CN103710443A - 引起cvm相关的snp的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了引起CVM相关的SNP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。本发明的检测引物组包括包括检测引物和探针：所述的检测引物：CVM SLC35A3-FWD：AGCTGG CTCACAATTTGTAGGT；CVM SLC35A3-REV：TCAAAGTAAACCCCAGCAAAG.；所述的探针：针对CVM突变的探针，TCATGGCATTTCTCA；针对CVM野生的探针，TCATG GCAGTTCTCA。本发明建立了一种通过荧光定量PCR检测牛CVM有害基因携带者的方法，本发明的方法简单、快速、准确，并且通过本发明的方法可以进一步开发检测试剂盒，本发明为奶牛CVM有害基因的分型和筛选提供了新的方法和思路，为我国奶牛的检验检疫事业把好国门关口，为奶牛的分子选育提供了可靠的理论依据。

Description

引起CVM相关的SNP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及引起CVM相关的SNP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
背景技术：
CVM，其全称是Complex Vertebral Malformation，即“脊椎畸形综合症”。它是2001年丹麦Agerholm等发现荷斯坦牛群存在一个隐性遗传缺陷基因，纯合时可以造成妊娠早期流产、死胎或犊牛出生后很快死亡，患畜最显著的特征为颈椎弯曲畸形、两前腿筋腱缩短、颈短、心脏畸形等综合症状，故称“脊椎畸形综合症”。
脊椎畸形综合征(Complex Vertebral Malformation,CVM)是由常染色体上SLC35A3基因单碱基突变(G→T)引起的隐性遗传疾病，该基因隐性纯合(CV/CV)时奶牛致死，但CVM携带者表现正常，所以CVM携带者公牛可以通过人工授精技术传播CVM缺陷基因。
近几年，在美国、加拿大、日本等国家都相应建立了种公牛遗传缺陷基因的分子检测方法和育种方案，并在种公牛系谱上进行了明确标注阴性有害基因的携带情况，合理的指导种公牛的选种和选配，有效的降低了隐性有害基因CVM的不良影响。目前，国外CVM有害基因的分子检测方法主要有ASR-PCR方法，但是ASR-PCR方法对DNA聚合酶具有很高要求，而且必须严格控制反应条件才能达到一定的准确性；而PCR-PIRA法虽然比AS-PCR法有所改进，但PCR-PIRA法要求建立阳性对照才能保证其准确性，而且不适合规模化检测，成本较高。所以，建立一种准确、快速、经济的检测CVM有害基因的分子方法是非常有必要的。
单核苷酸多态（SNP）是指有单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子形态，有时括有多个核苷酸插入或缺失造成的点突变。通常情况下是一种2等位基因的变异，并多为转换，即嘧啶碱基之间的转换或嘌呤碱基之间的转换。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C-T，因为CG中的C常为甲基化的，自发脱落后变为T。SNP是人类基因组中数量最多的一种多态形式，人类基因组中总共有300万个SNP，平均每1000个碱基中就有一个SNP。SNP的分布不均匀，非转录区要多于转录区，大多数位于蛋白的非编码区。其中相当多的SNP位点直接或间接与个体间的表型差异、人类对疾病的易感性或抵抗能力有关。SNP检测在临床及临床相关研究中已有广泛应用。
Taqman探针法荧光定量PCR技术原理是针对同一SNP位点的不同基因型设计两条不同的Taqman探针，把它们同时加入到PCR反应体系中，只有与靶序列完全匹配的探针才能被水解并释放出荧光信号。两条探针分别标记不同的荧光基团，分别用实时荧光定量PCR仪中对应的荧光检测通道检测荧光信号。某种基因型对应的荧光探针能够释放荧光信号，说明在原始DNA样本中含有该中基因型。如果只有一条探针能释放荧光信号，那么检测的SNP位点上是纯合子，如果两条探针都有荧光信号，那么在该SNP位点上是杂合子。
发明内容：
本发明的目的是提供一种引起牛脊椎畸形综合症（CVM）相关的SNP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法，利用本发明的检测引物组和检测试剂盒，按照本发明的检测方法能够准确、快速、经济的检测出牛脊椎畸形综合症（CVM），本发明具有准确、快速、经济、准确性高的优点。
本发明的引起CVM相关的SNP的检测引物组，其特征在于，包括检测引物和探针：
所述的检测引物：
