KR101562460B1 - 요네병 특이적 마커를 포함하는 요네병 진단용 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 요네병에서 차별적으로 발현되는 유전자 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 cl4, ccl5, cxcl12, fabp2, hp, pigr, abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커는 동물의 요네균 감염 여부를 초기에 효과적으로 검출하여, 요네병 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

요네병 특이적 마커를 포함하는 요네병 진단용 조성물 및 방법 {Composition and Method for diagnosing johne’s disease comprising biomarkers specific for johne’s disease}

본원은 요네병 특이적 바이오마커를 이용한 동물의 요네병의 진단 조성물 및 방법에 관한 것이다.

요네병(Johne's Disease, Bovine paratuberculosis)은 요네병원균 (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, MAP) 감염에 의한 소, 양, 산양 등 반추동물에 발생하는 만성, 소모성 질병으로, 장점막의 비후와 추벽형성을 특징으로 하며, 만성의 설사, 쇠약으로 결국은 폐사하게 되는 질병이다.

나아가 감염된 동물은 또한 사료, 음수, 우유 등을 오염시키는 중요한 전염원으로 작용한다. 특히 우유의 저온 살균에도 저항성을 나타내기 때문에 공중위생학적으로도 매우 중요한 질병이다. 우리나라에서는 최근 젖소, 한우에서 감염이 확산되고 있어 막대한 경제적인 피해를 주고 있어 제2종 가축전염병으로 규정하여 관리하고 있다.

요네병균은 잠복기가 길고(2~3년) 감염 초기엔 뚜렷한 임상증상 발현 없고 분변으로 배설된 균을 통해 다른 동물에게 전염된다. 이에 상기 질병에 효과적으로 대응하기 위하여 요네병 초기단계에서 감염 동물을 진단하여 격리시켜 감염의 확산을 방지하는 것이 필수적이다.

하지만 요네병균은 성장 속도가 느리며, 미코시드 C, 마이콜산, 펩티도글리칸 및 리포폴리사카라이드를 함유하는 특이적 세포벽 구조를 가지고 있기 때문에 화학적 물리적 치료제에 대하여 강한 저항성을 가지고 있기 때문에[Levyfrebault VV, Portaels F (1992) International Journal of Systematic Bacteriology 42: 315-323], 질병을 진단하고 제어하는 것이 매우 어렵다.

요네병은 대한민국에 1967년에 최초로 보고된 이후 초기에는 요닌을 피부에 투여하고 이에 대한 면역반응 여부에 기초한 진단법이 사용되었다(Choi et al., Res. Rept. RDA, 11(5), 35-45, 1968). 그러나 상기 방법은 요닌의 순수 분리 정제, 가검물에 사용불가 등을 포함하는 여러 가지 현실적 문제점이 있었다. 이에 체액성 면역에 기초한 AGID(agar gel immunodiffusion), CF(complement fixation)테스트, ELISA 방법 등 다양한 혈청학적 진단방법들이 개발이 시도되었다(Kim et al., J. Vet. Res. 34(1), 93-97, 1994; Kim et al., J. Vet. Res. 37(2), 349-358, 1997; Kim et al., J. Vet. Res. 42(1), 81-88, 2002). 특히 동시에 다량의 혈청을 처리할 수 있는 ELISA 기법의 특이성과 민감성을 높이기 위해 요네병균의 초음파처리된 항원, 요닌(Johnin), 재조합 항원 등의 다양한 항원의 개발이 시도 되었고, 요네병균 ModD 단백질의 C-말단 부위를 분석하여 B-세포 에피토프와 상관관계를 분석하였으며, 비특이 미코박테리움 속균 감염과의 감별진단을 위한 인터페론-γ 어세이법 등의 개발이 시도되었다(Kim et al., J. Vet. Res. 42(1), 81-88, 2002; Park et al., J. Vet. Sci. 7(4), 349-354, 2006; Cho et al., Protein Exp. Purif. 53, 411-420, 2007; Cho et al., J. Immuno. Immunochem. 31, 181-192, 2010). 또한 소 요네병진단의 표준(golden standard)인 분변으로 요네병균의 배양 및 검출률의 향상을 위해 배양배지의 개량, PCR 기법 적용, Bactec 시스템의 이용 등 다양한 방법이 시도되었다.

