CN110272994A

CN110272994A - 诊断cvm的基因突变及其应用

Info

Publication number: CN110272994A
Application number: CN201910636357.1A
Authority: CN
Inventors: 吴南; 吴志宏; 邱贵兴; 左宇志; 张元强; 赵森
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2019-07-15
Filing date: 2019-07-15
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2039-07-15
Also published as: CN110272994B

Abstract

本发明公开了一种CVM相关的基因突变。本发明通过二代测序技术首次发现了CVM患者基因组DNA上存在MYH3基因c.841G>A突变。根据上述研究成果，本发明开发了一种诊断CVM的产品，该产品通过检测受试者基因组DNA上MYH3基因c.841位点的基因型即可判断受试者是否患有CVM，该产品可应用于临床。

Description

诊断CVM的基因突变及其应用

技术领域

本发明属于医学诊断领域，涉及一种诊断CVM的基因突变。

背景技术

先天性脊柱畸形(Congenital Vertebral Malformations，CVM)代表一组严重的先天性缺陷，临床可表现为先天性脊柱侧凸(CS)，脊柱后凸，Klippel Feil综合征和其他复杂综合征。脊柱畸形分为三种类型，包括形成障碍(半椎体、蝴蝶椎和楔形椎)，分节不良(椎体融合，阻滞椎和未分节椎体)和混合畸形。CVM患病率约为1/2000。其他器官或系统畸形，如中枢神经缺陷，胃肠道缺陷，泌尿生殖系统缺陷和心血管系统缺陷，也可发生在CVM患者身上。CVM是胚胎发育过程中轴旁中胚层发育异常的结果。据报道，几个基因(TBX6、NOTCH2、DLL39)与CVM有关。申请人之前已经证明TBX6遗传模型可以解释大约10％的CS病例，这些患者具有独特的临床特征，因此定义了新的CS表型(TBX6相关的先天性脊柱侧凸，TACS)。然而，仍有大量CVM患者的病因不明确。

胚胎肌球蛋白重链基因(Embryonic myosin heavy chain，MYH3)编码胚胎肌球蛋白的重链。它主要在孕周6至24周表达，在妊娠37周时完全被消除。已知，MYH3是远端关节挛缩综合征(distal arthrogryposis syndrome,DA)的致病基因，远端关节挛缩综合征包括DA1(OMIM：108120)，DA2A(Freeman-Sheldon综合征，OMIM：193700)和DA2B(Sheldon-Hall综合征，OMIM：601680)。最近，MYH3也显示与常染色体显性multiple pterygium综合征(DA8，OMIM：178110)和呈显性或隐性模式的Spondylocarpotarsal synostosis综合征(SCT，OMIM：272460)相关。脊柱畸形是DA8和SCT最常见的临床特征之一。

在本申请中，申请人研究了具有致病性MYH3变体的CVM患者的基因型和表型特征以及候选MYH3变体的致病性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够在CVM早期即可准确诊断疾病发生与否的诊断标志物及其应用。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于诊断CVM的基因突变，所述基因突变是MYH3基因上的突变。

进一步，所述突变位点是MYH3基因c.841位。即可以通过检测MYH3基因c.841位点的基因型来诊断CVM。

具体的，所述突变是c.841G>A。

根据本发明的又一个方面，本发明还提供了检测前面所述的基因突变位点基因型的试剂。

进一步，所述试剂包括针对前面所述的基因突变位点的特异性扩增引物。

进一步，所述试剂还包括dNTPs、Taq酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液等PCR扩增反应中常规试剂。

本发明提供了前面所述的基因突变位点在制备前面所述的试剂中的应用。本领域技术人员根据基因突变位点上下游序列设计特异性扩增引物或者特异性检测探针。引物和探针的设计方法是本领域的常规技术。

本发明还提供了前面所述的基因突变位点在制备前面所述的试剂中的应用。

本发明还提供了前面所述的基因突变位点在制备CVM诊断产品中的应用。

本发明还提供了前面所述的试剂在制备CVM诊断产品中的应用。

进一步，所述诊断产品通过检测样本中前面所述的基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有CVM。