CVM SLC35A3-FWD:AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT；（如SEQ ID NO.1所示）
CVM SLC35A3-REV:CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAG.；（如SEQ ID NO.2所示）
所述的探针：
针对CVM突变的探针，CVM SLC35A3-M：TCATGGCATTTCTCA（如SEQ ID NO.3所示）
针对CVM野生的探针，CVM SLC35A3-W：TCATGGCAGTTCTCA（如SEQ ID NO.4所示）。
本发明的引起CVM相关的SNP的检测试剂盒，包括PCR反应试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组包括检测引物和探针：
所述的检测引物：
CVM SLC35A3-FWD:AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT；（如SEQ ID NO.1所示）
CVM SLC35A3-REV:CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAG.；（如SEQ ID NO.2所示）
所述的探针：
针对CVM突变的探针，CVM SLC35A3-M：TCATGGCATTTCTCA（如SEQ ID NO.3所示）
针对CVM野生的探针，CVM SLC35A3-W：TCATGGCAGTTCTCA（如SEQ ID NO.4所示）。
本发明的第三个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的引起CVM相关的SNP的检测方法，其特征在于，使用上述检测引物组，对待测牛的DNA样品进行荧光定量PCR反应，根据扩增情况判断待测牛的基因型。
所述的PCR反应，其反应体系优选为：
余下体积用水补足到30ul。
反应条件：95℃3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，35个循环。
需要说明的是，引起CVM相关的SNP的检测方法。对于牛脊椎畸形综合症，会造成妊娠早期流产、死胎或犊牛出生后很快死亡，患畜最显著的特征为脊椎弯曲畸形、两周腿筋腱缩短、颈短、心脏畸形等综合症状，这些是显著症状，不需要特别的检测，而本发明的对象是表征正常的牛，通过检测牛CVM有害基因，从而排除CVM的携带者，排除牛育种中的隐患。
本发明建立了一种通过荧光定量PCR检测牛CVM有害基因携带者的方法，本发明的方法简单、快速、准确，并且通过本发明的方法可以进一步开发检测试剂盒，本发明为奶牛CVM有害基因的分型和筛选提供了新的方法和思路，为我国奶牛的检验检疫事业把好国门关口，为奶牛的分子选育提供了可靠的理论依据。
附图说明：
图1等位基因检测样本散点图，1、野生型纯合；2、杂合型；3、突变型纯合；4、阴性对照
图2CVM探针法对野生型标准质粒DNA模板（107copy）模板扩增结果；
图3CVM探针法对突变型标准质粒DNA模板（107copy）模板扩增结果；
图4CVM探针法对杂合型标准质粒DNA模板107copy）模板扩增结果；
图5CVM探针法对阴性对照（水）扩增结果；
图6CVM探针法对CVM野生型质粒DNA模板的检测敏感性试验；
图7CVM探针法对CVM突变型质质粒DNA模板的检测敏感性试验；
图8CVM探针法对CVM杂合型质粒DNA模板的检测敏感性试验；
图9样品180的PCR扩增产物测序结果；
图10样品207的PCR扩增产物测序结果；
图11样品159的PCR扩增产物测序结果。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、引起CVM相关的SNP的检测引物和探针：
检测引物：
CVM SLC35A3-FWD:AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT；（如SEQ ID NO.1所示）
CVM SLC35A3-REV:CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAG.。（如SEQ ID NO.2所示）
探针：
针对CVM突变的探针，CVM SLC35A3-M：TCATGGCATTTCTCA（如SEQ ID NO.3所示）
针对CVM野生的探针，CVM SLC35A3-W：TCATGGCAGTTCTCA（如SEQ ID NO.4所示）。
2、标准品的制备合成：克隆为质粒以及样品
根据CVM基因（Genebank：AC_000160）公布的CVM的SNP位点合成野生型和纯合突变型模板，以pGH为克隆载体，SmaI为酶切位点。于上海捷瑞生物科技有限公司合成，合成的交付材料为质粒和甘油菌。再将二者野生型与突变型模板按1:1混合为杂合型模板.
