CN1126496A

CN1126496A - 耳毒性耳聋易感性突变的检测方法

Info

Publication number: CN1126496A
Application number: CN94192651A
Authority: CN
Inventors: 内森·费舍尔-古德西兰; 托尼·普雷津特
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 1993-06-30
Filing date: 1994-06-30
Publication date: 1996-07-10
Anticipated expiration: 2014-06-30
Also published as: CN1257985C; WO1995001454A1; US5506101A; JPH08510919A; JP2858047B2

Abstract

描述了与耳毒性耳聋、尤其是与服用氨基糖苷类药物有关的耳聋相关的线粒体核苷酸的检测方法。

Description

耳毒性耳聋易感性突变的检测方法

本发明是在政府支持的由国家健康与NIDCD的基金(基金编号DC01402)下获得的。本发明政府拥有一定的权利。发明的背景1.发明的领域

本发明涉及遗传诊断领域。更具体地说，本发明涉及检测一种与耳毒性耳聋有关的人类线粒体核糖体RNA(rRNA)的改变。2.相关的现有技术的描述

感觉神经性耳聋，不论是同神经肌肉疾病还是同糖尿病并发，均与异质性线粒体DNA(mtDNA)突变有关(Shoffner，et al.，Adv.Human Genet.，19：267-330，1990；Ballinger，et al.，Nature Genet.，1：11-15，1992；van den Ouweland，et al.，Nature Genet.，1：368-371，1992；Reardon，et al.，Lancet，34：1376-1379，1992).已经指出在两种类型的非综合征的耳聋中mtDNA突变的相似性，在远东的几个伴家族性氨基糖苷以致的耳聋家族中，曾报告母系遗传方式(Higashi，Clin.Genet.，35：433-436，1989；Hu，et al.，J.Med.Genet.，28：79-83，1991)，一个患母系遗传先天性耳聋的阿拉伯-以色列大的家族被描述(Jaber，eta1.，J.Med.Genet.，29：86-90，1992)。

由于精子显然不提供线粒体给合子，因此线粒体DNA是完全通过母系传递的。这使人们可预想到：线粒体基因的缺陷引起的疾病在两个性别中将是相同，但只通过母系传递。在每一个细胞中有数百个线粒体，它们发挥不同的代谢功能，其中最重要的是通过氧化磷酸化过程合成ATP。每个线粒体包含了几个线粒体DNA(mtDNA)染色体，在人类，它们是16,569个碱基对(bp)的双链环。mtDNA的复制、转录和翻译发生在线粒体中。线粒体DNA编码13个信使RNA、大和小核糖体RNA和22个翻译所必需的转移RNAs。使用线粒体特异的遗传密码信使RNA在线粒体特异的核糖体上翻译出13种蛋白质，这些蛋白质与约60种核编码蛋白质相互作用，形成氧化磷酸化所需的5种酶复合体。

不可逆的听觉丧失是氨基糖苷抗生素(如链霉素、庆大霉素和卡那霉素)的主要并发症(Sande，et al.，Antimicrobial agents，in：Goodman andGilman′SThe Pharmacological Basis of Therapeutics，8thedition.eds，Gilman，et al.，Pergamon press，Inc.，Elmsford，NY，pp 1098-1116，1990)。在中国，由于广泛使用氨基糖苷类药物，在上海一个区，25％的聋哑的听力的丧失可追溯到是使用了氨基糖苷类药物(Hu，et al.，J.Med.Genet.，28：79-93，1991)。在这些病人中，约1/4有其他亲属伴耳毒性耳聋。在所有易感性的垂直传递可追溯到的22例中，遗传方式符合线粒体遗传特征，例如只通过女性传递。在日本发生类似的情况，Higashi对28个链霉素以致的耳聋的家系进行制表，发现除2个家系外，所有家系中易感性特征都是母系遗传的(Higashi，Clin.Genet.，35：433-436，1989)。上述的Hu等人还观察到大多数家族性病例接受抗生素的时期比散发病例短得多，提示存在一种素因突变或遗传易感性(Hu，et al.，同前)。

由于氨基糖苷的“天然靶位”是在进化上相关的细菌核糖体，耳蜗线粒体核糖体是氨基糖苷类药物耳毒性的最可能的靶位(Sande，et al.，同前)。在细菌学研究中，氨基糖苷似乎稳定了70S核糖体中一些氨基酰-tRNA的错配，从而引起翻译过程中mRNA的错读(Hornig，et al.，Biochimie，69：803-813，1987)。除了与核糖体蛋白的相互作用外，氨基糖苷与E.coli 16S rRNA相结合，此点已被化学保护和交联实验所证实(Moazed，et al.，Nature，327：389-394，1987；Gravel，etal.，Biochemistry，26：6227-6232，1987)。这些物理实验预示在翻译保真性中至关重要的是小rRNA的区域。通过在细菌，酵母线粒体，四膜虫属和叶绿体中分离出氨基糖苷类药物耐受的突变，这些突变定位于小rRNA上被预测为进化上保守的区域。已证实了它们的相关性(Tzagaloff，et al.，J.Biol.Chem.，257：5921-5928，1982；Spangler，et al.，J.Biol.Chem.，260：6334-6340，1985；Gaut hier，et al.，Mol.Gen.Genet.，214：192-197，1988；Melancon，et al.，Nucl.Acid s Res.，16：9631-9639，1988)。因此，线粒体rRNA基因，特别是相应的12S rRNA基因，成为了在母系遗传氨基糖苷以致耳聋中最主要的mtDNA突变位点的侯选者。

