CN104195252A - 用于检测mgmt基因甲基化和乙酰化的引物和试剂盒及其检测方法 - Google Patents

用于检测mgmt基因甲基化和乙酰化的引物和试剂盒及其检测方法 Download PDF

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    • C12Q2600/154—Methylation markers

Abstract

本发明公开了基因检测的引物和试剂盒，尤其涉及一种用于检测MGMT基因甲基化和乙酰化的引物和试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。公开了MGMT基因甲基化和乙酰化引物，试剂盒和使用方法。本发明公开的引物是根据人类MGMT基因启动子序列设计的特异性引物，可使用相对应的试剂盒，通过RT-PCR快速、准确、高灵敏的检测MGMT基因启动子甲基化和乙酰化。

Description

用于检测MGMT基因甲基化和乙酰化的引物和试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，涉及基因检测的引物和试剂盒，尤其涉及一种用于检测MGMT基因甲基化和乙酰化的引物和试剂盒及其检测方法。
背景技术
机体O6-甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)是机体的特异性DNA损伤修复酶，能够将O6-MeG转移到自身145位半胱氨酸残基上，特异性修复烷化剂损伤，而自身不可逆性失活。MGMT水平与肿瘤细胞DNA损伤修复相关。MGMT基因定位于10q26上，全长170kb，含5外显子，4个内含子，其中第1个外显子中是启动子区，含有较多的CG序列，但缺乏TATA盒和CAAT盒。MGMT基因启动子区甲基化和乙酰化是MGMT表达重要调控机制。MGMT基因甲基化是MGMT蛋白表达缺失的重要原因。MGMT基因乙酰化能够通过甲基化结合蛋白影响细胞染色质变化，与核转录因子相互作用，使蛋白表达增加。而MGMT基因去乙酰化能够使蛋白表达降低，所以检测MGMT基因乙酰间接表现MGMT表达程度。MGMT基因甲基化在调控MGMT表达为主导地位，乙酰化为其次地位。
发明内容
本试剂盒包括：1)甲基化和乙酰化引物；2)甲基化处理试剂、乙酰化H3、H4分析试剂、Green Master Mix、无核酶ddH2O、空白对照；3)分隔并集中包装这些试剂。
其中甲基化检测扩增用甲基化上游引物序列为：5’-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3’；扩增用甲基化下游引物序列为：5’-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3’。扩增用非甲基化上游引物序列为：5’-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3’；扩增用非甲基化下游引物序列为：5’-AACTCCACACTCTTCCAA AAACAA AACA-3’。
其中乙酰化检测扩增用上游引物序列为：5’-GCTCCAGGGAAGAGTGTCCTCTGCTCCCT-3’；扩增用下游引物序列为：5’-GGCCTGTGGTGGGCGATGCCGTCCAG-3’。
其中甲基化处理试剂包括：CT Conversion Reagent、M-Dilution Buffer、M-Dissolving Buffer、M-Binding Buffer、M-Wash Buffer、M-DesulphonationBuffer、M-Elution Buffer、Zymo-SpinTM IC Columns、Collection Tubes。
其中乙酰化H3、H4分析试剂包括：CP1(Wash Buffer)、CP2(AntibodyBuffer)、CP3A(Pre-Lysis Buffer)、CP3B(Lysis Buffer)、CP4(ChIP DilutionBuffer)、CP5(DNA Release Buffer)、CP6(Reverse Buffer)、CP7(BindingBuffer)、CP8(Elution Buffer)、Protease Inhibitor Cocktail(100X)、NormalMouse IgG(1mg/ml)、Proteinase K(10mg/ml)、Anti-Acetyl-Histone H3(1mg/ml)、Anti-Acetyl-Histone H4(1mg/ml)、8-Well Assay Strips(withFrame)、8-Well Strip Caps、F-Spin Column、F-Collection Tube。