2.1野生型纯合序列：
tcccatggacagagcagcctggcgggctgcagtccatggggttgcaaagagtcgaacacaacttagtgactaaactgcagcaacagcagctcttttttttagggtatttttaaaattatagattgtaaaggcaatatcactatgggaaaaaaaaatgattctaaggttttttcaaaagctctcctctgtaatccccaggaatggaaatggttgcatttttaccttaaggtctaagagtgggctctaaacatgtattttgtaaaatattataggaattaaacttgtgttgtttctttttgttcagtggccctcagattctcaagagcttaattctaaggaactttcagctggctcacaatttgtaggtctcatggcaGTTctcacagcatgtttttccagtggctttgctggggtttactttgagaaaatcttaaaagaaaccaaacaatcagtgtggataagaaacattcaacttggtaa
2.2突变型纯合：
TcccatggacagagcagcctggcgggctgcagtccatggggttgcaaagagtcgaacacaacttagtgactaaactgcagcaacagcagctcttttttttagggtatttttaaaattatagattgtaaaggcaatatcactatgggaaaaaaaaatgattctaaggttttttcaaaagctctcctctgtaatccccaggaatggaaatggttgcatttttaccttaaggtctaagagtgggctctaaacatgtattttgtaaaatattataggaattaaacttgtgttgtttctttttgttcagtggccctcagattctcaagagcttaattctaaggaactttcagctggctcacaatttgtaggtctcatggcaTTTctcacagcatgtttttccagtggctttgctggggtttactttgagaaaatcttaaaagaaaccaaacaatcagtgtggataagaaacattcaacttggtaa
2.3样品：
262份牛血液样品基因组提取方法如下:
（1）取500μL血液至于2mL的离心管中，加入2颗钢珠，用德国restch组织研磨器进行研磨5min，频率为26次/S。
（2）将处理好的500μL血凝块添加到1.5mL离心管中，加入750mL细胞裂解液CL，斡旋混匀，然后常温下离心8000rpm，离心1min，弃上清。
（3）将细胞核团块涡旋混匀5s，再加入750μL的细胞裂解液CL，8000rpm离心1min，弃上清。
（4）添加200μL缓冲液GS，20μL的蛋白酶K，斡旋混匀15s。
（5）添加200μL缓冲液GB涡旋混匀至无团块状物质，56℃水浴30min，直至溶液清亮，期间颠倒混匀1～2次。
（6）添加200μL无水乙醇颠倒10次混匀。
（7）将吸附柱CB3套放在收集管中，用移液枪将上述的溶液分两次转移到吸附柱CB3中，620μL/次，12000rpm，30s，弃废液。
（8）之后继续向CB3中添加500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液。
（9）添加700μL的漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液。
（10）添加500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液。
（11）弃废液后，12000rpm离心2.5min，空甩去除乙醇，室温静置2～5min，待乙醇挥发。
（12）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，加入70μL洗脱缓冲液TB，室温放置2～5min。然后12000rpm离心2min，将基因组DNA溶液收集到离心管中，并置于-20℃。
由此得到262份牛血液样品的DNA，作为下列PCR反应的模板，分别编号为1-262，取其中一部分样品进行试验。
3、实验试剂及仪器
PCR体系：Bio-Serve Cat.BS-PCR002试剂盒；
仪器：SLAN定量PCR多通道扩增检测仪；
4、PCR反应体系为
Figure BDA0000440812400000081
余下体积用水补足到30ul。
在SLAN定量PCR多通道扩增检测仪进行扩增反应，反应条件：95℃3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，35个循环。
以上述野生型纯合、突变型纯合、杂合型模板、分别作为PCR模板按照上述PCR反应体系和反应条件进行PCR反应，以不加PCR模板的作为阴性对照。由于只差一个碱基，一组探针不能完全做到其中一个基因型扩增时，另一个基因型的探针一点也不扩增，只能通过优化反应条件，让其在该反应条件下，该2组探针尽可能的差异最大，能够明显区分。而且一般情况下，由于我们检测的是基因组DNA的基因型，SNP的各等位基因各站占50%。只要一组基因型明显的优势扩增，即可将其判定为优势扩增的基因型。