尽管已预期出线粒体DNA在耳毒性耳聋中的作用，但没有合适的诊断性检测来确定出那些危险个体。结果，至少在耳毒素是氨基糖苷类抗生素的情况下，医生一直面临着这种选择的困境：使用抗生素与患者可能发生不可逆的听力的丧失。本发明通过提供一种快速的、非侵犯性的和高度准确的诊断试验来解决这个问题，该试验可确定一个个体是否有耳毒性耳聋的风险。发明的概述

本发明来源于一个基本的发现：易感耳毒性耳聋个体的线粒体中存在一种核酸序列改变了的核酸。

作为这个发现的一个结果，本发明第一次能够应用一种非侵犯性的、快速的和高敏感的技术让耳毒性耳聋易感个体在接触耳毒素(如一种抗生素)之前得到筛查。附图的简要说明

图1显示了三个母系传递的氨基糖苷类药物以致的耳聋的系谱。实心符号表示个体确系在高频感觉神经性听力丧失前曾接受链霉素治疗；先证者A的父亲(影线符号)因不明原因耳聋。水平小横线表示采集了DNA样本的个体。先证者用箭头表示。家谱A和C来自上海。家谱B来自北京。

图2是人线粒体12S rRNA(A部分)3′端和E.coli16S rRNA(B部分)的相应区域(分别为SEQ.I.D.NOS.3和4.)，显示了在四个伴有母系传递耳聋的家谱中1555位点A到G的突变。E.coli 16S rRNA功能区域描述如下：在{}中的序列是与链霉素相交联的；＊表示与tRNA结合的核苷酸；·表示在核糖体亚基分界面的核苷酸；用粗体表示核苷酸为在氨基糖苷类药物结合时对化学修饰活性的改变；在E.coli序列中有下划线的核苷酸表示在其它物种中氨基糖苷类药物耐受突变的位置。发明的详细描述

本发明是涉及对具有改变的核苷酸序列的核酸的检测方法，其中改变的核酸序列的存在与耳毒性耳聋易感性有关。改变的核苷酸序列或对耳毒性耳聋不易感的正常人的核苷酸序列的相应区域，被称为“靶核酸序列”。靶核苷酸序列可能是，例如，与耳毒性耳聋易感性或素因增加有关的一个突变核苷酸、一个限制性片段长度多态性(RFLP)、一个缺失、插入或重组、一个核苷酸取代、或任何其它感兴趣的哺乳类的核酸序列。

本发明以下述基本发现为基础，即与耳毒性耳聋相关的突变发生在编码线粒体rRNA的线粒体基因中。尽管曾经怀疑过线粒体基因通过某种方式与耳毒性耳聋相关，但不知道发生这些缺失的靶基因就是rRNA基因。

根据本发明的方法，野生型基因的改变被检测到。本发明的“野生型基因的改变”包括了所有突变类型--包含缺失。这改变可能是由于重组如插入、倒置和缺失或者是由于点突变。缺失可能是整个线粒体rRNA基因或只是基因的一部分。因此，突变的发现因此对可能存在耳毒性耳聋的易感性提供了证据。未缺失的线粒体rRNA等位基因可检测当其它突变，如插入、小缺失和点突变。据信，同野生型(非易感性)rRNA相比，在线粒体rRNA和基因中发现的突变通过“缩紧”位于突变的rRNA上的毒素结合口袋(binding pocket)而产生对耳毒性耳聋素因。当耳毒素是一种氨基糖苷类抗生素时此点尤其确实。在后一种情况下，据信突变使线粒体rRNA二级结构类似细菌rRNA，因此增加线粒体rRNA对作用于细菌核糖体水平的细菌抗生素的易感性。其他易感性突变的侯选基因是核编码的线粒体核糖体蛋白基因、与耳毒素摄取或运输有关的基因以及参与耳毒素代谢的基因。

点突变的检测可通过应用本领域公知技术对标本中的等位基进行分子克隆并对这些等位基因进行测序来完成。或者，可用聚合酶链反应(PCR)扩增直接从标本制备的线粒体DNA的基因序列，然后鉴定扩增的DNA序列。或者，单链构象多态性(SSCP)、异源双链和化学裂解等方法可用来在测序前确定突变点的位置。

聚合酶链反应本身在是本领域公知的(Saili，etal.Science，239：487，1988；U.S.Patent Nos.4，683，203 and 4，683，195)。为了扩增靶核苷酸序列而使用的特异引物将在以后详细讨论。在被称为等位基因特异的寡核苷酸(ASO)杂交技术中，通过与PCR-扩增产物的杂交，正常和突变的寡核苷酸可用于检测靶核苷酸序列。本领域公知的连接酶链反应也可用于扩增线粒体序列(Wu，et al.，Genomics，4：560，1989)。此外，可应用被称为等位基因特异的PCR技术(Ruano and Kidd，Nucleoti c Acids Research，17：8392，1989)。依照这个技术，应用一些在其3′端与特定线粒体rRNA突变杂交的引物。如果特定的突变不存在，观察不到扩增产物。基因的插入和缺失也可用克隆、测序和扩增来检测。此外，可用基因或周围标记基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针来确定等位基因的改变或多态性片段中的插入。也可使用本领域所知的其它检测插入和缺失的技术。