요네병 진단은 크게 임상형 진단과 준임상형 진단으로 크게 나누어지며, 상술한 바와 같은 진단은 임상형 진단으로, 요네균의 효과적 방제를 위해서는 초기에 감염 여부를 검출할 준임상형 진단이 중요하다. 준임상형 상태에서 균을 배출하는 개체(fecal shedder in subclinical stage)를 검출하기 위한 연구가 진행되고 있다. 대한민국 공개특허공보 제2014-0000810호에는 분변 중 요네균 신속분리를 위한 항체 및 자석 나노입자를 이용한 검출방법이 개시되어 있다. 또한 국제공개공보 WO 2005/035787에는 미코박테리움 아비움 아종명 파라투베르큘로시스의 분자적검출에 대하여 개시되어 있다.

하지만, 아직까지 준임상형 상태에서 혈청내 항체 생산 단계에 대한 유전체 변화에 대한 분석을 통해 선발된 바이오마커에 대한 연구는 없는 실정이다.

본원은 동물 요네병의 진단을 위한 바이오마커를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, hp, pigr, abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg 및 tnfsf13b로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 검출 시약을 포함하는 검체의 요네균(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) 감염 여부 검출용 조성물을 제공한다.

다른 양태에서 본원은 또한 상기 하나 이상의 바이오마커의 검출 시약을 포함하는 검체의 요네균 감염 여부 검출용 키트를 제공한다.

본원은 또한 대상체 유래의 검체로부터 ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, hp, pigr, abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 존재 또는 양을 검출, 및/또는 그 RNA의 존재여부 또는 그 양을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 마커의 존재여부 또는 양을 검사 대상체 요네병 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 요네병의 검출 또는 진단 방법을 제공한다.

본원에 따른 바이오마커는 요네병을 조기 진단할 수 있는 바이오마커로서, 특히 감염 초기의 뚜렷한 임상 증상 발현이 없는 동물을 조기에 격리시킬 수 있어, 요네병 방제에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 요네병 감염 단계에 따른 숙주동물(소) 각 그룹에서, A)는 상기 각 그룹에서 보이는 유전자 발현 레벨을 산포도로 나타낸 것이며, B)는 상기 각 그룹에서 발현 변화가 +1.5 이상, 그리고 P < 0.05를 동시에 만족하는 유전자의 개수를 나타낸 것이다.
도 2는 요네병 감염 단계에 따른 숙주동물(소) 각 그룹에서, 테스트 1, 테스트 2, 및 테스트 3 그룹 각각과 대조군을 비교하여, 증가한 유전자 및 감소한 유전자의 공통 유전자 개수를 벤 다이어그램으로 분석한 것을 나타낸다.
도 3은 요네병 감염 단계에 따른 숙주동물(소) 각 그룹에서, 계통적 클러스터링 분석을 통하여 각 그룹의 샘플들에 대한 유전자의 유사성을 그룹화한 것을 나타낸다.
도 4는 본원에 따른 바이오마커에 대한 정량적 실시간 PCR 및 마이크로어레이 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

본원은 요네병균(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, MAP) 감염에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 차별 발현 유전자를 규명하고, 요네병 진단 마커로 사용할 수 있음을 발견하였다.

따라서, 한 양태에서 본원은 ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, hp, pigr, abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 검출 시약을 포함하는 검체의 요네균(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) 검출용 조성물에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 “요네병”은 요네균의 감염에 의해 소, 양, 산양 등 반추 동물 및 사슴, 돼지 등에서 만성장염을 일으키는 전염병으로 만성적인 장염이 주된 증상이며, 증체율감소, 유방염, 산유량감소, 수태율 저하 및 장내에서 영양분 흡수 억제로 결국 영양부족으로 죽게되는 세균성 질병을 일컫는 것이다.