在本发明的具体实施方案中，所述样本来源是血液。

本发明还提供了一种CVM诊断产品，所述诊断产品包括检测前面所述的基因突变位点基因型的试剂。

本发明的所述诊断产品包括试剂盒、芯片、或者试纸。

此类试剂盒可以包含载体手段，其被隔室化以紧密约束方式容纳一个或多个容器手段，诸如管形瓶、管等，每个容器手段装有要在所述方法中使用的分开成分之一。典型地，试剂盒会包括上文所描述的容器和一个或多个其它容器，其中装有从商业和使用者观点看需要的材料，包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明书的包装插页。容器上可以存在标签以指出体内或体外使用的用法。试剂盒中的其它任选成分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、清洗缓冲液、底物缓冲液等)、其它试剂诸如能被酶标记物化学改变的底物(例如色原)、表位修复液、对照样品(阳性和/或阴性对照)等。

本发明的所述的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针。具体地，可根据本发明所述的MYH3变体，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。

根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on agenomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

引物

如本文所用，术语“引物”指的是能与模板互补配对，在DNA聚合酶的作用合成与模板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

文库及其制备

如本文所用，术语“文库”是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一定大小的DNA片段混合物。

文库的制备方法为本领域技术人员所熟知，包括(但不局限于)步骤：

(1)提供一待检测样本，所述样品含有经打断的、源自基因组DNA的双链核酸片段，并且所述核酸片段具有平末端；

(2)在双链核酸片段的末端添加接头连接序列；通过所述接头连接序列，在所述双链核酸片段的两端添加接头，其中所述接头具有引物结合区以及连接互补区，所述的连接互补区与所述的接头连接序列互补；两侧3’端和5’端的接头的引物结合区序列不同。

(3)对上一步骤获得的带有接头的DNA双链核酸片段，用第一引物和第二引物进行扩增，从而获得PCR扩增产物的混合物，其中所述引物具有对应于所述接头的引物结合区的接头结合区，并且位于接头结合区外侧的测序探针结合区。

还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。纯化条件及参数为本领域技术人员所熟知，对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。

捕获

如本文所用，术语“捕获”，指的是探针对文库中外显子区域的DNA片段进行特异性选择和结合的过程。

DNA分子正常情况下是双链，因此捕获之前，DNA分子必须变为单链，一般是通过加热使其变性而达到解链目的，解链的DNA分子被迅速冷却，即保持单链状态。文库变性后在杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显子区域的DNA片段与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交。较佳地，芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂交完毕后，通过变性等方法收集捕获的序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。

本领域技术人员可以通过通用的方法进行外显子捕获和目的片段的洗脱和纯化，也可以应用市售(如：德国Qiagen公司的MinElute PCR Purification kit)试剂盒进行上述过程。在一个优选例中，对待检测的DNA文库的PCR扩增产物的混合物进行单链化，并用封闭分子封闭所述扩增产物中对应于第一引物和第二引物的区域，从而获得两端被封闭的单链扩增产物的混合物；用核酸芯片从所述的经封闭的单链扩增产物的混合物中，捕获疾病相关的核酸分子；对经捕获的核酸分子，用第三引物和第四引物进行扩增，从而获得第二PCR扩增产物的混合物，其中第三引物和第四引物分别特异性结合于所述的第一引物和第二引物；对上一步骤获得的第二PCR扩增产物的混合物进行测序，从而获得样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列信息。

本发明的优点和有益效果：

与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：本发明提供了能够诊断CVM的基因突变；通过对本发明提供的基因突变进行基因分型(genotyping)，即可检测出个体是否有患病的风险或者检测出个体是否患病。本发明的基因突变的检测可达到早预测、早诊断、早干预、早治疗的目的；同时，本发明提供基因突变还可用于诊断产品开发，并能够应用于临床研究、分析及诊断等诸多用途。

附图说明

图1显示存在MYH3基因c.841G>A突变个体的临床表型特征，其中，A：面部先天性畸形；B：屈曲指；C：脊椎融合和侧凸；

图2显示存在MYH3基因c.1400A>C突变个体的临床表型特征；

图3显示MYH3基因突变对相关蛋白表达的影响，其中，A、G：免疫印迹图；B、C、D、E、F、H：柱状统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与CVM相关的基因突变

(1)参与者招募

作为系统解析脊柱侧凸及相关合并症(Deciphering Disorders InvolvingScoliosis and Comorbidities，http://discostudy.org/)研究的一部分，来自北京协和医院(PUMCH)的105个CVM家族，包括99个三人组和6个家庭以及多个CVM患者参加了这项研究。通过放射成像和收集的包括医疗记录和影像的临床数据确定了确认CVM。每个人签署了知情同意书。北京协和医院伦理委员会批准了这项研究。