当靶核苷酸序列需要扩增时，可通过使用作为扩增引物的寡核苷酸来实现。这些独特的寡核苷酸是以识别突变核苷酸序列附近的旁侧区域为基础。例如，在本文具体描述的一个12S rRNA突变中，这些寡核苷酸引物包含依据线粒体共有序列，可与重链530-549位和轻链1899-1880位的旁侧核苷酸序列杂交的序列和其互补序列。

如本文所述，分析了两种不同的伴有母系传递易感性的非综合征耳聋，一种需要一个外源因素，另一种需要核突变以利于表达。确定了12S rRNA基因1555位核苷酸的一个mtDNA突变，它似乎是病理性突变，其理由如下：(1)在所有4个家系中这是唯一的一个共同突变；(2)此突变不存于278例大多数是同种族婚配的正常听觉的对照组中；(3)在三个氨基糖苷以致的耳聋的家系中，没有见到候选基因其它少见突变；(4)在阿拉伯-以色列家系中确定的其它突变，没有一个在其他任何线粒体疾病中被描述为起病理作用，或在耳毒性耳聋的家系中被发现；(5)这个突变改变了12S rRNA高度保守区域的一个核苷酸；(6)在12S rRNA基因中突变的这个核苷酸处于已知的氨基糖苷的结合区域中(Moazed，et al.，同前)，在其它物种，已发现这个区域发生了氨基糖苷耐受的突变(Tzagaloff，et al.，同前，et al.，同前)。

1555 A→G突变是在耳毒性耳聋家系中所识别的三个序列改变中的唯一一个显示出与疾病独特的相关性的突变。两个其它突变，663A→G和1736A→G，也在这三个母系遗传耳毒性耳聋的家谱中发现，但这两突变是中国人中普遍存在的多态性，频率是10-11％。由于这两个突变共同存于13个对照个体中，1555位突变最大可能是在含有这两个突变的线粒体染色体上发生的。663A-＞G和1736A→G本身可能不是致病突变，因为氨基糖苷以致的耳毒性耳聋的总发病率估计在1∶10,000(Hu，et al.，同前)。更重要的是，具有这两种突变的对照组中至少有4人接受过链霉素，但没有疾病效应。

在阿拉伯-以色列家族中发现一些家族特异的突变，这些突变可导致疾病表型，或增加了1555A-G突变的作用。同Leber′s遗传性眼神经视网膜病(LHON)相似，神经特异的线粒体疾病可能也需要一个附加的核基因的参与(Vikki，et al.，Am.J.Hum.Genet.，48：486-491，1991；Bu，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8198-8202，1991)，任何一种或所有这些少见突变可能相互作用产生一个“病理性单倍型”。绝大多数LHON患者有单一的mtDNA点突变(Wallance，et al，Science，242：1427-1430，1988；Howe 11，et al.，Am.J.Mu.Genet.，49：929-950，1991；Howell，et a1.，Am.J.Hum.Genet.，48：935-942，1991；Muoponen，et al.，Am.J.Mum.Genet.，48：1147-1153，1991)，但有些LHON病例看来似乎是由于多个突变的混合效应导致了疾病(Brown，et al.，Genetics，130：163-173，1992；Johns，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，174：1324-1330，1991；Brown，et al.，Am.J.Hum.Genet.，52：378-385，1992)。因为1555突变在三个其它母系传递的耳聋易感家谱中被发现，在阿拉伯-以色列家谱中这突变被认为是致病性缺陷。在这个家系中，其他mtDNA突变可能参与损害氧化磷酸化过程，但低于发生耳蜗改变所需的阈值。家系所有受检成员都有病源性单倍型，每个突变似乎都是同质性的(如果存在异质，其在血中的水平将低于10％)。因此，未患病的家族成员具有相同mtRNA序列，而不耳聋的原因估计可能因为是没有出现推定的常染色体隐性突变纯合性。

为了不局限于一个特定理论，据信一个两次打击(two-hit)模型可解释在这些家谱中出现的非综合征性耳聋。除了相应的1555A→G突变外，这个疾病可能由摄取外源性的氨基糖苷，以致氨基糖苷积聚在耳蜗(Sande，et al.，同前)；或者，在阿拉伯-以色列家谱中，通过假定的耳蜗特异的有12S rRNA突变核糖体亚单位与12SrRNA突变的相互作用而被加剧。两者均将干扰或废除线粒体核糖体的翻译功能。

1555A→G突变影响了小rRNA高度保守区(图2)，在生物体如细菌，植物，无脊椎动物和哺乳类，小rRNA有两个伴保守序列的单链区，被两个结构上保守的茎-环分开(Neefs，et al，同前；Gutell，et al.，同前；Noller，et a1.，Ann.Rev.Biochem.，53：119-162，1984)。细菌学的研究显示：分子的这个部分是mRNA被解码的氨基酰位点的一部分，并位于核糖体亚单位界面(Hornig，et al，同前；Moazed，et al.，suora；Brimacombe，Biochemistry，27：4207-4213，1988)。氨基糖苷通过与该解码区结合和稳定错配的氨基酰tRNAs而影响翻译的忠实性(Hornig，et al.，同前)。在这个区域一些核苷酸(在图2用粗体显示)在与氨基糖苷的结合时受到影响。因为当链霉素，庆大霉素，新霉素，卡那霉素或潮霉素被结合时，其对化学修饰剂的反应性改变(Gravel，et al.，同前)。链霉素也将这个区域交联到E.coli小rRNA的另一部分(Gravel，et al.，同前)，在那里链霉素耐受突变被发现(Montandon，et