본원의 조성물에 포함되는 바이오마커는 cl4, ccl5, cxcl12, fabp2, hp, pigr, abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b 전체명칭, 기능 및 발현 변화 정도는 하기 표에 기재되어 있으며, 상기 유전자는 요네병의 진단 또는 검출을 위한 마커로서 알려지지 않았다.

[표 1-1]

[표 1-2]

요네병은 수년에 걸쳐 아주 서서히 진행되어 임상증상이 나타나며, 준임상형 보균자라도 분변으로 요네병균을 배설하여 다른 가축을 감염시킬 수 있기 때문에, 임상증상이 나타나기 전, 준임상 상태에서 보균자의 조기 진단이 무엇보다 중요하며, 본원에 따른 마커는 특히 준임상 상태에서의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

표 1에 나타난 바와 같이 요네병균 분변 배출 (shedding) 초기 군인 테스트 1 그룹에서 ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, 및 hp 가 바이오마커로 사용될 수 있다.

따라서 일 구현예에서 ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, 및 hp 유전자는 분변 배출 단계인, 요네병 초기 감염의 진단 및 예후에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 혈청내 항체를 형성한 테스트 2 와 3그룹 중에서 분변 배출을 하지 않는 그룹(테스트 2)에서는 pigr 이, 분변 배출을 나타내는 그룹(테스트 3)에서는 abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b이 바이오마커로서 사용될 수 있다.

본원에 조성물에 포함된 바이오마커 중에서 상기 cxcl12, fabp2, pigr, adm, c3, cd68, hgf, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, tnfsf13b 유전자는 감염되지 않은 대조군과 비교하여 과발현되고, ccl4, ccl5, hp, abcb1, acp5, ikzf, il10, mapt 유전자는 대조군과 비교하여 저발현된 것이다.

본원의 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 요네병 상태의 동정, 요네병의 단계 결정)를 판정하는 것 을 포함한다.

본원에서 용어 “검출”은 정량적 검출 또는 존재여부 수준에서의 검출을 모두 포함하는 것으로, 요네병의 발병 및 진행에 대한 지표가 될 수 있으며, 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.

또한 본원에 따른 검출은 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지된 것으로서, 후술하는 바와 같이 검출시약을 이용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원의 용어 "진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 요네병이 발생한 개체, 조직 또는 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 조직이나 부위에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 물질이다. 본원에 따른 요네병 진단 마커 중, cxcl12, fabp2, pigr, adm, c3, cd68, hgf, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, tnfsf13b는 발현이 증가하며, ccl4, ccl5, hp, abcb1, acp5, ikzf, il10, mapt 유전자는 발현이 감소한다.

본원에서 용어 "검체"는 동물로부터 얻어지는 모든 고형 또는 액상의 시료, 예컨대, 특정 장기 유래의 조직, 분변, 오줌, 타액, 전혈, 혈장 또는 혈청 시료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 구현예에서 본원에 사용되는 검체는, 비교 분석을 위해, 진단이 필요한 대상체의 검체는 물론, 정상 대조군, 특정 질환을 갖는 대조군 유래의 검체가 또한 사용될 수 있다. 본원의 일 구현예에서는 혈장, 혈청, 전혈이 검체로서 사용될 수 있다.

본원의 조성물에 포함되는 검출시약은 본원의 마커를 핵산 예를 들면 DNA 또는 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 정량적으로 또는 그 존재여부의 판단을 검출할 수 있는 물질이다.

핵산 수준, 예를 들면 DNA 또는 RNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 중합효소연쇄반응 (PCR), 전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 상기 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로, 예를 들면 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프라이머를 포함한다. 프라이머는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 일 구현예에서는 검출시약으로 본원에 따른 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 것이다. 상기 abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b 단백질 및 그 핵산 서열은 공지된 것이며, 이의 기능적 동등체를 포함하는 것으로 당업자라면 각 유전자의 검출을 위한 특이적인 프라이머, 프로보 등을 제작할 수 있을 것이다.