其中Green Master Mix含有DNA聚合酶、2X绿色反应缓冲液(pH8.5)、400μM dATP、400μM dGTP、400μM dCTP、400μM dTTP和3mM MgCl2。
本发明的引物和试剂盒使用方法，包括以下：1)常规提取待测样本的基因组DNA，对DNA进行亚硫酸盐修饰，按照权利要求2所述引物，进行扩增，检测基因甲基化。2)细胞收集和甲醛交联，细胞裂解和超声破裂，蛋白质/DNA免疫沉淀，DNA交联逆转、富集的DNA片段纯化，按照所述引物，进行扩增，检测基因乙酰化。
本发明公开的引物是根据人类MGMT基因启动子序列设计的特异性引物，可使用相对应的试剂盒，通过RT-PCR快速、准确、高灵敏的检测MGMT基因启动子甲基化和乙酰化。
附图说明
图1是本发明实施例的试剂盒检测细胞MGMT基因甲基化检测结果。
图中，细胞检测后MGMT基因半甲基化，M表示甲基化，U表示非甲基化。
图2是本发明实施例的试剂盒检测细胞MGMT基因乙酰化检测结果。
图中，细胞检测后MGMT基因H3、H4均出现乙酰化。
具体实施方式
1.用于检测MGMT基因甲基化
(1)引物序列如权利要求1所述，其浓度为10pmol/ul。
(2)甲基化处理试剂盒，其包括：CT Conversion Reagent、M-DilutionBuffer、M-Dissolving Buffer、M-Binding Buffer、M-Wash Buffer、M-Desulphonation Buffer、M-Elution Buffer、Zymo-SpinTM IC Columns、Collection Tubes。
(3)Green Master Mix，其含有DNA聚合酶、2X绿色反应缓冲液(pH8.5)、400μM dATP、400μM dGTP、400μM dCTP、400μM dTTP和3mM MgCl2。
(4)无核酶ddH2O。
(5)空白对照。
(6)分隔并集中包装这些试剂。试剂盒的使用方法：
1)提取细胞基因组DNA，每次制备的DNA范围在500pg到2μg之间，最佳量为200-500ng。
2)DNA亚硫酸盐修饰：在PCR管中添加130μl的CT ConversionReagent到每20μl DNA样品中，将样品管放到循环变温器并按以下步骤操作：98℃放置10分钟，64℃放置2.5小时，4℃下存储(最多20小时)或直接进行下面步骤。添加600μl的M-Binding Buffer到Zymo-Spin ICColumn中，并将柱放如试剂盒所提供的Collection Tube中。将循环之后的样品加入到到Zymo-SpinTM IC Columns含有M-Binding Buffer，盖上盖将柱颠倒数次来混合样品。全速(>10,000x g)离心30秒，去除流出液。添加200μl的M-Wash Buffer到柱中，全速离心30秒。添加200μl的M-Desulphonation Buffer到柱中并且在室温(20℃-30℃)下放置15-20分钟，在培养后，全速离心30秒。添加200μl的M-Wash Buffer到柱中，全速离心30秒，再添加200μl的M-Wash Buffer并且离心30秒。直接添加10μl的M-Elution Buffer到柱基质中，将柱放置在1.5ml的管中，全速离心来洗脱DNA。DNA可立刻进行分析或储存在低于-20℃下以备以后使用。
3)PCR扩增：以亚硫酸盐修饰后的DNA为模板，按照权利要求2的引物进行扩增，反应体系为：
循环条件为a)甲基化引物扩增体系：
b)非甲基化引物扩增体系：
4)产物鉴定：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，甲基化产物为81bp，非甲基化产物为93bp。甲基化特异性引物(M)扩增出相应长度的片段，但非甲基化特异性引物(U)未扩增出相应长度的片段，则判断MGMT基因启动子区完全甲基化。甲基化特异性引物(M)和非甲基化特异性引物(U)均扩增出相应长度的片段，则判断MGMT基因启动子区部分甲基化。非甲基化特异性引物(U)扩增出相应长度的片段，但甲基化特异性引物(M)未扩增出相应长度的片段，则判断MGMT基因启动子区非甲基化。
2.用于检测MGMT乙酰化
(1)引物序列如权利要求3所述，浓度为10pmol/ul。