al.，EMBO J.，5：3705-3708，1986；Etzold，et al.，FEBS Lett.，219：343-346，1987)。

最后，这个区域在氨基糖苷功能中是重要的，因为氨基糖苷的耐受突变(在图1划线处)在酵母线粒体(Tzagaloff，et al.，同前)和四膜虫(Spangler，etal.，同前)的小rRNAs相似位点中被发现。有意义的是，其中两个突变破坏了我们的突变位点相邻的碱基对，实际上”增宽了”氨基糖苷的结合口袋。相反，1555A→G突变可产生一个新的C→G碱基对，延长茎/环和”缩紧”这个区域，使得二级结构更近似于细菌小rRNA。据信1555A→G突变延长了这个双螺旋，增宽了氨基糖苷的结合和增加了这些抗生素在翻译忠实性作用的易感性。

在本发明的方法中可使用的引物包含足够长度和适当序列的寡核苷酸，以便提供特异开始，合成含靶核酸的足量核酸分子。如此，可以选择性扩增包含重要核酸的特异靶核酸。特别地，本文中的术语“引物”是指包含二个或更多个脱氧核糖核苷或核糖核苷的序列，最好至少是8个，这种序列有启动合成一个引物延伸产物的能力，与一个靶核酸链充分互补。虽然寡核苷酸引物可以含少一些核苷酸，通常包含15-22或更多核苷酸，当然其也可以少一些核苷酸。

有利于合成的实验条件包括三磷酸脱氧核苷酸，聚合作用的因子如DNA聚合酶及合适的温度和PH。为了达到最大扩增效应，引物最好是单链，但也可以是双链。如果是双链，在用于制备延伸产物前，引物首先要经过将其链分离的处理。优选地引物是一寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够地长以便在聚合作用的以致剂的存在时引导延伸产物的合成。引物的精确长度取决于许多因素，包括温度，缓冲液和核苷酸的组成。

根据本发明方法，所用的引物被设计成和待扩增的突变型或野生型核苷酸序列的每条链均大致地互补。“大致地互补”指的是在聚合作用的因子能工作的条件下，引物必须充分互补以致于能和其相应的链杂交。也就是说，引物必须和待杂交的旁侧序列有充分的互补性并允许靶核苷酸序列的扩增。优选地被延伸的引物末端和互补的目标序列有优选的碱基对的互补。

本发明方法所用的寡核苷酸引物可用于任何能产生大量靶核酸的扩增过程。通常，一个引物同靶核苷酸序列的负链(-)互补，而另一个同正链(+)互补。将引物与变性后核酸一起退火，随后用酶，如DNA多聚酶I的大片段(Klenow)或Taq DNA多聚酶和核苷酸或连接酶参与延伸，产生含靶核酸的合成的+和-链。因为这些新合成的核酸也是模板，所以变性、引物退火和延伸的重复循环导致被引物所限定区域(如靶核苷酸序列)的指数生成。扩增反应的产物是散在核酸双螺旋链，其末端与所采用的特异引物端相对应。本领域的技术人员将知道其它也可用来增加靶核酸拷贝数目的扩增的方法。

在本发明中所用的寡核苷酸引物可用任何合适的方法制备，如传统的磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自动的实施方案。在一个这样的自动的实施方案中，用双乙氨基磷酸酯作为起始材料并可以用Beaucage等人描述的方法进行合成(Tetrahedron Lette rs，22：1859-1862，1981)。U.S.专利4,458,066中描述了一个在修饰的固相支持物上进行寡核苷酸合成的方法。如上所述，一种可用于本发明的扩增方法是U.S.专利4,683,202和4,683,195所描述的多聚酶链反应(PCR)。

任何纯化或未纯化核酸标本均可用作为初始的核酸，条件是其含有或被怀疑有靶核酸特异的核酸序列。因此，此过程可以应用DNA或RNA，它们可以是单链或双链。在RNA被用作模板时需采用合适的酶和/或有利于模板逆转录成DNA的有利条件。此外，所使用的模板可以是有一条DNA链和一条RNA链组成的DNA-RNA杂合体。也可使用核酸的混合物或先前扩增反应的核酸产物(使用相同或不同引物)。被扩增的核苷酸序列可以是一个大分子的一部分或最初作为一个不同分子存在，以便特异序列组成了整个核酸。不必要待扩增的序列最初就必须是纯化形式；它可以是一个复杂混合物的一个小部分，如包含在整个人类DNA中，只要线粒体DNA是被包括在内即可。

当标本的靶核苷酸序列包含了两条链时，在其被用作模板前需将核酸链分离开。解链可以作为一个单独步骤或与引物延伸产物的合成同时进行。这种链的分离可用许多适当的变性条件，包括物理，化学或酶学的方法来实现；“变性”这词包含了所有这些方法。分离核酸链的一个物理学方法是加热核酸直到它变性。典型热变性所涉及的温度范围是从约80℃到105℃，时间约1到10分钟。链的离开也可用一组称之为解旋酶中的一个或具有解旋酶活性的Rec A酶在能变性DNA的核糖ATP存在时诱导。Kuhn Hoffmann-Berling(CSH-Quantitative Biology，43：63，1978)描述了用解旋酶分离核酸链的适宜反应条件，运用RecA的技术由C.Radding综述(Ann.Rev.Genetics，16：405-437，1982)。