단백질의 양, 존재여부 발현패턴의 분석을 위한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테를로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등을 들 수 있다.

상술한 방법에 사용되는 단백질 또는 핵산 수준검출을 위한 시약은 공지된 것으로서, 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자 등을 포함할 수 있다. 또한 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약은 역전사 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, DNA 칩 또는 노던블랏에 사용되는 시약으로, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 프라이머, 프로브 등을 포함한다.

상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)과 함께 사용될 수 있다. 또한 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 형광물질과 같은 발색물질과 컨쥬게이션 된 것일 수 있다.

본원의 다른 구현예에 따르면 검출시약은 RNA 분석용 시약으로, 본원의 abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b 검출은 mRNA 수준에서 실시된다. mRNA 검출은 통상 노던블랏이나 역전사 PCR (중합효소연쇄반응)을 통해 수행된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성 한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H.; Bearss, D. J.; Browne, L. W.; Calaluce, R.; Nagle, R. B.; Von Hoff, D. D., Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray. Cancer Res 2002, 62, (10), 2890-6)에 기재되어 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 하나 이상의 마커의 검출 시약을 포함하는 요네병 진단 및/또는 검출용 키트에 관한 것이다.

또다른 양태에서 이러한 본원의 마커를 검출할 수 있는 시약은 구획이 되어 있는 용기에 개별적으로 분주되어 존재할 수 있으며, 이러한 의미에서 본원은 또한 본원의 마커 검출시약을 구획되어 포함하는 장치/기구에 관한 것이다.

다른 양태에서 본원은 대상체 유래의 검체로부터 ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, hp, pigr, abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커의 존재 및/또는 양을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 마커의 존재여부 또는 양을 요네병과 연관시키는 단계를 포함하는 요네병 진단방법에 관한 것이다.

본원에서 대상체는 소, 양, 산양 등의 반추 동물 및 사슴, 돼지 등을 포함하는 것이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원의 방법에 사용될 수 있는 상기 마커의 검출시약, 검체는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

또한 본원의 방법에서 마커의 존재/부존재 또는 발현양의 검출은 단백질 및/또는 mRNA 발현 수준에서 결정될 수 있으며, 이에 관해서는 언급한 바와 같다.

본원의 방법은 요네병의 진단을 위해 대상체의 비-바이오마커 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 비-바이오마커 임상정보란, 예를 들면 만성 설사, 쇠약 여부를 포함하는 임상진단, 장점막의 비후 및 추벽형성을 포함하는 병리조직학적 검사, 분변에서의 균 배양 및 검출, 요닌을 이용한 피내 검사, 인터페론 감마 검출을 포함하는 세포면역활성검사, 또는 요네병균 항원 검출 등과 같은 것을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원 방법은 마커의 검출 결과를 요네병의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하며, 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 결정된 각 마커의 양 또는 존재여부를 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커의 검출결과와 비교, 예를 들면 그 증감을 비교한 후, 이를 근거로 진단하는 것이다. 예를 들면 대조군의 값과 비교하여 예를 들면 cxcl12, fabp2, pigr, adm, c3, cd68, hgf, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, tnfsf13b 유전자들이 유의하게 증가되거나, ccl4, ccl5, hp, abcb1, acp5, ikzf, il10, mapt 유전자들이 유의하게 감소된 경우, 대상체에서 상기 질환이 발생한 것으로 진단할 수 있다. 본원 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 정상 대조군과 대상체의 시료를 비교한 후, 상기 각 마커에 대하여 발병여부를 진단할 수 있는 임계값을 설정한 후, 대상체의 검출 결과를 상기 임계값과 비교할 수 있다. 임계값 설정은 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참조할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험방법 및 재료

동물 및 재료 준비

모든 동물 실험절차는 한국의 농림축산검역본부의 IACUC(Institutional Animal care and Use Commitee)의 권고 및 지침과, 서울대학교 IACUC의 승인을 받음 프로토콜에 따라 수행되었다(permit no. SNU-120919-6).