具体结果如图1、2、3、4和5所示，通过引物设计和条件优化，我们选定了一个反应程序，用双探针和引物在该反应条件下检测样品时，各标准样品能够进行很好的区分，见图1、2、3、4和5，扩增野生型模板时只能检测到代表野生型探针的信号，图2中是以野生型纯合序列为模板扩增的结果，蓝色虚线为野生型模板。扩增突变型模板时能检测到代表突变型的探针信号，图3中是以突变型纯合序列为模板扩增的结果，红色实线为突变型模板。图4中是以野生型与突变型纯合序列的混合的杂合型为模板扩增的结果，从图4中可以看出，能同时成功检测到来自两种探针的信号，探针工作情况基本良好。杂合的模板两种信号的探针都得到了有效的扩增，在散点图上信号位于中央区域，软件分辨为绿色的杂合型；图5是阴性模板的扩增，阴性对照未起跳表明信号有效。由此可见，本发明的引起CVM相关的SNP的检测引物和探针特异性非常好。
实施例2：灵敏度分析：
将上述标准样品（野生型、突变型或杂合型）质粒DNA，用微量核酸分光光度计测纯化质粒DNA样品的OD260吸光度值并转换成核酸浓度值。根据公式：质粒拷贝数/μl={总含量（μg/μl）}/{质粒分子碱基数×10-15μg}，将纯化质粒DNA按浓度换算成单位体积对应基因拷贝数。然后将每种质粒DNA分别进行10倍系列稀释，取每一稀释度样品，按照实施例1中的探针法检测CVM的PCR的反应方法进行检测试验，每个稀释度均做2次以上重复试验，根据检测终点稀释度推算检测终点对应的基因拷贝数和DNA模板用量。
检测结果显示，CVM探针法的灵敏度为：突变型纯合103copy/ul，杂合型1x101copy/ul，野生型纯合5x103copy/ul。由此可见，其灵敏度是非常高的。结果如图6、图7、图8所示。
实施例3：重复性实验分析
本实施例检测了25份牛血液样品的DNA样本，其中样品159号位杂合型，其余24株检测样品为野生型。并做了重复试验，见表1，两次结果完全吻合。同时还在不同的机器上进行了测试（SLAN96P和Roche480），反应结果一致，说明我们的系统和反应条件都是稳定的。
表1设备型号SLAN96P CVM探针法临床样品检测的结果
Figure BDA0000440812400000111
表2设备型号Roche480CVM探针法临床样品检测的结果
Figure BDA0000440812400000121
实施例4：准确性分析
在实施例3中例挑取了159、180、207号牛血液样品的DNA样品PCR扩增产物进行了测序分析，然后参照实施例1的PCR反应体系和反应条件在SLAN定量PCR多通道扩增检测仪中进行PCR反应，其CVM探针法检测结果与159、180、207号牛血液样品的DNA样品的测序分析结果一致，由此说明本发明的准确性好，样品159、180、207的测序结果如图9、10、11所示。
Figure IDA0000440812490000011
Figure IDA0000440812490000021

Claims (4)

1.引起CVM相关的SNP的检测引物组，其特征在于，包括检测引物和探针：
所述的检测引物：
CVM SLC35A3-FWD:AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT；
CVM SLC35A3-REV:CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAG.；
所述的探针：
针对CVM突变的探针，CVM SLC35A3-M：TCATGGCATTTCTCA；
针对CVM野生的探针，CVM SLC35A3-W：TCATGGCAGTTCTCA。
2.一种引起CVM相关的SNP的检测试剂盒，包括PCR反应试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组包括检测引物和探针：
所述的检测引物：
CVM SLC35A3-FWD:AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT；
CVM SLC35A3-REV:CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAG.；
所述的探针：
针对CVM突变的探针，CVM SLC35A3-M：TCATGGCATTTCTCA；
针对CVM野生的探针，CVM SLC35A3-W：TCATGGCAGTTCTCA。
3.一种非疾病的诊断和治疗目的的引起CVM相关的SNP的检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的检测引物组，对待测牛的DNA样品进行荧光定量PCR反应，根据扩增情况判断待测牛的基因型。
4.根据权利要求3所述的的检测方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR反应，其反应体系为：
Figure FDA0000440812390000021
余下体积用水补足到30ul；
其反应条件：95℃3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，35个循环。
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