CN113881773A

CN113881773A - 一种预测甲状腺髓样癌发生淋巴结转移的标志物及其应用

Info

Publication number: CN113881773A
Application number: CN202111226649.1A
Authority: CN
Inventors: 卢冠铭; 孟令章; 陆金兰; 韦忠恒; 马燕飞; 陈永诚; 罗志斋; 黄前方; 余艳蓉; 杨录新; 梁慧; 韦莲萍; 玉奇生; 李新梅; 陆美新
Original assignee: Youjiang Medical University for Nationalities Affiliated Hospital
Current assignee: Youjiang Medical University for Nationalities Affiliated Hospital
Priority date: 2021-10-21
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2022-01-04

Abstract

本发明公开了一种预测甲状腺髓样癌发生淋巴结转移的标志物及其应用。该标志物为SNX20。本发明通过检测SNX20的表达水平，可进行甲状腺髓样癌辅助诊断、预后判断、和/或甲状腺髓样癌发生淋巴结转移预测。根据本发明记载的方案可知，SNX20高表达的个体发生甲状腺髓样癌淋巴结转移的风险低于SNX20低表达的个体。

Description

一种预测甲状腺髓样癌发生淋巴结转移的标志物及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种预测甲状腺髓样癌发生淋巴结转移的标志物及其应用。

背景技术

甲状腺髓样癌在甲状腺中形成的癌症。甲状腺是位于颈部前部的腺体，它负责向身体的其他部位发送激素。临床上，甲状腺髓样癌非常容易通过淋巴系统扩散并转移到其他器官，严重影响临床对该病的治疗效果。因此，及时发现并预测甲状腺髓样癌是否会发生淋巴系统转移，可为临床医生提供重要的参考信息，及时为患者制定、调整治疗策略，提高临床对髓样甲状腺癌的诊断和治疗水平。然而，在临床领域尚无有效的检测方法或手段来为临床工作者提供相应的支持。

目前，基因检测技术因其所需临床样本少、检测灵敏度和特异性高，以及操作难度小，易推广等优点，正在成为业内技术研发的热点，并利用研发成果为预测癌症患者是否会发生转移，以及预测治疗效果提供解决方案。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种预测甲状腺髓样癌发生淋巴结转移的标志物及其应用，可诊断和预测甲状腺髓样癌是否会发生转移。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明检测甲状腺髓样癌组织中SNX20基因的表达水平，用于预测其是否会发生转移；在未发生淋巴结转移的甲状腺髓样癌样本中，SNX20基因表达水平显著高于已发生淋巴结转移的样本。

所述产品包括通过适时荧光定量PCR和荧光成像方法检测SNX20基因及其编码蛋白在甲状腺髓样癌组织样本中的表达水平。若SNX20在组织样本中的表达水平高，则预示患者不太可能发生淋巴结转移；相反则预示极易发生淋巴结转移。

所述产品试剂盒包括核酸扩增引物、荧光标记抗体及所需相关试剂。其中，用于检测SNX20基因表达水平的试剂包括SNX20基因扩增引物，聚合酶链式反应酶，缓冲液等；用于荧光成像检测的试剂包括兔抗人-SNX20抗体，荧光标记驴抗兔二抗等。

上述试剂用于检测甲状腺髓样癌组织中SNX20基因及其编码蛋白的表达水平。与目前临床广泛进行的病理检测相结合，可大大提高诊断、预测甲状腺髓样癌是否发生淋巴结转移的准确定，减小误诊发生的概率。

具体技术方案为：

检测SNX20表达水平的试剂在制备用于甲状腺髓样癌辅助诊断、预后判断、和/或甲状腺髓样癌发生淋巴结转移预测的组合物中的应用。

进一步地，检测SNX20表达水平包括检测SNX20基因的表达水平，或检测SNX20基因编码的蛋白的表达水平。

进一步地，采用RT-qPCR检测SNX20基因表达水平，采用免疫荧光成像检测SNX20基因编码的蛋白表达水平。

进一步地，RT-qPCR检测中，若样本SNX20基因表达水平超过阴性对照样本的5倍，则判定为高表达，反之则为低表达；

所述免疫荧光成像检测中，若SNX20基因编码的蛋白的荧光强度高于阴性对照，则判定为高表达，反之则为低表达。

进一步地，SNX20高表达的个体发生甲状腺髓样癌淋巴结转移的风险低于SNX20低表达的个体。

进一步地，SNX20基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种用于检测SNX20基因表达水平的引物，引物序列如SEQ ID NO.2和NO.3所示。

上述试剂和/或引物在制备用于甲状腺髓样癌辅助诊断、预后判断、和/或甲状腺髓样癌发生淋巴结转移预测的试剂盒中的应用。

进一步地，试剂盒包括SNX20单克隆抗体。

本发明中的试剂盒可用于检测人SNX20基因的表达，优选的，所述的试剂盒包括检测有效量的检测SNX20基因及其编码蛋白的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、管家基因，阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。例如用于稀释cDNA的去RNase酶的超纯水，固定冰冻切片的溶剂，可检测的标签或标记，扩增cDNA的溶液，用于免疫荧光检测的抗体、缓冲液等。