본 연구에 사용된 소는 홀스타인종이며, 총 275두의 소를 대상으로 분변을 채취하였고, 분변 속의 미코박테리움 아비움 아종 파라투베클로시스(MAP)의 존재 유무를 확인하기 위하여 Ravva and Stanker (2005)와 Stabel and Bannantine (2005)에 의해 개발된 IS900 실시간 PCR 기법 및 ISMAP02 네스티드 PCR을 수행하여, 분변으로부터의 MAP의 배출여부를 판정하였다 (Ravva, S.V. and Stanker, L.H., Real-time quantitative PCR detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and differentiation from other mycobacteria using SYBR Green and TaqMan assays. J Microbiol Methods 2005, 63, (3), 305-17; Stabel, J.R. and Bannantine, J.P., Development of a nested PCR method targeting a unique multicopy element, ISMap02, for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in fecal samples. J Clin Microbiol 2005, 43, 4744-50).

상기 소의 혈액을 채취하여 요네균 특이 ELISA (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, USA) 검사를 실시하여 혈중 항체 양성 개체를 조사하였다. 소의 연령, 분변배출 여부와 혈중 항체가 양성 여부에 따라 요네병 감염 단계를 구분하여 실험 대상축을 선정하였다. 선정된 실험대상축의 혈액 샘플은 PAXgene Blood RNA tubes (PreAnalytiX/Qiagen, Hilden, Germany)에 채취한다.

RNA 제조 및 마이크로어레이 혼성화

선발된 실험대상(소)에서 혈액은 혈액에서의 RNA 질을 유지하기 위하여 Paxgene 혈액 튜브(PreAnalytiX)를 이용하여 채취하였다. 또한 채취한 혈액은 사용 전까지 -70℃에서 보관하였다. 샘플 튜브를 상온에 2시간 이상 배양한 후, Paxgene 혈액 RNA 킷트 (PreAnalytiX)를 제조사의 방법대로 이용하여 분리하였다. 분리한 RNA는 순도(A260/230), 순도(A260/280) 및 rRNA 비율이 1.7이상이었으며, RNA Integrity Number (RIN)가 8이상으로 질을 충족하였다. 요네병 감염 수준별 유전자 발현양상을 분석하기 위하여 마이크로어레이 기법을 통하여 분석하였다. 정제된 RNA는 Aglilent’s Quicl Amp 라벨링 킷트를 이용하여 cDNA을 합성한 후 Agilent 발현 마이크로어레이에 혼성화를 시행하였다. 마이크로어레이는 Agilent Technologies G2600D SG12494263으로 스캔하였다. RNA 증폭, cDNA 라벨링, 어레이 혼성화 및 마이크로어레이 스캐닝은 마크로젠사(Seoul, Republic of Korea)에서 수행하였다. 마이크로어레이 실험은 각 그룹당 세 번 수행하였다.

마이크로어레이 데이터 분석

원자료(raw data)는 Agilent Feature Extraction v11.0.1.1을 이용하여 실시하였으며, 통계적 유의성은 R 2.15.1 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 선택된 유전자 시그널 수치는 대수적으로(logarithmically) 변환시켰으며, 분위수 방법(quantile method)으로 정규화하였다. 발현 데이터에 대한 통계 수치는 폴드 체인지(배 change)와 LPE(local pooled error) 테스트를 사용하여 정하였다. 벤자민-호크버그 다중검정(Benjamini-Hochberg multiple testing)를 모든 차별 발현 유전자에게 적용하여 FDR(false discovery rate)을 최소화하여, 조정된 차별발현 유전자의 p-수치를 정하였다. 차별 발현 유전자의 모든 데이터 분석 및 가시화는 R 2.4.1 (www.r-project.org)를 사용하여 수행하였다.

바이오마커 선발

실험결과 그룹별로 상향 및 하향 조절되는 유전자들을 바이오마커 디스커버리 프로그램 (Ingeunity Pathway Analysis (IPA) system)을 이용하여 분석하여 요네병균 감염시 이를 진단할 수 있는 바이오마커로 사용할 수 있는 후보 유전자를 선발하였다. IPA 프로그램에서 fluid - 〈〈all〉〉, disease - 〈〈Infectious Disease, Inflammatory response, Immunological disease〉〉, species - 〈〈bos taurus〉〉로 선택하여 실시하였다.