(2)外显子组测序和数据分析

所有招募的家族都进行了外显子组测序。从外周血提取DNA，并对所有受试者进行了外显子组测序。从DNA样品制备Illumina配对末端文库并进行外显子组捕获，然后在Illumina HiSeq 4000平台上测序。如前所述，使用内部开发的分析管道(Peking UnionMedical College Pipeline，PUMP)调用和过滤变体。

在本研究中，从外显子组数据中提取了所有MYH3变异体，并进行了基于家族的遗传分析。

(3)变体解释和优先顺序

对于所有MYH3变体，首先过滤掉常见的多态性(基于外显子聚集联合[ExAC]数据库的次要等位基因频率[MAF]>0.1％)和深内含子变体。在家族中显性或隐性遗传模式的假设下，选择了新生变体，复合杂合变体和纯合变体。

(4)结果

在家族A和B中分别鉴定了两种新生错义变体(c.841G>A和c.1400A>C)。在另一项关于脊柱侧凸患者的ES诊断产量的研究中，这两种变体被列为可能的致病变异。

在家族A中，变体(c.841G>A，p.Glu281Lys)位于外显子10(MYH3蛋白的头部结构域)中，并且未在ExAC数据库中报道。SIFT，Polyphen2和MutationTaster预测都是致病性的。GERP评分为5.11，CADD评分为36。先证者表现为胸椎椎体融合(T6-T7)，颈部短而身材矮小，但无肋骨或中枢神经异常。其他畸形包括面部畸形(下睑睑裂，长鼻梁，宽人中，腭裂)和四肢异常(左手手足)(表1和图1)。

在B家族中，变体(c.1400A>C，p.Glu467Ala)位于外显子14(MYH3蛋白的头部结构域)中，并且在ExAC数据库中也未报道。SIFT，Polyphen2和MutationTaster预测都是致病性的。GERP评分为4.66，CADD评分为23.7。先证者表现为多椎体融合(T3-T6和T8-T11)和身材矮小，但没有其他明显的异常(表1和图2)。

表1 MYH3变体和家族临床特征

实施例2致病基因突变的功能验证

为了进一步研究MYH3变体的发病机理，使用MYH3-EGFP融合质粒将变体c.841G>A和c.1400A>C转染到HEK-293T细胞中，通过蛋白质印迹分析转染细胞的MYH3表达。

1、pcDNA3.1-MYH3突变-EGFP质粒构建

该工作由北京海创科业生物科技公司帮助完成，大致步骤如下：

(1)分别设计引物扩增MYH3突变序列和EGFP，引物及序列信息如下：扩增MYH3突变序列的引物如下：

MYH3-G841A-F:

5’-CAGCTGAAGGCTaAAAGAAGCTACCACATCTTCTACCAG-3’(SEQ ID NO.1)

MYH3-G841A-R:

5’-CTTTtAGCCTTCAGCTGGAAAGTGACTCTTGA-3’(SEQ ID NO.2)

扩增EGFP序列的引物如下：

EGFP-F:

5’-GAGTGAAGAGCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG-3’(SEQID NO.3)

EGFP-R:

5’-AACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGT-3’(SEQID NO.4)

(2)PCR条件及体系如下：

MYH3 PCR条件如表2和表3所示。

表2 MYH3 PCR反应体系

试剂	体积
		10X KOD Buffer	5μl
DNTP	5μl
		MgSO<sub>4</sub>	3μl
KOD-Plus-Neo	1μl
		PCS2-MYH3质粒	1μl
MYH3-G841A-F	1.5μl
		MYH3-G841A-R	1.5μl
ddH<sub>2</sub>O	32μl
		总计	50μl

表3 MYH3 PCR反应条件

EGFP PCR条件如表4和表5所示。

表4 EGFP PCR反应体系

试剂	体积
		10X KOD Buffer	5μl
DNTP	5μl
		MgSO<sub>4</sub>	3μl
KOD-Plus-Neo	1μl
		EGFP质粒模板	1μl
EGFP-F	1.5μl
		EGFP-R	1.5μl
ddH<sub>2</sub>O	32μl
		总计	50μl

表5 EGFP PCR反应条件

按照1％琼脂糖凝胶分别回收上述PCR产物。

(3)NheI/NotI双酶切pcDNA3.1(+)载体

酶切体系如6所示。

表6酶切体系

试剂	体积
		pcDNA3.1(+)	10μl
NheI	2μl
		NotI	2μl
FD buffer	10μl
		ddH<sub>2</sub>O	78μl
总计	100μl

