CN102776288A

CN102776288A - 检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒

Info

Publication number: CN102776288A
Application number: CN2012102667222A
Authority: CN
Inventors: 张毅; 王雅春; 李强; 张沅; 吴蒙; 徐仙洲; 俞英; 孙东晓; 张胜利
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2012-07-30
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2032-07-30
Also published as: CN102776288B

Abstract

本发明提供一种检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒，该试剂盒中包括Seq ID No.1-4所示的引物组合。本发明基于15bp插入片段在牛凝血因子XI基因第9外显子中的位置，设计了跨越15bp插入片段区域的2对引物，并在此基础上建立了PCR检测体系。其中，第1对引物（Seq ID No.1和2）仅能特异扩增出野生型的等位基因；第2对引物（Seq ID No.3和4）仅能特异扩增出突变型等位基因；2个PCR产物长度相差94bp，利用低浓度的琼脂糖凝胶，经过较短时间电泳即能灵敏区分不同的基因型，从而准确筛查出遗传缺陷携带者。

Description

检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒

技术领域

本发明涉及遗传学和分子生物学领域，具体地说，涉及一种检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒。

背景技术

凝血是血液由液体状态转变为不流动的凝胶状态的过程，是生物体天然的自我保护机制，能阻止血液从破损的血管中流失。除血小板外，所有参与凝血过程的物质统称为凝血因子，目前已知的凝血因子有20余种，包括传统的因子I-XIII，以及PK、HMWK等。当血管内皮细胞受到创伤，组织因子等蛋白与血液接触，凝血会立即启动。首先血小板流向创伤点堆积形成栓塞，称为初级止血反应；同时，血浆中的各种凝血因子发生级联反应形成纤维蛋白，在血小板栓塞上形成紧密的纤维蛋白网，该过程称为次级止血反应。血液凝固是一系列凝血因子连锁反应的结果，其特点是当凝血过程被激活时，其中一个凝血因子以其上游凝血因子为底物，使之激活为具有活性的酶，而该酶又催化激活下一个因子。凝血异常将增加失血或血栓形成的风险。

牛凝血因子XI缺失（Factor XI deficiency）最早（1969年）发现于美国荷斯坦牛中（Kociba等,1969），此后，1975年在加拿大也发现一头患病的荷斯坦公牛（Gentry等,1975）。该遗传缺陷病的临床表现为血凝时间延长，血浆中XI因子活性降低。杂合个体除因注射、去角、阉割等损伤而发生出血症外（严重的需要输血），出血可能性相对较小，而隐性纯合子出血情况较为严重，其新生犊牛大多死亡。其分子致病机理是牛27号染色体上的凝血因子XI（Factor XI）基因第12外显子上一个76bp的插入造成（Marron等,2004）。

2005年日本科学家报道了日本黑牛中一种新的凝血因子XI突变。在Factor XI基因的第9外显子上有15bp的插入，造成凝血活性降低（Kunieda等,2005）。同时，报道了一种检测该变异的方法。其基本原理是，在该突变两侧设计引物，通过聚合酶链式反应扩增目的片段，进而通过琼脂糖凝胶电泳方法进行基因型判定。然而，在实际应用中，由于琼脂糖凝胶分辨率低，而该目的片段的野生型与突变型的条带只相差15bp，因此不易区分，导致出现假阴性的结果。此外，该检测方法所需高浓度琼脂糖凝胶的制作过程也较为繁琐，且电泳时间长。

发明内容

本发明的目的是克服现有检测方法中易出现假阴性结果的缺陷，提供一种能够准确高效地检测牛凝血因子XI基因外显子9内15个核苷酸插入突变的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的PCR引物组合，其为：