정량 PCR

마이크로어레이 결과를 검증하기 위하여, 8개의 선택된 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR, 표 2) 분석을 수행하였다. Rotor-Gene SYBR Green PCR 킷트(Qiagen) 및 Rotor-Gene Q 실시간 PCR cycler (Qiagen)를 사용하여 2㎕의 cDNA로 qRT-PCR 반응을 수행하였다. 연장기(extension phase)동안 탐지되는 형광과 함께, 95℃에서 20초동안 그 후 60℃에서 45초 동안 40 사이클동안 증폭을 수행하였다. 내부 대조군으로 베타-액틴(β-actin)을 사용하여 발현 레벨을 측정하였다. 각 유전자의 발현에서의 변화량(배 chage)를 결정하기 위하여 대조군과 상대적 발현 레벨을 비교하였다. qPCR 및 마이크로어레이를 사용하여 얻어진 데이터의 상관관계를 확인하기 위하여 피어슨 상관계수를 계산하였으며, Statistical Package for Social Sciences 소프트웨어(SPSS, version 20, SPSS Inc., Chicago, IL)를 이용하였다. p < 0.05일 때 변화가 유의한 것으로 고려하였다.

[표 2]

실시예 1. 요네병 감염 수준별에 따른 숙주동물(소) 준비

소를 대상체로 이용한 실험을 요약하면, 바이오마커의 선별을 위해 소의 나이, 분변 배출(Fecal shedding) 여부와 혈중 항체의 양성 여부에 따라 요네병 감염 단계를 구분하여 실험 대상 (테스트 1, 2 및 3 그룹)을 선정하고, 소의 혈액에서 RNA를 분리하여 마이크로어레이(microarray) 기법으로 요네병 감염 관련 유전자들의 발현을 비교 분석하여 증가한 유전자 및 감소한 유전자의 공통 유전자 개수를 벤 다이아그램(Venn diagram)을 통하여 분석하고, 이를 바탕으로 바이오마커 디스커버리 프로그램(Ingeunity Pathway Analysis (IPA) system)을 이용하여 선발하였다.

총 275두의 소를 대상으로 분변을 채취하여, 분변 속의 미코박테리움 아비움 아종 파라투베클로시스(MAP)의 존재 유무를 실험방법 부분에서 기재한 바와 같이 IS900 실시간 PCR 및 ISMAP02 네스티드 PCR을 수행하여, 분변으로부터의 MAP의 배출여부를 판정하였고, 상기 소의 혈액을 채취하여 ELISA 검사를 실시하여 혈중 항체 양성 개체를 조사하였다. 소의 연령, 분변배출 여부와 혈중 항체가 양성 여부에 따라 요네병 감염 단계를 구분하여 실험 대상축을 선정하였다.

하기 표 3에 나타난 바와 같이 ELISA 음성이며 PCR 양성(테스트 1 그룹), ELISA 양성이며 PCR 음성(테스트 2 그룹), ELISA 양성이며 PCR 양성(테스트 3 그룹), 그리고 ELISA 음성이며 PCR 음성(대조군)을 분류 기준으로 하여 실험 대상축을 선정하였다.

[표 3] 실험 대상축 선정

실시예 2. 요네병 감염 수준별에 따른 혈중 전사체(transcriptomes) 발현 양상 분석

상기 실시예 1의 요네병 감염수준 평가를 통해서 선발된 실험대상(소)에서 채취된 혈액에서 각각 실험 대상 그룹 테스트 1, 2 및 3 그룹간에 유전자 발현 차이를 비교 및 분석하였고, 마이크로어레이에서 유의적인 변화는 변화가 +1.5 이상이고, 통계학적으로 p < 0.05 일 때로 하였다. 이때 유의적인 변화를 보이는 유전자 군에 대하여 정량적 실시간 PCR 기법을 이용하여 마이크로어레이에 의한 유전자 발현의 차이에 대한 유의성을 확인하였다.