(2)乙酰化H3、H4分析试剂包括：CP1(Wash Buffer)、CP2(Antibody Buffer)、CP3A(Pre-Lysis Buffer)、CP3B(Lysis Buffer)、CP4(ChIP DilutionBuffer)、CP5(DNA Release Buffer)、CP6(Reverse Buffer)、CP7(BindingBuffer)、CP8(Elution Buffer)、Protease Inhibitor Cocktail(100X)、Normal Mouse IgG(1mg/ml)、Proteinase K(10mg/ml)、Anti-Acetyl-Histone H3(1mg/ml)、Anti-Acetyl-Histone H4(1mg/ml)、8-Well Assay Strips(with Frame)、8-Well Strip Caps、F-Spin Column、F-Collection Tube。
(3)其中Green Master Mix含有DNA聚合酶、2X绿色反应缓冲液(pH8.5)、400μM dATP、400μM dGTP、400μM dCTP、400μM dTTP和3mM MgCl2。
(4)无核酶ddH2O。
(5)空白对照。
(6)分隔并集中包装这些试剂。试剂盒的使用方法：
1)细胞收集和甲醛交联：10cm平皿内大约2～4×106细胞(每个反应大约需要0.5×106细胞)胰酶消化，收集到15cm离心管，1000rpm，5minutes离心，去上清。10ml PBS清洗，1000rpm，5minutes离心，去上清。加入9ml培养基，含1％甲醛(终浓度)，在20-25℃处理10分钟。
2)细胞裂解和超声破裂：加入1ml0.125mol/L甘氨酸，在37℃处理5min终止交联反应。1000rpm，5minutes离心，去上清。10ml冷PBS清洗，1000rpm，5minutes离心，去上清。CP3A重悬细胞沉淀(贴壁细胞200μl/1x106细胞)。转移到1.5ml EP管，在冰中孵育10minutes。涡旋10seconds，5000rpm，5minutes离心，去上清。CP3B(含蛋白酶抑制剂PIC，每1ml CP3B加10μl PIC)重悬细胞，在冰中孵育10minutes。超声处理细胞悬液，超声功率35％，共4次，超声时间10秒，间隔40seconds。留取5ul进行琼脂糖凝胶电泳进行细胞DNA片段大小鉴定，在200-1000bp符合要求。细胞破裂液14,000rpm，10minutes离心。然后将上清转移到1.5ml EP管内，-80℃保存。
3)抗体连接到Assay Plate：CP1150ul清洗strip wells一次，弃去。CP2100ul加到每well，然后加抗体：阴性对照组1μl Normal Mouse IgG,，样品组加1μl Anti-Acetyl-Histone H3或者是1μl Anti-Acetyl-Histone H4。封口膜封闭well，室温孵育60-90minutes。
4)蛋白质/DNA免疫沉淀：步骤2)中得到的样品上清液用CP4按体积1:1稀释。取样品稀释液5ul到0.5ml离心管，标记为“Input”。将步骤3中抗体去除，每well用150ul CP2洗3次，弃去液体。每well加样品稀释液100ul，用封口膜在室温封闭1h。弃去上清，用CP1150ul清洗6次，每次摇床100rpm震荡2minutes，最后用150μl的1X TE Buffer清洗。
5)DNA交联逆转、富集的DNA片段纯化：每well样品加入含1ul蛋白酶K的40ul CP5，包括Input管。盖上盖子，65℃水浴15minutes，然后在上清中加入CP640ul，65℃水浴90minutes。混合液转移至2ml收集管，再加入150mlCP7混合，12,000rpm，离心20seconds。加200ul70％酒精到收集管，12,000rpm，离心15seconds，弃去离心液。加200ul90％酒精到收集管，12,000rpm，离心20seconds，弃去离心液。加200ul90％酒精到收集管，12,000rpm，离心35seconds，弃去离心液。将收集管置于1.5ml EP管内，加CP810～20ul，12,000rpm，离心20seconds，得到纯化的DNA片段。DNA可储存在-20℃。
6)PCR扩增：以免疫沉淀后的DNA为模板，按照权利要求1的引物进行扩增，反应体系为：
循环条件为：