若含有待扩增的靶核酸的核酸是单链状态，每条链的互补链是通过加入特异的互补的寡核苷酸引物而合成。在引物、聚合作用的因子和4种在以下将描述的三磷酸脱氧核苷酸存在下合成了引物延伸产物。产物和单链核酸互补，并与单链靶序列杂交。

当核酸的互补链被分离时，不管核酸最初是双链或单链的，分离的链可以用作另外核酸链合成的模板。这种合成是在允许引物同模板发生杂交的情况下进行的。通常合成发生在PH优选为7—9，最优选为8的缓冲的水溶液中。优选地，两个寡核苷酸引物以过量的摩尔数(对于基因组核酸，通常引物∶模板比约10⁸∶1)加入含分离的模板链的缓冲液中。然而，应理解的是，如果本发明的方法被用于诊断，互补链的量可能是未知的，因此与互补链的量相应的引物量是不可确定的。在实践中，当被扩增的序列被包含在复杂的长链核酸链的混合物中时，加入的引物的量比互补链(模板)通常是摩尔过量。较大的摩尔过量有利于提高方法的效率。

在一些扩增实施方案中，底物，如三磷酸脱氧核糖核苷酸dATP，dCTP，dGTP和dTTP以足够的量单独或和引物一起被加入合成混合物中，获得的溶液被加热到90℃-100℃，持续约1-10分钟，优选是1-4分钟。在加热过程后，将溶液冷却到有利于引物杂交的温度。向冷却混合物中加入合适的因子使发生引物延伸反应(在本文称之为“聚合作用的因子”)，并在现有技术所知的条件下使反应发生。如果其是热稳定性的，聚合作用的因子也可以同其它试剂一起加入。合成(或扩增)反应可发生在室温直至一个高于该温度聚合作用的因子便不再起作用的温度。因此，例如，如果DNA聚合酶用作所述的因子，温度通常不高于40℃，最方便的是反应发生在室温。

聚合作用的因子可以是任何具有完成引物延伸产物合成的功能的成分或系统，包括酶。合适的酶包括：如E.coli DNA多聚酶I、Taq DNA多聚酶、E.coli DNA多聚酶I的Klenow片段、T4 DNA多聚酶，其它有效的DNA多聚酶、多聚酶突变蛋白质(muteins)、逆转录酶、连接酶和其它酶，包括了热稳定酶(即那些在被放入到温度足够增高到引起变性后才发挥引物产延伸作用的酶)。合适的酶能促进核苷酸以合适的方式结合，从而形成可与每条核苷酸链互补的引物延伸产物。通常合成将在每个引物的3′端开始沿模板链向5′方向进行直到合成结束，产生不同长度的分子。然而，可能有些具聚合作用的因子，用上述相同的方法从5′端开始合成，沿另一个方向进行。无论怎样，本发明的方法不局限在这里描述的扩增的实施方案。

在上述的杂交条件下，新合成的核苷酸链和其互补核酸链将形成一条双链分子，这个杂交体被用于随后的加工步骤。在下一步用上述的产生单链分子的任何步骤，将新合成的双链分子进行变性。

在单链分子上重复上述方法。为了在上述条件下继续进行反应，如果需要的话，还需再加入聚合作用的因子、核苷酸和引物。合成将再一次在每条寡核苷酸引物的一端开始，沿着模板链进行以产生另外的核酸。在这一步之后，延伸的产物的一半将由两个引物所限定的特异核酸序列组成。在随后步骤中，被两个引物所限定的延伸产物以指数增长。

野生型基因的改变也可在基因的野生型表达产物的改变的基础上被检测到。这些表达产物包括线粒体rRNA，特别是12S rRNA。点突变量通过rRNA扩增和测序或通过来自rRNA的cDNA分子克隆来检测。克隆的cDNA的序列可用现有技术已熟知的DNA测序技术来测定，cDNA还可通过多聚酶链反应(PCR)如利用循环测序或不对称PCR而被测序。

根据本发明，错配可能是杂交的核酸双螺旋，它们不是100％同源性的。不完全同源性可能是由缺失、插入、重排、取代或框架移动突变引起。错配检查可用来检测在基因或其rRNA产物中的点突变。虽然这些技术的敏感性低于测序，但在进行大的标本量时较为简便。一个错配裂解技术的例子是RNA酶保护方法(Winter，et al.，Proc.Na tl.Acad.Sci.USA，82：7575，1985；Meyers，et al.，Science，230：1242，1985)。在本发明的实践中，该方法还包括应用和人野生型基因编码序列互补的标记的核糖体探针，核糖体探针和从标本中分离出的rRNA或DNA一起退火(杂交)，随后用RNase A酶消化，它可检测出在双螺旋RNA结构上的错配。如果一个错配被RNase A酶检出，则其在错配位点上被切除。因此当退火的RNA标本在一个电泳凝胶基质上被分离时，如果一个错配被检出并被RNase A酶切除，就会见到一个RNA产物，该产物比核糖体探针和rRNA或基因形成的全长的双螺旋RNA小，但其可以是两者中的一部分。如果核糖体探针只包含线粒体rRNA或基因的一部分，为了检测错配，用许多这样的探针去检查整个rRNA序列可能会更好。