테스트 1, 2 및 3그룹에서 각 그룹에서 유전자의 발현 레벨을 산포도(scatter plot)(도 1a)와 변화량이 +1.5 이상, 그리고 p < 0.05를 동시에 만족하는 유전자의 개수(도 1b)로 분석하였다.

또한 테스트 1, 2 및 3그룹과 대조군을 비교하여 증가한 유전자 및 감소한 유전자의 공통 유전자 개수를 벤 다이아그램(venn diagram)을 통하여 분석하였다. 테스트 2와 테스트 3의 공통된 유전자가 각각 증가된 유전자 280개이고 감소된 유전자 57개로 테스트 1과의 공통 유전자 개수보다 많았다. 테스트 2와 테스트 3은 둘 다 ELISA 결과가 양성이며, 분변 PCR의 결과가 각각 음성, 양성인 그룹인데, ELISA 결과 음성, 분변-PCR 결과 양성인 테스트 1와 비교하였을 때 더 많은 유전자 변화를 보였다. 또한 계통적 클러스터링 분석을 통하여 각 그룹에 대한 유전자 발현의 유사성을 클러스터링하여 분석하였다 (도 2 참조).

실시예 3. 요네병 감염 수준별에 바이오마커 선발

앞의 바이오마커 선발 분분에서 설명한 바와 같이 요네병 감염 단계별로 선정한 실험 대상 소의 혈중 유전자 변화를 분석하였으며, 그룹별로 상향 및 하향 조절되는 유전자의 종류가 다른 것으로 나타났다. 모든 그룹에서 증가를 보인 유전자, 모든 그룹에서 감소를 보인 유전자, 테스트 1에서 증가, 테스트 2와 테스트 3에서 감소된 유전자 그리고 테스트 1 감소, 테스트 2와 테스트 3에서 증가된 유전자를 관찰할 수 있었다. 이를 바탕으로 바이오마커 디스커버리 프로그램(Ingeunity Pathway Analysis (IPA) system)을 이용하여 요네병균 감염시 이를 진단할 수 있는 바이오마커로 사용할 수 있는 후보 유전자를 선발하였다(표 1). 그 결과 요네병균 분변 배출 초기 군으로 테스트 1을 결정할 수 있었고, 테스트 1 그룹에서 ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, 및 hp를 바이오마커로 사용할 수 있는 후보 유전자로 선발하였다. 또한, 혈청 내 항체를 형성한 그룹 테스트 2와 테스트 3 중에서 분변 쉐딩 하지 않는 그룹 (테스트 2)에서는 pigr이, 분변 쉐딩을 보이는 그룹 (테스트 3)에서는 abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b 를 바이오마커로 사용할 수 있는 후보 유전자로 선발하였다.

결과는 상술한 표 1-1 및 1-2에 기재되어 있다.

실시예 4. 마이크로어레이 결과 유효성 검증

또한 발현이 변경된 8개 유전자에 대한 마이크로어레이 결과를 정량적 실시간 PCR 기법을 사용하여 검증하였다. 마이크로어레이에 사용된 동일한 RNA 샘플을 qPCR에 사용하였다. 검증하기 위하여 qPCR 및 마이크로어레이에 대한 Log 2 폴드 체인지 데이터를 분석하였다. 두 분석 사이의 상관 계수는 0.553이었다(p < 0.001). 비록 LAP 및 ULBP3와 같은 몇몇 유전자에 대한 마이크로어레이 데이터와 qPCR 데이터가 다른 경향을 보였지만, 그 밖의 선택된 모든 유전자의 차별적 발현은 동일한 경향을 나타냈다(도 4).