上述检测SNX20基因及其编码蛋白表达水平的试剂可以是所属领域中已知的任何可检测来自个体的待测样品中SNX20基因及其编码蛋白表达水平的试剂，例如采用限制性片段长度多态性分析、反转录-聚合酶链式反应、荧光原位杂交法、放射性免疫分析、竞争性结合法、Western印迹分析法、酶联免疫吸附法或免疫组化等方法检测SNX20基因及其编码蛋白表达水平的试剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对SNX20基因及其编码蛋白的表达水平进行判断。

采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的两种方法(包括但不限于)检测SNX20：RT-qPCR和免疫荧光成像。

本发明的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸扩增技术和免疫检测技术。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数。

一种抑制甲状腺髓样癌发生淋巴结转移的药物，药物能够提升SNX20的表达量。

本发明的有益效果：

本发明通过第二代单细胞转录组测序技术(scRAN-seq)，结合我国研发的基因表达与临床队列研究交互大数据平台(Gene Expression Profiling InteractiveAnalysis,GEPIA)，对髓样甲状腺癌样本中的19155个细胞进行转录组测序，从获取的45773个基因中。基于基因表达水平的聚合和离散趋势，共分离出11种细胞类型，其中未转移与已发生淋巴结转移的样本相比，SNX20基因的表达水平均显著高于后者，且与RT-qPCR和免疫荧光成像结果吻合。从而筛选出SNX20基因可作为临床诊断的标志物。为预测甲状腺髓样癌是否会发生转移提供技术支持。

本发明首次发现了分子标志物SNX20与甲状腺髓样癌淋巴结转移的相关性，通过检测受试者SNX20的表达水平，可用于预测、诊断受试者是否发生淋巴结转移。

附图说明

图1为单细胞转录组测序技术检测SNX20在甲状腺髓样癌中的表达情况(基因特征图)；

图2为单细胞转录组测序技术检测SNX20在甲状腺髓样癌中的表达情况(基因提琴图)；

图3为RT-qPCR技术检测SNX20基因在甲状腺髓样癌组织中的表达水平；

图4为荧光成像技术检测SNX20编码的蛋白在甲状腺髓样癌组织中的表达水平。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

在本发明中，术语“抗体”是指选择性结合SNX20编码蛋白的抗体。本文中主要指单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子外，那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物以及选择性结合目标抗原的免疫球蛋白分子的人类或人源化形式也包括在术语“抗体”的范围内，只要它们展现出期望的生物学活性即可。“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体。单克隆抗体还包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性即可。

本发明中术语“样本”特指外科手术切除或穿刺获得的甲状腺髓样癌患者的样本。

以本领域熟练技术人员已知的方式利用该试剂盒检测患者SNX20基因及其编码蛋白的表达水平。

对分子生物学和/或免疫学熟悉的操作人员可容易地合作本试剂盒。并根据检测结果判断SNX20基因及其编码蛋白在甲状腺癌患者组织样本中的表达水平。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1、将甲状腺髓样癌患者分为两组，一组为未发生淋巴结转移的患者，一组为已发生淋巴结转移的患者，对术后切除的癌组织进行单细胞转录组测序。利用基因特征图显示SNX20基因在以上两组癌组织中细胞集群的表达水平，其结果如图1所示。

2、将甲状腺髓样癌患者分为两组，一组为未发生淋巴结转移的患者，一组为已发生淋巴结转移的患者，对术后切除的癌组织进行单细胞转录组测序。利用基因提琴图显示SNX20基因在以上两组癌组织的表达水平，其结果如图2所示。

根据图1和图2的检测结果可知，在未发生淋巴结转移的患者样本中，SNX20基因表达量显著高于发生淋巴结转移的患者。

实施例2

1、RT-qPCR检测用引物设计

本申请中用于RT-qPCR的SNX20引物按照常规方法进行设计。即在ENSEMBL数据库中下载人SNX20基因序列，将下载的序列导入NCBI PrimerBlast在线引物设计软件，设置好RANGE和PCR产物的大小，然后在下面点击GET PRIMERS，经过数据库后台运行和计算后，反馈所获得的引物序列。

本发明中用于检测RT-qPCR技术检测SNX20基因表达水平的引物序列为：上游引物:5’-ACCTGACGGGCACTTAGACA-3’(SEQ ID NO.2)；下游引物:5’-AGAGCAGTTTGACGTGCTTCC-3’(SEQ ID NO.3)。扩增片断大小为119bps。上述序列可经由生物公司合成并市售。

2、免疫荧光成像技术检测SNX20基因编码蛋白表达水平所需抗体

一抗：mouse-anti-human SNX20单克隆抗体(4E9)；

二抗：FITC Goat-anti-mouse IgG(H+L)。以上两种抗体均有市售。

实施例3 SNX20基因表达与甲状腺髓样癌患者淋巴结转移的关联性研究

1、样本处理

将手术剥离的发生淋巴结转移的甲状腺髓样癌样本分为两份。第一份用于提取RNA；第二份则包埋进行冰冻切片。

(1)RNA分离按照产品说明书使用TRIzol试剂分离总RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)、2100生物分析仪(RNA6000 NanoLabChip；安捷伦科技公司，Santa Clara，CA)、琼脂糖凝胶电泳来评估RNA的纯度，浓度和完整性。