引物对1：

a）上游引物wild-F5’-CTGCTGTGCAGTGTTCTGCC-3’；

b）下游引物wild-R5’-GGAGCGTCTATGGGACTTGA-3’；和

引物对2：

a′）上游引物mutant-F5’-TGCAAGCCCTTTCTTCTGAT-3’；

b′）下游引物mutant-R5’-AATGGCATATATTCTGCACA-3’。

引物对1的上游引物跨越了插入片段区域，但不包含插入片段，因此仅能与野生型等位基因序列特异结合，特异性地扩增野生型等位基因；而突变型等位基因没有扩增产物。

引物对2的下游引物包含插入片段的序列，因此仅能与突变型等位基因序列特异结合，特异性地扩增突变型等位基因；而野生型等位基因没有扩增产物。

本发明还提供含有上述引物组合的检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒。

前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供上述PCR引物组合或试剂盒在检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变中的应用，包括步骤：1）提取待测牛的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，分别采用引物对1和引物对2，进行PCR扩增反应；3）分析PCR产物。

其中，步骤3）具体为：

扩增反应结束后，将分别用引物对1和引物对2扩增的产物混合，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判断待测牛的基因型：若扩增结果仅出现一条206bp的DNA条带，则判定待测牛的基因型为不含15bp插入突变的野生型纯合子；若扩增结果仅出现一条112bp的DNA条带，则判定待测牛的基因型为含15bp插入突变的突变纯合子；若扩增结果出现206bp和112bp两条DNA条带，则判定待测牛的基因型为含15bp插入突变的杂合子。

上述PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：94℃7min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃7min。

用引物对1和引物对2扩增的PCR产物长度相差94bp，利用低浓度（2%）的琼脂糖凝胶，经过较短时间（约30min）电泳即能灵敏区分不同的基因型。避免了已有方法的缺点，提高了检测的准确性。

本发明提供的检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒，操作简便，特异性好，灵敏度高，通过对基因型的判定，从而准确筛查出遗传缺陷携带者。

附图说明

图1为本发明野生型等位基因及突变型等位基因的测序图。

图2为本发明的引物在牛凝血因子XI基因序列上的位置。

图3为本发明实施例3中利用引物组合PCR检测凝血因子XI基因型的结果；其中，1-6分别为6个待检样本，NC为阴性对照，PC为阳性对照，M为DNA分子量标准。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1用于检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的PCR引物组合的合成

根据15bp插入片段在牛凝血因子XI基因第9外显子中的位置（图1），人工合成以下引物：

引物对1：

a）上游引物wild-F5’-CTGCTGTGCAGTGTTCTGCC-3’；

b）下游引物wild-R5’-GGAGCGTCTATGGGACTTGA-3’；和

引物对2：

a′）上游引物mutant-F5’-TGCAAGCCCTTTCTTCTGAT-3’；

b′）下游引物mutant-R5’-AATGGCATATATTCTGCACA-3’。

上述引物组合对应于牛凝血因子XI基因第9外显子中的位置如图2所示。引物对1的上游引物（wild-F）跨越了插入片段区域，但不包含插入片段，因此仅能与野生型等位基因序列特异结合，特异性地扩增野生型等位基因；而突变型等位基因没有扩增产物。引物对2的下游引物（mutant-R）包含插入片段的序列，因此仅能与突变型等位基因序列特异结合，特异性地扩增突变型等位基因；而野生型等位基因没有扩增产物。

引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

实施例2检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒

检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒包括：实施例1中的引物组合，即引物对1和引物对2。此外，还可包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。为了便于检测结果分析，还可进一步包括已知基因型的阳性对照。