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (14)

1. ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, hp, pigr, abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg 및 tnfsf13b로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 검출 시약을 포함하는 검체의 요네균(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) 감염 여부 검출용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, 및 hp 는 요네균을 분변 배출하는 상태의 감염 여부; 상기 pigr 는 요네균에 대한 항체를 형성하였으며 요네균을 분변 배출하지 않는 상태의 감염 여부; 그리고 상기 abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b은 요네균에 대한 항체를 형성하였으며 요네균을 분변 배출하는 상태의 감염 여부 검출용인, 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 cxcl12, fabp2, pigr, adm, c3, cd68, hgf, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, tnfsf13b 바이오마커는 대조군과 비교하여 과발현되고, ccl4, ccl5, hp, abcb1, acp5, ikzf, il10, mapt 바이오마커는 대조군과 비교하여 저발현되는 것인, 요네병 감염 진단 및 예후를 예측하는 것인, 조성물.
   
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검체는 전혈, 혈장, 혈청 중 하나 이상인, 조성물.
   
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 시약은 상기 바이오마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약인, 조성물.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약은 역전사 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, DNA 칩 또는 노던블랏에 사용되는 시약인, 조성물.
   
7. 제 5 항에 있어서, 상기 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약은, 상기 하나 이상의 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브인, 조성물.
   
8. 제 5 항에 있어서, 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자, 또는 질량분광분석기 검출용 시약인, 조성물.
   
9. ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, hp, pigr, abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg 및 tnfsf13b로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 검출 시약을 포함하는 검체의 요네균 감염 여부 검출용 키트.
   
10. 인간을 제외한 포유동물 유래의 검체로부터 ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, hp, pigr, abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커의 존재 또는 양을 검출, 및/또는 그 RNA의 존재여부 또는 그 양을 검출하는 단계; 및
    상기 검출된 마커의 존재여부 또는 양을 상기 인간을 제외한 포유동물의 요네병 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하며, 요네병의 검출 또는 진단 방법.
    
11. 인간을 제외한 포유동물 유래의 검체로부터 ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, hp, pigr, abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 존재 또는 양을 검출, 및/또는 그 RNA의 존재여부 또는 그 양을 검출하는 단계; 및
    상기 검출된 마커의 존재여부 또는 양을 상기 인간을 제외한 포유동물의 요네균 감염상태와 연관시키는 단계로, 상기 감염상태는 요네균 분별 배출상태, 요네균에 대한 항체를 형성했으며 요네균을 분별 배출하지 않는 상태 및 요네균에 대한 항체를 형성했으며 요네균을 분별 배출하는 상태를 포함하며, 상기 검출된 ccl4, ccl5, cxcl12, fabp2, 및 hp 마커의 존재여부 또는 양은 상기 요네균의 분변 배출 상태; 상기 검출된 pigr 마커의 존재여부 또는 양은 상기 요네균에 대한 항체를 형성하였으며 상기 요네균을 분변 배출하지 않는 상태; 그리고 상기 검출된 abcb1, acp5, adm, c3, cd68, hgf, ikzf, il10, mapt, mmp9, nudt7, s100a12, serpine1, tg, 및 tnfsf13b 마커의 존재여부 또는 양은 상기 요네균에 대한 항체를 형성하였으며 상기 요네균을 분변 배출하는 감염상태와 연관되는 것인, 요네균에 대한 감염 상태 검출 방법.
    
12. 제 10 항에 있어서, 상기 연관시키는 단계는 상기 요네병 검사 대상체의 비-바이오마커 임상정보를 추가로 사용하는 것인, 방법.
    
13. 제 12 항에 있어서, 상기 비-바이오마커 임상정보는 만성 설사를 포함하는 임상진단, 장점막의 비후 및 추벽형성을 포함하는 병리조직학적 검사, 분변에서의 균 배양 및 검출, 요닌을 이용한 피내 검사, 인터페론 감마 검출을 포함하는 세포면역활성검사, 또는 요네병균 항원 검출을 포함하는 것인, 방법.
    
14. 제 10 항에 있어서, 상기 연관시키는 단계는 상기 검출된 바이오마커의 양 또는 존재여부를 정상 대조군에서 검출된 상기 각 바이오마커의 양 또는 존재여부와 비교하는 것인, 방법.
    

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