，再将Vaccuum prep tool放入含有49ul退火缓冲液及1ul测序引物(SEQ NO3)的96孔板中，释放bead，将该96孔板放置于80℃2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。

6.步骤(5)所述的结果分析，具体为：以亚硫酸盐处理后的MGMT启动子序列为标准序列，并将其输入甲基化检测软件PyroMark CpG，通过该软件分析获得样本的MGMT启动子甲基化状态。

实施例3：临床样本检测

选择36例临床待检肿瘤样本，利用本发明的试剂盒进行检测。按照实施例2中的方法进行样本DNA提取、亚硫酸处理、纯化回收、PCR扩增、焦磷酸测序及结果分析，36例样本的MGMT基因启动子甲基化状态结果如表1所示：

表1

表1中各样本甲基化百分比一栏的数值，表示MGMT启动子上5个检测位点的平均甲基化百分比值，该值由软件PyroMark CpG分析后给出。

由表1可知，使用本发明的PCR联合焦磷酸测序的检测方法，可成功且精确的检出上述36例肿瘤样本的MGMT基因启动子甲基化状态。因此，本发明检测方法不但可同时实现对于位点甲基化的定性和定量，同时通过优化后的引物用量比例以及两轮PCR，保证了较高的PCR扩增成功率。此外，由于联合使用焦磷酸测序技术，从而使得本检测方法具备了高准确度、高通量、检测周期短以及低污染风险等优势，最终分析结果可有利于临床医生更好的开展相关疾病的治疗。

实施例4：临床样本检测

取待检的临床肿瘤样本A、B、C，按照实施例2中的方法进行MGMT基因启动子甲基化状态分析。

样本A的分析结果如图2所示：该样本的所检五个位点的甲基化百分比分别为53％、46％、50％、53％及31％；该样本的MGMT启动子甲基化百分比为47％。

样本B的分析结果如图3所示：该样本的所检五个位点的甲基化百分比分别为0％、0％、5％、0％及5％；该样本的MGMT启动子甲基化百分比为2％。

样本C的分析结果如图4所示：该样本的所检五个位点的甲基化百分比分别为58％、54％、56％、59％及34％；该样本的MGMT启动子甲基化百分比为52％。

图2、图3和图4测序图谱中阴影部分即为所检五个位点，阴影部分上方对应框内的数值即为其甲基化百分比。图2、图3和图4右下角虚线框标记处即为MGMT启动子甲基化百分比。

实施例5：引物的对比实验

图5是本发明的引物与文献引物及软件设计的引物之间的PCR扩增成功率对比结果。选取2例经亚硫酸盐处理的DNA，分别使用5对引物进行两轮PCR扩增。

图5中第二组及第四组分别采用引物设计网站urogene设计的引物(SEQ NO 4：正向引物：5’-TGGTAAATTAAGGTATAGAGTTTTAGG-3’，SEQ NO5：反向引物：5’-AAAACCTAAAAAAAACAAAAAAAC-3’)和软件Primer Premier 6所设计的引物(SEQ NO6：正向引物：5’-TAGYGAGGATGYGTAGATTGT-3’，SEQ NO7：反向引物：5’-CRAACTATCCCAACATATCCRAAA-3’)进行扩增，第三组采用文献1中提供的引物进行扩增(文献1：《Identification of regions correlating MGMT promoter methylation and geneexpression in glioblastomas》，出处：Neuro-Oncology)及第五组采用文献2中提供的引物进行扩增(文献2：《INACTIVATION OF THE DNA-REPAIR GENE MGMT AND THE CLINICALRESPONSE OF GLIOMAS TO ALKYLATING AGENTS》，出处：The New England Journal ofMedicine)；第一组则采用本发明中的引物SEQ NO1及SEQ NO 2进行PCR；M为DNA 2000LMarker。

通过图5可知，第二、三、四、五组分别出现了样本扩增不成功或电泳条带丰度不足的情况，这些不理想的扩增结果均为影响后续的测序实验，而第一组中2例待测样本均扩增成功且电泳条带丰度理想。因此，该对比结果说明，本发明中自行设计的引物具备了较理想的扩增成功率，为后续焦磷酸测序奠定良好的基础。

实施例6：不同引物用量的对比试验

取肿瘤样本C、D，采用不同引物用量的配比，进行两轮PCR扩增，获得对比试验结果。其中SEQ NO1及SEQ NO 2均分别被稀释为3个梯度，即0.15mM、0.25mM和0.35mM，并按表2进行配比扩增，而表2中数字1～9分别代表图6及图7中的1～9号泳道，对比结果见图6及图7。

表2

根据图6及图7结果可知，虽然两例样本在9种不同引物浓度配比下均扩增成功，但通过比较PCR产物的亮度及丰度，即可判断6号泳道的电泳结果要优于其余泳道，因此也就说明本发明所描述的SEQ NO 1及SEQ NO 2使用浓度比0.25uM：0.35uM具有较理想的PCR扩增效率。

实施例7：一轮PCR与两轮PCR的对比试验

取实施例3中的1～8号样本，并使用SEQ NO 1及SEQ NO 2分别进行一轮PCR和两轮PCR扩增，从而比较一轮PCR和两轮PCR扩增之间的扩增效率。一轮PCR结果见图8，两轮PCR结果见图9。

依据图8及图9显示的电泳结果可得：1～8号样本只进行一轮PCR后，只有2号及5号样本出现较弱的电泳条带，其余样本均未见条带；而1～8号进行两轮PCR后，所有样本均扩增成功。因此该对比结果可说明两轮PCR可保证较高的扩增成功率，从而保证焦磷酸测序的成功。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州艾迪康医学检验所有限公司

<120> MGMT基因启动子甲基化检测试剂和方法

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gygtttygga tatgttgg 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

craaacracc caaacactca c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatagttygy gtttttagaa 20

Claims

1.MGMT基因启动子甲基化检测试剂，其特征在于，包括特异性扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO2的5端标记生物素，以及测序引物SEQ NO 3，其碱基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’- GYGTTTYGGATATGTTGG -3’；

SEQ NO 2：5’- CRAAACRACCCAAACACTCAC -3’；

SEQ NO 3：5’-GATAGTTYGYGTTTTTAGAA-3’。

2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，特异性扩增引物包括第一轮PCR扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2和第二轮PCR扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2。

3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，SEQ NO 1:SEQ NO 2的使用浓度之比为0.25uM:0.35uM。

4.检测MGMT基因启动子甲基化的方法包括：

（i）提取样本中的DNA；

（ii）将模板DNA进行亚硫酸盐处理，并纯化回收；

（iii）以步骤（ii）中的纯化回收产物为模板，依据所述的特异性扩增引物（SEQ NO1、SEQ NO 2）进行两轮PCR扩增；

（iiii）将PCR产物进行单链纯化之后，将其置于焦磷酸测序仪中测序；

（iiiii）依据相关软件获得样本的MGMT启动子甲基化状态。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（iii）中所述的第一轮扩增条件为：95℃ 15min预变性；94℃ 30s，48℃ 30s，72℃ 1min ，49个循环，72℃ 10min；所述的第二轮扩增循环数设为38个，其余反应条件不变。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（iiiii）以亚硫酸盐处理后的MGMT启动子序列为标准序列，并将其输入甲基化检测软件PyroMark CpG，通过该软件分析获得样本的MGMT启动子甲基化状态。