实施例3利用PCR引物组合检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变遗传缺陷的特异性分析

1.1样本来源

本实施例中采用的牛源：随机选取辽宁雪龙牧场的普通牛（Bostaurus）六头，分别编号1~6。

1.2DNA提取

1.2.1牛血液DNA提取

采用天根生化生物技术公司DP318试剂盒从血块中提取基因组DNA，具体步骤如下：

1)取出样品，融化后，剪取200μL于2mL离心管中；

2)加入600μL细胞裂解液CL，摇匀；

3)10000rpm离心1min，弃去暗红色上清；

4)重复2和3步一次；

5)加入200μL缓冲液GS，用涡旋仪充分悬浮血块颗粒；

6)加入20μL蛋白酶K，220μL缓冲液GB，充分晃动摇匀；

7)56℃烘箱中消化3小时以上，消化早期，要颠倒混匀数次，直至溶液变澄清，无血块颗粒；

8)加入200μL无水乙醇，轻轻晃动混匀，转移到吸附柱中，12000rpm离心30s,弃去收集管中的暗绿色废液；

9)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s,弃去收集管中废液；

10)向吸附柱中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30s,弃去废液；

11)加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s,弃去废液；

12)12000rpm离心2min；

13)将吸附柱转移到新的1.5mL离心管中，开口凉干；

14)加入100μL在64℃预热的洗脱缓冲液TB，静置2min；

15)12000rpm离心2min，弃吸附柱。基因组DNA存在于离心管中溶液中，4℃保存备用或-20℃长期保存。

1.2.2公牛冻精DNA的提取

1）将细管冻精转移到2mL离心管中，加入500μL生理盐水，涡旋离心，弃废液保留沉淀，重复以上操作一次；

2）向沉淀中加入400μL冻精裂解液（含DTT）、100μL20%的SDS，涡旋，最后加入10μL的蛋白酶K，充分混匀，56℃消化4h或过夜；

3）消化结束，加入300μL饱和食盐水，颠倒混匀，低温离心，去除蛋白质杂质，将上清液转管保留，并加入1000μL冰乙醇，轻轻颠倒混匀至絮状沉淀不再增加，再离心，此时弃去上清液，所得的沉淀即DNA，用500μL75%乙醇洗涤2次，晾置几分钟使酒精挥发，最后加适量TE缓冲液溶解，-20℃保存。

1.3样品DNA的梯度稀释

检测上述提取的牛基因组的DNA浓度，进行梯度稀释，稀释后最低浓度为20μM，于-20℃保存备用。

1.4PCR反应

分别采用引物对1和引物对2，进行PCR扩增反应。

反应体系（20μl）：

使用Applied Biosystems9700型PCR仪，PCR反应程序：94℃预变性7min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸7min。

两对引物的PCR反应体系和扩增条件完全相同。

1.5结果

各取扩增产物2μL混合后，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳（TAE缓冲液），电压为110V，30分钟后在凝胶成像系统中观察电泳结果。如图3所示，根据分子量标准（Marker）判定每个样品的基因型，其中，泳道1~6分别对应于编号1~6的牛。泳道1和2内仅观察到112bp条带，由此判定为突变纯合子；泳道3和4内观察到112bp条带和206bp条带，由此判定为杂合子；泳道5和6内仅观察到206bp条带，由此判定为野生型纯合子。

本发明基于15bp插入片段在牛凝血因子XI基因第9外显子中的位置，巧妙设计了跨越15bp插入片段区域的2对引物，并在此基础上建立了PCR检测体系。其中，第1对引物（wild-F和wild-R）仅能特异扩增出野生型的等位基因；第2对引物（mutant-F和mutant-R）仅能特异扩增出突变型等位基因；2个PCR产物长度相差94bp，利用低浓度（2%）的琼脂糖凝胶，经过较短时间（约30min）电泳即能灵敏区分不同的基因型。避免了已有方法的缺点，提高了检测的准确性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.用于检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的PCR引物组合，其为：

引物对1：

a）上游引物wild-F 5’-CTGCTGTGCAGTGTTCTGCC-3’；

b）下游引物wild-R 5’-GGAGCGTCTATGGGACTTGA-3’；和

引物对2：

a′）上游引物mutant-F 5’-TGCAAGCCCTTTCTTCTGAT-3’；

b′）下游引物mutant-R 5’-AATGGCATATATTCTGCACA-3’。

2.含有权利要求1所述引物组合的检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

5.权利要求1所述引物组合或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待测牛的基因组DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，分别采用引物对1和引物对2，进行PCR扩增反应；

3）分析PCR产物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3）具体为：

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，PCR反应体系以20μl计为：

9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，PCR反应条件为：94℃7min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃7min。