(2)冰冻切片：按照产品说明书用包埋剂(LEICA FSC22 Clear)进行包埋，置于液氨上面缓慢固定。将固定好的样本12小时内使用冰冻切片机(LEICA CM1950)进行切片，切片厚度以4-6μm为宜。

2、RT-qPCR检测SNX20基因表达水平

使用TaqMan Gold RT-PCR试剂盒(Applied Biosystems)以100ng总RNA为模板合成cDNA(具体步骤参见产生说明书)。

使用iCycler IQ系统(Bio-Rad)进行定量实时PCR(qPCR)。将cDNA样品稀释10倍，使用SYBR green JumpStart Taq ReadyMix(Sigma-Aldrich)和100μM引物进行实时PCR反应。然后，在ABI Prism 7000序列检测系统(Applied Biosystems)中扩增了上述产物。扩增条件是：55℃，2分钟；95℃，10分钟；95℃，15秒，共35次循环，然后60℃，10分钟。并以GAPDH作为参考基因以标准化所有样品，其检测结果见图3。

引物序列如下：

SNX20上游引物：5’-ACCTGACGGGCACTTAGACA-3’(SEQ ID NO.2)；

SNX20下游引物：5’-AGAGCAGTTTGACGTGCTTCC-3’(SEQ ID NO.3)；

GAPDH上游引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(SEQ ID NO.4)；

GAPDH下游引物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(SEQ ID NO.5)。

如图3所示，以未发生淋巴结转移的甲状腺髓样癌为阴性对照样本，在未发生淋巴结转移的样本中，SNX20基因的表达量显著高于发生淋巴结转移的样本。同时，可以得出，若SNX20基因表达水平超过5倍，则判定为阳性(高水平表达)；反之则判为阴性(低水平表达)。

3、免疫荧光成像检测SNX20基因编码蛋白表达水平

将切片好的样本置于-20℃甲醇中固定10分钟；置于PBS缓冲液中洗2次，每次5分钟；用PBS/1％BSA封闭1小时；加一抗(1:1000)4℃孵育8小时；用PBS缓冲液洗2次，每次5分钟；加二抗(1:1000)室温孵育1小时，背光处晾干；封片，其检测结果见图4。

如图4所示，以未发生淋巴结转移的甲状腺髓样癌为阴性对照样本，若荧光强度明显高于阴性对照，则判定为阳性(SNX20高水平表达)；反之则判为阴性(SNX20低表达)。

4、综上所述，可以推测：SNX阳性组预示甲状癌髓样癌患者小概率发生淋巴结转移，反之则为大概率发生淋巴结转移。

若RT-qPCR方法与免疫荧光方法相矛盾，则可判定为可疑样本。

序列表

<110> 右江民族医学院附属医院

<120> 一种预测甲状腺髓样癌发生淋巴结转移的标志物及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacaaaaaag 60

ttggcatggc aagtccagag caccctggga gccctggctg catgggaccc ataacccagt 120

gcacggcaag gacccagcag gaagcaccag ccactggccc cgacctcctg cacccaggac 180

ctgacgggca cttagacaca cacagtggcc tgagctccaa ctccagcatg accacgcggg 240

agcttcagca gtactggcag aaccagaaat gccgctggaa gcacgtcaaa ctgctctttg 300

agatcgcttc agctcgcatc gaggagagaa aagtctctaa gtttgtggct ccggctcctg 360

acgccacacc ctgcccaact ttcttgtaca aagttggcat tataagaaag cattgcttat 420

caatttgttg caacgaac 438

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acctgacggg cacttagaca 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagcagttt gacgtgcttc c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims

1.检测SNX20表达水平的试剂在制备用于甲状腺髓样癌辅助诊断、预后判断、和/或甲状腺髓样癌发生淋巴结转移预测的组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测SNX20表达水平包括检测SNX20基因的表达水平，或检测SNX20基因编码的蛋白的表达水平。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用RT-qPCR检测SNX20基因表达水平，采用免疫荧光成像检测SNX20基因编码的蛋白表达水平。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述RT-qPCR检测中，若样本SNX20基因表达水平超过阴性对照样本的5倍，则判定为高表达，反之则为低表达；

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述SNX20高表达的个体发生甲状腺髓样癌淋巴结转移的风险低于SNX20低表达的个体。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述SNX20基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

7.一种用于检测SNX20基因表达水平的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ IDNO.2和3所示。

8.权利要求1所述试剂和/或权利要求7所述引物在制备用于甲状腺髓样癌辅助诊断、预后判断、和/或甲状腺髓样癌发生淋巴结转移预测的试剂盒中的应用。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SNX20单克隆抗体。

10.一种抑制甲状腺髓样癌发生淋巴结转移的药物，其特征在于，所述药物能够提升SNX20的表达量。