37℃酶切0.5h后回收酶切产物。

(4)重组反应并转化

重组体系如表7所示。

表7重组体系

试剂	体积
		pcDNA3.1(+)酶切产物	1μl
MYH3PCR纯化产物	1μl
		EGFP PCR纯化产物	1μl
2x重组Buffer	5μl
		ddH<sub>2</sub>O	2μl
总计	10μl

混匀后50℃重组反应30min

反应结束后立即将重组反应液冰浴5min。

(5)转化

在重组好的产物中加入50μl ToP10感受态细胞，混匀42℃热激60s，冰水浴120s，将转化好的混合物均匀的涂在含有氨苄抗性的LB平板中37℃过夜培养。

(6)阳性克隆筛选与鉴定

挑取单克隆进行PCR鉴定反应，鉴定引物：

pEGFP-N-5’：5’-TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG-3’(SEQ ID NO.5)，

MYH3-CX-1R：5’-AGGCAGCCAGGTCCATCCCGAAGTC-3’(SEQ ID NO.6)。

c.841G>A阳性克隆测序显示pcDNA3.1-MYH3突变-EGFP质粒构建成功。

2、蛋白质印迹分析

使用Lipofectamine 3000说明书(Termo-Fisher)将MYH3质粒转染到人胚肾(HEK)293T细胞中。将HEK-293T细胞在6孔板上孵育两天。通过标准方法对全细胞提取物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。使用数字图像扫描仪捕获条带强度，并使用图像J(Wayne Rasband，National Institutes of Health)进行定量。用于蛋白质印迹的一抗：GFP(Solarbio，RG001030)，Phospho-Smad3(Cell Signaling，cs 9520，1：1000)，Smad3(Cell Signaling9523，1：1000)，Phospho-Erk p44/42 MAPK(细胞信号传导)，cs 9101，1：1000)，Phospho-p38(细胞信号传导，cs 9211，1：1000)，GAPDH(Cell Signaling，cs 2118，1：1000)，TBX6(Abcam，ab38883，1：1000)。每个细胞实验重复三次。将定量条带标准化为管家基因水平(GAPDH)。

3、统计

使用SPSS Statistics V22.0软件进行统计分析。使用卡方检验，Fisher精确检验和Student's t检验测试定量变量的差异。P≤0.05被认为具有统计学意义。

4、结果

结果如图3所示，与野生型(WT)相比，突变质粒不影响MYH3的表达。由于致病性MYH3突变可以降低TGF-β/BMP信号通路中的Smad3磷酸化，而TGF-β/BMP信号传导对于非洲爪蟾Tbx6表达的启动和维持是必需的，因此研究了变体c.841G>A和c.1400A>C对TGF-β/BMP信号传导和TBX6表达的影响。野生型MYH3促进了转染的HEK-293T细胞中的Smad3磷酸化。然而，c.841G>A和c.1400A>C变体降低了MYH3的刺激作用(分别为P＝0.001和P＝0.000016)，与野生型相比，这两种变体显著促进了TBX6表达(P＝0.002和P＝0.018)。因此，本研究认定这两种有害的新生错义变体通过上调TBX6表达而引起CVM。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> 诊断CVM的基因突变及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagctgaagg ctaaaagaag ctaccacatc ttctaccag 39

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttttagcct tcagctggaa agtgactctt ga 32

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagtgaagag ccaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccgggg 59

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacgggccct ctagactcga gcggccgctt tacttgtaca gctcgtccat gccgagagt 59

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgggaggtct atataagcag ag 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggcagccag gtccatcccg aagtc 25

Claims

1.一种用于诊断CVM的基因突变，其特征在于，所述基因突变是MYH3基因上的突变。

2.根据权利要求1所述的基因突变，其特征在于，所述突变位点是MYH3基因c.841位，所述突变是c.841G>A。

3.权利要求1或2所述的基因突变位点基因型的检测试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括所述基因突变位点的特异性扩增引物。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括dNTPs、Taq酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。

6.权利要求1或2所述的突变在制备权利要求3-5中任一项所述的试剂中的应用。

7.权利要求1或2所述的突变或权利要求3-5中任一项所述的试剂在制备CVM诊断产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述诊断产品通过检测样本中权利要求1或2所述的突变位点的基因型来诊断个体是否患有CVM。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样本来源是血液。

10.一种CVM诊断产品，其特征在于，所述诊断产品包括权利要求3-5中任一项所述的试剂。