产物鉴定：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，大小为为395bp。结果显示input有条带，而阴性对照没有条带，同时Acetyl-Histone H3或HH4位置出现条带，说明为MGMT基因乙酰化。
上面已经举例说明了本发明的实施。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种用于检测MGMT基因的引物，其特征是：包括甲基化引物和乙酰化引物；
所述用于检测MGMT基因甲基化引物，其扩增用甲基化上游引物序列为：5’-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3’；扩增用甲基化下游引物序列为：5’-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3’；扩增用非甲基化上游引物序列为：5’-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3’；扩增用非甲基化下游引物序列为：5’-AACTCCACACTCTTCCAA AAACAA AACA-3’；
所述用于检测MGMT基因乙酰化的引物，其扩增用上游引物序列为：5’-GCTCCAGGGAAGAGTGTCCTCTGCTCCCT-3’；扩增用下游引物序列为：5’-GGCCTGTGGTGGGCGATGCCGTCCAG-3。
2.根据权利要求1所述的用于检测MGMT基因的引物，其特征是：所述引物浓度为10pmol/ul。
3.一种用于检测MGMT基因甲基化和乙酰化的试剂盒，其特征是：该试剂盒包括：1)权利要求1所述的甲基化和乙酰化引物；2)甲基化处理试剂、乙酰化H3、H4分析试剂、Green Master Mix、无核酶ddH2O、空白对照；3)分隔并集中包装这些试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：甲基化处理试剂包括：CTConversion Reagent、M-Dilution Buffer、M-Dissolving Buffer、M-BindingBuffer、M-Wash Buffer、M-Desulphonation Buffer、M-Elution Buffer、Zymo-SpinTM IC Columns、Collection Tubes。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是：所述的乙酰化H3、H4分析试剂包括：CP1(Wash Buffer)、CP2(Antibody Buffer)、CP3A(Pre-Lysis Buffer)、CP3B(Lysis Buffer)、CP4(ChIP Dilution Buffer)、CP5(DNA Release Buffer)、CP6(Reverse Buffer)、CP7(Binding Buffer)、CP8(Elution Buffer)、ProteaseInhibitor Cocktail(100X)、Normal Mouse IgG(1mg/ml)、Proteinase K(10mg/ml)、Anti-Acetyl-Histone H3(1mg/ml)、Anti-Acetyl-Histone H4(1mg/ml)、8-Well Assay Strips(with Frame)、8-Well Strip Caps、F-Spin Column、F-Collection Tube。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是：Green Master Mix从Promega公司购买得到，其含有DNA聚合酶、2X绿色反应缓冲液(pH8.5)、400μM dATP、400μM dGTP、400μM dCTP、400μM dTTP和3mM MgCl2。
7.一种利用权利要求3-6所述的试剂盒检测MGMT基因启动子甲基化和乙酰化的方法，其特征是：
(1)常规提取待测样本的基因组DNA，对DNA进行亚硫酸盐修饰，按照权利要求1所述甲基化引物进行扩增，检测基因甲基化；
(2)细胞收集和甲醛交联，细胞裂解和超声破裂，蛋白质/DNA免疫沉淀，DNA交联逆转、富集的DNA片段纯化，按照权利要求1所述乙酰化的引物，进行扩增，检测基因乙酰化。
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