同样，通过酶或化学裂解法，DNA探针可被用于检测错配(Cotton，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：4397，1988；Shenk，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72：989，1975)。或者，错配可以用错配的双螺旋相对于匹配的双螺旋的电泳迁移率的改变而检出(White，et al.，Genomics，12：301，1992；Cariello，Huma n Genetics，42：726，1988)。PCR-扩增产物可用以筛查那些用SSCP分析时能引起DNA单链的电泳迁移率改变的变异(Orita，et al.，Genomics，5：874，1989)。无论用核糖体探针还是DNA探针，可能含有突变的线粒体rRNA或DNA可在杂交前用PCR扩增。线粒体基因DNA的改变也可用Southern杂交检测，特别是这些改变是大的重组、缺失、或插入。

来自被PCR扩增的标本的rRNA基因的DNA序列也可用等位基因特异探针检测。这些探针是核酸寡聚体，每个含有包含已知突变的rRNA基因序列区域。例如，一个寡聚体可能长约15核苷酸，对应于rRNA基因序列的一个部分。利用一组这样的等位基因特异的探针，可筛查PCR扩增产物以确定在rRNA基因中以前已被确定的突变是否存在。等位基因特异的探针同扩增的线粒体rRNA序列杂交可在一个尼龙膜上进行。在严格杂交条件下与某一个特定探针杂交表明在标本中存在与等位基因特异探针一样的突变。

突变的线粒体rRNA基因或基因产物可在人体样本或标本如血液中被检出。通过筛查这些标本，可达到对耳毒性耳聋易感性的简单早期诊断。本发明的诊断方法对于临床工作者们选择一个合适的治疗过程是有用的，例如线粒体12S rRNA或基因呈现的改变可提示特定患者避免使用一种特定的耳毒性抗生素。其它能被筛查出可能对耳毒性耳聋易感性的突变基因可包括编码线粒体核糖体蛋白基因的核基因。

本发明的引物对在应用多聚酶链反应确定线粒体rRNA基因的核苷酸序列是有用的。成对的单链DNA引物可退火结合到线粒体rRNA或基因内或周围序列，以便引导线粒体rRNA或基因本身的DNA合成的扩增。一整套的这些引物允许合成线粒体rRNA基因编码序列全部的核苷酸。也可使用等位基因特异引物，这些引物只能退火到特定线粒体rRNA突变等位基因上，因此只能以突变的等位基因为模板扩增产物。

为了方便克隆扩增序列，可在引物5′端连有限制酶位点序列。这样除了形成限制酶位点所必需的少数几个核苷酸外，所有引物的核苷酸均来源于线粒体rRNA序列或线粒体rRNA的邻近序列。这些酶和位点在本领域是众所周知的。引物本身也可用本领域熟悉的技术合成。通常，引物利用商品化的合成仪合成。如果线粒体rRNA序列是已知的(Anders on，et al.，Nature，290：457，1981)，本领域的技术人员可容易地设计出特定引物。

本发明所提供的核酸探针可用于多方目的，它们可用于基因组DNA的S outhern杂交、用于上述的RNase保护方法来检测点突变。所述的探针可用于检测扩增产物，它们也可用于利用其它技术检测线粒体rRNA基因或rRNA的错配。错配可用酶(如S1核酸酶)、化学品(如羟胺或四氧化锇和六氢吡啶)或错配杂种分子与完全匹配的杂种分子或靶序列的单链相比在电泳迁移率方面的改变来检测。这些技术在本领域是公知的(Cotton，同前；Shenk，同前；Myers，同前；Winter，同前；White，同前；Orita，同前；and Novack，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：586，1986)。通常，探针是与线粒体rRNA基因编码序列互补，当然探针与rRNA的相应区域也是共模板的。一整组核酸探针被用于组成一个检测野生型线粒体rRNA基因的改变的试剂盒。试剂盒可以和整个线粒体rRNA基因杂交。探针彼此间是重叠或是邻接的。在一优选的实施方案中，若增加耳毒素易感性的突变位于线粒体16S rRNA的1555位核苷酸，所用的杂交探针是能与包含5′-CGA·CTT·GTC·TCC·TCT-3′(SEQ.I.D.NO.1)的正常序列的线粒体核苷酸序列杂交，及与5′-CGA·CTT·GCC·TCC·TCT-3′(SEQ.I.D.NO.2)的突变序列杂交，以及与其互补序列杂交的探针。

如果用一个核糖体探针检测rRNA的错配，该探针与人野生型线粒体rRNA基因的rRNA互补。核糖体探针通常用放射性，发色和荧光物质标记，这些都可用本领域熟悉的任何方法完成。如果核糖体探针被用于检测DNA的错配，其可以是正义也可以是反义性的。同样，DNA探针也可以被用于检测错配。

核酸探针也可以与线粒体12S rRNA基因的突变等位基因互补。以杂交为基础，所述的探针在检测其它患者的相似突变上比错配更有用。这些在上文已讨论过并被称之为等位基因特异探针。如上所述，线粒体rRNA探针也可用于与基因组DNA的Southern杂交来测出大的染色体改变如缺失或插入。探针也可用于从具有耳毒性耳聋素因的患者及没有该素因的正常个体的组织中选择线粒体rRNA基因的cDNA克隆。此外，这些探针可用于检测组织中的线粒体rRNA，以确定野生型线粒体基因的改变是否导致表达降低。如果提供线粒体rRNA编码序列(Anderson，et al.，Nature，290：457，1981)，则本领域的技术人员可容易地设计出的特定探针。

在本发明的一个实施方案中，包含10-50碱基的寡核苷酸序列纯化的核酸片段经放射性标记。通过Southern杂交技术标用记好的制备物探测核酸。来自于一个标本的核苷酸片段在扩增前或扩增后，通过凝胶电泳分离成不同分子量的片段，转移到结合核酸的膜上。

