CN104004847A - 猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及试剂盒 - Google Patents

猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物和检测试剂盒。所述检测用引物为序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4，本发明还提供了猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒。本发明所选引物特异性强，且能同时检测三种病原，节约成本、减少步骤，提高效率。本发明方法具有高特异性、高灵敏度，高效率、稳定性好的特点。

Description

猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及检测试剂盒。
背景技术
猪的附红细胞体病主要引起仔猪发热、贫血苍白、黄疸和母猪流产等症状，常与其他猪病混合感染危害严重，防治十分困难。近年来研究表明感染猪的附红细胞体的种类有两种，猪附红细胞体(Mycoplasma suis MS)和小附红细胞体(Mycoplasma parvum MP)，原来归于立克兹氏体目质体科，近年来根据16SrRNA基因的序列分析和电镜的观察结果，将附红细胞体划分到支原体属的嗜血支原体。我们在附红细胞体感染的猪体内分离到第三种感染猪的新附红细胞体病原，并在Genbank上公布了其16S rRNA和rnpB基因序列(登录号JX489600和JX489603)，暂定名为未定种附红细胞体(Candidate mycoplasmahaemosuis CMH)。由于嗜血支原体都不能够纯培养，对其研究造成很大的困难。目前临床上主要依靠显微镜检查鲜血压片和姬姆萨染色片进行诊断，这些方法存在滞后性和显著的假阳性，实验室诊断方法有检测抗体的酶联免疫吸附法(ELISA)和检测病原的聚合酶链式反应(PCR)诊断方法，但现有的诊断方法主要针对的病原为猪附红细胞体MS，对其他两种病原体MP和CMH的诊断方法尚未有报道。同时根据我们的临床调查发现，在我国浙江上海安徽等地区感染猪的附红细胞体种类主要为MP而并非国内外研究较多的MS。为了能够明确这类病原的致病性和致病机理，亟需可以诊断三种病原的诊断方法。
本发明首次将PCR技术应用于同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测领域，提供了针对猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测的特异性引物、试剂盒和检测方法。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的核苷酸序列。
本发明要解决的第二个技术问题是提供快速、准确、使用方便的同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测引物，具体如下：
通过序列比较分析，根据猪附红细胞体ZJ NB01株16Sr RNA基因序列(GenBank登录号：KC907396)保守区199-582位置和小附红细胞体ZJ JX9330株16Sr RNA基因序列(GenBank登录号：HQ489599)保守区198-581位置设计一对通用引物：
1)MP和MS正义引物(MF)
5'TAAATTAAAGGAGGCTGCCGMAAGGTG3'(SEQ ID NO：1)；
2)MP和MS反义引物(MR)
5'TACGCCCAATAAATCCGGATAATGCTC3'(SEQ ID NO：2)；
其中，M代表兼并碱基A或C；
扩增目的片段为384bp，扩增到MS序列如序列表SEQ ID NO：5所示；
其中，21bp处M代表兼并碱基A或C。
扩增到MP序列如序列表SEQ ID NO：6所示；
通过序列比较，根据未定种附红细胞体CMH已公布的ZJ SXSY1102株16Sr RNA基因序列(GenBank：JX489600)，在其保守区441-972位置设计一对引物：
3)CMH正义引物(CMHF)
5’AAACTCTGATGGTACCTCCTGAATAAGTGA3’(SEQ ID NO：3)；
4)CMH反义引物(CMHR)
5’CCTTCGCTGGGGATGTCAAACCT3’(SEQ ID NO：4)；
扩增目的基因大小为532bp，序列如序列表SEQ ID NO：7所示；
其中，490bp处M代表兼并碱基A或C。
本发明还提供了一种猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，由以下组分组成：
1)DNA提取试剂；通常可以使用商业购买的血液DNA提取试剂盒，例如杭州新景生物技术开发有限公司的全血DNA提取试剂盒(Blood DNA Minikit，Cat.No.3001050)；
2)DNA标准品：含猪附红细胞体靶基因的T载体质粒和含未定种附红细胞体靶基因的T载体质粒；
3)PCR反应液，其包括：PCR缓冲液，dNTP，Taq DNA聚合酶，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物、反义引物，检测未定种附红细胞体的正义引物、反义引物；
优选使用：1×PCR缓冲液，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和未定种附红细胞体正义引物0.2μM、反义引物0.2μM，Taq DNA聚合酶1U，dNTP；
所述Taq DNA聚合酶为TakaRa TaqTM，购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A。所述引物均委托上海英潍捷基贸易有限公司合成。
4)阴性对照：DEPC水；
5)DEPC水；1mL x2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore纯水仪纯化，电阻率大于18.0MΩ.CM。
6)电泳观察结果：5μL PCR反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察结果。
其中，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物为序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；检测未定种附红细胞体的正义引物为序列表SEQ ID No：3所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒的使用方法：
1.样品采集、运送及制备
具苍白贫血发热等症状的病猪，采集抗凝血1-2mL，置于4℃保鲜盒中，运送回实验室。-4℃保存备用。
2.DNA提取
按照全血DNA提取试剂盒试剂盒提供的方法提取病原DNA，具体方法如下：
(1)取300μl缓冲液L1移入到1.5ml离心管中；
(2)加入400μl全血，在漩涡振荡器上混匀(30s)；
(3)加入300μl缓冲液L2，剧烈摇晃离心管3-5次，在漩涡振荡器上混匀(30s)；
(4)13000rpm离心2min；
(5)将步骤4中的上清液倒入到核酸纯化柱中，盖上管盖，置于2mL收集管中，12000rpm离心30s；
(6)弃去收集管中的滤液，把柱子放置回收集管，在柱子中加入500μL缓冲液WA，盖上管盖，12000rpm离心30s；
(7)弃去收集管中的滤液，把柱子放置回收集管，在柱子中加入600μL缓冲液WB，盖上管盖，12000rpm离心30s；
(8)弃去收集管中的滤液，把柱子放置回收集管，14000rpm离心1min；
(9)弃去收集管，把柱子放进一个洁净的1.5ml离心管中，加入100μl56℃温育的缓冲液TE，盖上管盖，室温放置1min，12000rpm离心1min，1.5ml离心管中即为病原DNA，可立即用于PCR反应，或者-20℃保存备用。
3.聚合酶链式反应PCR：
200μl PCR反应管，设置阴性对照管和阳性对照管，其余为样品检测管。
反应体系为25μL，见表1：
表1
其中，Taq DNA聚合酶为TakaRa TaqTM，购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A。
所述的模板DNA，是用全血提取的DNA为模板，阴性对照模板为DEPC水，阳性对照模板为含有猪附红细胞体和未定种附红细胞体靶基因的T载体质粒。
检测条件为：在PTC-200PCR仪上进行反应，反应条件为95℃5分钟，然后经过95℃30秒钟，61.5℃30秒钟，72℃30秒钟36个循环，72℃10分钟。
4.电泳观察结果：5μL PCR反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察结果。
5.基因测序，如果在384bp处出现电泳带，即MS/MP阳性，可进一步将该电泳带回收，提取DNA并进行基因测序以分别鉴定猪附红细胞体和小附红细胞体。
而实际在临床检测中，猪的附红细胞体病的病原目前发现有三种MS，MP和CMH，其中MS和MP的症状并未发现有不同之处，无论感染MS或者MP均会导致出现猪附红细胞体病，为了快速诊断猪的附红细胞体病，只需要能够检测到MS、MP或CMH的任一种即可表明样本被感染，不需要进一步进行基因测序来区分鉴别MS和MP。本发明的试剂盒通过多重PCR，可快速的一次性检测MS，MP和CMH三种病原，能够快速诊断猪的附红细胞体病，如果需要区分和鉴定MS和MP，则可进一步进行基因测序。
本发明的有益效果如下：
本发明的试剂盒包括特异性引物，通过多重PCR方法，能够在一个PCR管中同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体三种病原，大大节约了试剂耗材、检测时间、提高了检测效率，而且具备较高的特异性和灵敏度。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1试剂盒的组成
1.试剂盒的组成
1)DNA提取试剂；杭州新景生物技术开发有限公司的全血DNA提取试剂盒(Blood DNA Mini kit，Cat.No.3001050)；
2)DNA标准品：含猪附红细胞体靶基因的T载体质粒和含未定种附红细胞体靶基因的T载体质粒；
3)PCR反应液，其包括：PCR缓冲液，dNTP，Taq DNA聚合酶，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物、反义引物和检测未定种附红细胞体的正义引物、反义引物；
优选使用：1×PCR缓冲液，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和未定种附红细胞体正义引物0.2μM、反义引物0.2μM，Taq DNA聚合酶1U，dNTP0.1mM each；
所述Taq DNA聚合酶为TakaRa TaqTM，购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A。所述引物均委托上海英潍捷基贸易有限公司合成。
4)阴性对照：DEPC水；