将包含靶核酸序列的核苷酸片段与标记探针杂交，放射性探针和靶核酸片段的结合通过放射自显影鉴定(见Genetic Engineering，1，ed.Robert Williamson，Academic Press，(1981)，72-81)。或者来之粪便的核酸可直接被结合到膜上，放射性探针选择性地与感兴趣的具有特异序列的核酸结合，其结合程度通过直接计数放射量而被定量。

当靶核酸没有被扩增时，可直接用一个适当的杂交探针与分离的哺乳动物核酸进行检测。当靶核酸被扩增的情况下，可在扩增后用适当杂交探针进行检测。

本发明的探针可用于检查被测特异片段的分布，以及探针结合的(相对)程度以确定是否存在结合(杂交)特别强的序列，因此可提示某个体可能患耳毒性耳聋风险的高低。

在大多数情况下，探针将用一个原子或无机基团标记，最常用的是放射性同位素，但也可能是重金属。通常，可采用放射性标记。放射性标记包括³²P、¹²⁵I、³H、¹⁴C、³⁵S等。任何可提供足够信号和相当半衰期的放射性标记都可采用。其它标记包括配体，它可作为对标记配体等的特异结合配对成员。已经采用许多不同的标记进行免疫测定，这些均可在本发明分析中采用。标记物的选择由影响杂交率的标记效果、探针与突变核苷酸序列的结合能力所决定。以下这一点是必需的：标记物要能提供足够敏感性以检测可杂交的突变核苷酸序列的量。另一点要考虑的是探针要便于合成、现有的测试设备、自动化能力、方便等等。

根据标记物的本性，标记物同探针结合的方式将不同。对于放射性标记物，可采用多种不同的技术。通常采用的是用α-³²P-dNTP进行缺口翻译，或用碱性磷酸酶进行末端水解后用γ-³²P ATP和T4多核苷酸激酶标记上放射性³²P。或者，可合成核苷酸，以放射性同位素替代一个或多个现有的元素，如用氚替代氢。如果需要，标记的互补链可用作探针以增强杂交的标记物浓度。

当应用其它放射性同位素标记物时，可采用不同的连接基团。可用无机酸如³²P磷酸或¹⁴C有机酸酯化末端羟基，或其它酯化方法为标记物提供连接基团。或者中间的碱基可用可激活的连接基团取代，然后与标记物连接。

作为报导基团的有价值的酶类主要是碱性磷酸酶、水解酶，特别是酯酶和葡萄糖苷酶，或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光复合物包括荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰、7-羟香豆素，等等。化学发光包括如虫荧光索和2，3-双氢二氮杂萘二酮(如氨基苯二酰一肼)。

探针可用于与固定在非水溶性的孔状支持物上的核苷酸序列杂交。根据核酸的来源，核酸固定在支持物上的方法可不同。本领域一般技术人员知道，或容易确定，可用于本发明的方法的不同的支持物。

来自标本的核酸点在或铺在滤膜上提供许多个体部分。膜是惰性多孔固相支持物，如硝酸纤维素或尼龙膜。标本中存在的任何哺乳类细胞经处理释放出其核酸。核酸的溶解和变性以及后来的洗涤，可用适宜的溶液作用足够的时间以溶解细胞和变性核酸。其它变性剂包括升高温度、有机试剂(如：酒精、酰胺、胺类、尿素、苯酚和亚砜)或某些无机离子(如：硫氰酸盐和高氯酸盐)。或者，通过标准程序从血中分离核酸，随后将DMA加到膜上。

变性后，膜在水性缓冲溶液如Tris(通常pH约6-8，常常为7)缓冲液中洗脱。用与溶解和变性时采用的相同程序洗一或多次。在溶解、变性和洗脱完成之后，点上核酸斑点的膜在高温下干燥，通常为50℃-70℃或紫外交联(对于尼龙膜)。经过这一程序，核酸被固定在点加的位置上，在方便时便可用探针分析。

在一个轻度升高的温度下在无探针的杂交溶液中将膜保温足够的时间，使膜完全浸湿完成预杂交过程。可采用不同的杂交溶液，包含从20％到60％(体积)，最好是30％的非极性有机溶剂或水性杂交溶液。

上述具体的杂交技术不是本发明的要点。其它杂交技术是众所周知的或容易被本领域的普通技术人员所掌握。随着杂交技术的改进，它们在本发明的方法中可随时被采用。

杂交溶液中标记探针的总量变异很大，取决于标记物的性质、能结合到膜上的标记探针的量和杂交强度。通常，采用远远比计算的浓度过量的探针，以增强探针与固定在膜上的靶核酸的结合率。

可采用不同程度的杂交严格条件。条件越严格，探针与单链靶核酸序列之间杂交形成双螺旋所需的互补性越大。严格性可通过温度、探针的浓度、探针长度、离子强度及杂交时间等控制。通常，杂交的严格性通过调节甲酰胺的浓度在20％到50％范围以控制反应溶液极性的改变。采用的温度正常在20℃-80℃的范围，通常为30℃-75℃(通常参见Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel，ed.，Wiley&Sons，1989)。或者，当非退火探针被洗去时，严格性可控制。