5)DEPC水；1mL x2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore纯水仪纯化，电阻率大于18.0MΩ.CM。
其中，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物为序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；检测未定种附红细胞体的正义引物为序列表SEQ ID No：3所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
2.DNA标准品的制备
1)猪附红细胞体和未定种附红细胞体基因的PCR扩增
利用杭州新景生物技术开发有限公司的全血DNA提取试剂盒(Blood DNAMini kit，Cat.No.3001050)，从采集到的病猪全血中(MS和CMH病猪全血都为浙江省农业科学院寄生虫组鉴定保存)中提取病原MS和CMH的DNA，并以此为模板，分别以MF和MR、CMHF和CMHR为上下游引物扩增目的基因，得到384bp、532bp大小的DNA片段，与预期大小相符。
2)猪附红细胞体和未定种附红细胞体基因的T载体克隆
将猪附红细胞体和未定种附红细胞体基因的PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化后连接到大连宝生物公司购买的pMD18-T载体中，转化Top10感受态细胞，筛选出阳性克隆，送Invitrogen公司测序验证。
3)猪附红细胞体和未定种附红细胞体基因的PCR阳性标准品的制备
经过NCBI BLAST程序比对验证序列，正确后大量提取阳性质粒，并纯化，测其浓度和纯度，-20℃保存，做标准品备用。
实施例2试剂盒的特异性试验
1.材料，见表2：
2.方法：
利用本发明所述的试剂盒使用方法对猪常见部分相关细菌病和寄生虫病进行检测，同时以3×106copy/μL浓度的阳性质粒为阳性控制，验证其特异性。
3.结果
本发明试剂盒对表2所列出的5种猪细菌病和寄生虫病进行检测，只有阳性控制出现扩增条带，结果表明，本发明试剂盒特异性良好。
实施例3试剂盒的敏感性检测
为了验证本发明试剂盒的检测敏感性，以10倍稀释的DNA标准品(3×106～3×101拷贝/μL)为模板，每个稀释度的模板分别加5μL，同时设阴性对照，按照所建立的方法，在PCR仪上进行扩增反应，当模板为3×102拷贝/μL时，其电泳结果可见532bp和384bp两条特异性条带，当模板3×10拷贝/μL时，其电泳结果可见384bp的特异性条带，表明本实验所建立的方法最低能检测到CMH为3×102拷贝/μL的D NA，检测到MS和MP为3×10拷贝/μL的DNA。
实施例4重复性试验
为了检验本发明所述的二重PCR试剂盒检测MS、MP和CMH方法的重复性，进行了批间重复实验和批内重复实验，结果见表3，重复结果相同，从而表明该检测方法具有很好的稳定性。
表3猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体病原快速检测试剂盒的批间和批内的重复性检验
实施例5临床验证
利用本发明二重PCR检测试剂盒，对从浙江11个县市采集到的62份猪全血样品进行MS、MP和CMH的检测，同时设阴阳性对照。检测结果为：62份猪全血样品中MP和MS阳性14份，阳性率为22.6％；CMH阳性3份，阳性率为4.8％；混合感染1份。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (5)

1.一组检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的核苷酸引物，其特征在于，所述核苷酸引物为序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别为检测未定种附红细胞体的正义引物和反义引物。
2.一种猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：
1)DNA提取试剂；
2)DNA标准品；
3)PCR反应液，其包括：PCR缓冲液，dNTP，Taq DNA聚合酶，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物、反义引物，检测未定种附红细胞体的正义引物、反义引物；
4)阴性对照：DEPC水；
5)DEPC水；
其中，检测猪附红细胞体、小附红细胞体的正义引物为序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；检测未定种附红细胞体的正义引物为序列表SEQ ID No：3所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂为DNA提取试剂盒。
4.根据权利要求2所述的猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA标准品包括猪附红细胞体靶基因的T载体质粒和未定种附红细胞体靶基因的T载体质粒。
5.根据权利要求2所述的猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括1×PCR缓冲液，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM，检测未定种附红细胞体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM，Taq DNA聚合酶1U，dNTP。
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