在膜与杂交溶液在合适温度下持续接触足够时间使发生杂交后，然后将膜移入含有氯化钠、柠檬酸钠和十二烷基硫酸钠的第二种溶液。膜在第二种溶液中持续的时间可为5分钟到3小时或更长的时间。第二种溶液和温度(通常低于解链温度5℃)决定了严格性、双螺旋和短的互补序列。对于短的寡核苷酸探针，通过在洗脱液中加入四甲基氯化铵，解链温度可根据探针的长度而不是其序列而标准化，(Dilella and Woo，Meth.Enzymol.，152：447，1987)。现在可遵照标记物的性质测试膜上的双螺旋。当标记物是放射性时，膜干燥后进行X光胶片曝光。本发明测试中所用的材料适宜于制备试剂盒。这种试剂盒包含一个分隔的包装，可容纳小的一个或多个容器如：小瓶、试管等，每种容器包含一种本方法所用的的试剂。

例如：一个容器包含一个已被或可以被检测性标记的杂交探针。还可包含第二个容器(如果存在)灌装裂解缓冲液。试剂盒还可包含装有用以扩增目标核酸序列的各种核苷酸的容器，，和/或一个包含报导者的容器(如一个生物素结合蛋白如亲和或链亲和素，结合到报导分子，如酶、荧光或同位素标记物)。

根据本发明，还提供了对携带突变线粒体rRNA等位基因的细胞提供野生型线粒体rRNA功能的方法。提供这种功能可抑制对耳毒性耳聋的素因。野生型线粒体rRNA基因或基因的一部分可在一个载体中导入细胞，以便该基因以染色体外形式存在。在这种情况下，基因由细胞从染色体外的部位表达。如果一个基因部分被导入并在携带突变线粒体rRNA等位基因的细胞中表达，该基因的部分应编码对耳毒性耳聋不易感所必需的线粒体rRNA的一部分。优选的是野生型线粒体rRNA基因或其一部分是以如此方式导入突变的细胞中，即它与线粒体中内源性突变的线粒体rRNA基因发生重组。将DNA导入细胞的方法，如电穿孔、磷酸钙共沉淀和病毒转导是本领域所熟悉的，方法的选择也在常规操作者的能力之内。用野生型线粒体rRNA基因转化的细胞可作为研究失去对耳毒性耳聋和药物治疗易感性的模型系统，这些药物治疗在易感个体中不导致耳毒性耳聋。

对耳毒性耳聋的易感性可通过在人正常组织中检测线粒体rRNA基因的突变来确定。如，一个获得种系突变线粒体rRNA的个体易于对耳毒性耳聋易感。这可以通过对来自该个体任何组织的编码线粒体rRNA的DNA的检测而确定。最简单的是，抽取血液，从血细胞中提取编码线粒体rRNA的DNA。此外，通过测定胎儿细胞或羊水中线粒体rRNA基因的易感性突变进行产前诊断。野生型线粒体rRNA等位基因的改变，无论是点突变还是缺失，都可通过以上所述的任何方法得到检测。

根据本发明，cDNA分子是无内含子的线粒体rRNA基因的编码分子。他们可通过以线粒体rRNA为模板逆转录而成。这些分子在载体和细胞系中能得到繁殖是本领域所熟知的。应用合成化学技术也可制备cDNA。

以上一般性地描述了本发明。通过参照以下的实施例可获得更彻底的理解，本文中提供这些实施例仅仅为了解释的目的，而不是试图局限本发明的范围。

实施例1

家系耳聋突变的检测

本实施例描述了三个母系传递的氨基糖苷致耳聋的家系的基因分析(图1)。在给予链霉素后所有患病个体均发生了高频感觉神经性听力的丧失。

在本研究中，包含线粒体12S和16S rRNA基因的PCR扩增产物(分别在核苷酸(nt)648-1601和1671-3229之间)被直接测序(Anderson，et al.，Nature，290：457-465，1981)。序列是来自两个独立的患者，来自图1中家系A的先证者的母亲、来自家系C的先证者。二个患者在12S rRNA基因有相同的4个序列的改变：663 A→G、750 A→G、1438 A→G、1555 A→G，在16S rRNA基因有3个序列改变：1736 A→G、2706 A→G、和3107位核苷酸1个碱基的缺失。在nt750、1438、2706和3107的“突变”实际上是Cambridge序列上的错误(Marzuki，et al.，Hum.Genet.，88：139-145，1991)。等位基因特异寡核苷酸杂交(Conner，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：278-282，1983；Saiki，et al.，Nature，234：163-166，1986；Dilella，et al.，Meth.Enzymol.，152：447-451，1987)被用来筛查另外一个耳毒性耳聋的患者(图1中的先证者B)以及听力对照组，来检测3个“真”突变：663 A→G，1555 A→G和1736 A→G。第三个患者也存在所有3个突变。

在对照组278个个体中没有发现12S rRNA基因1555A→G的突变，对照组包括138个亚洲人(117个中国人，21个非中国人)、60阿拉伯人、55个高加索人和25个黑人。而在亚洲对照组中663 A→G和1736 A→G突变发生率为11％(13/115)和10％(13/130)。同样的13个对照者同时有663和1736突变。1555 A→G突变在3个家系中是同质的(见下)。A.DNA的加工和扩增

除了先证者C、以色列-阿拉伯先证者的表弟和33个对照的DNA是从EB病毒转变的淋巴母细胞系中分离出来外，其他人的DNA都是从血标本中分离获得。总共检测了278个对照个体，包括138个亚洲人(117个中国人，21个非中国人)、60个阿拉伯人、55个高加索人和25个黑人。

mtDNA在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪中扩增(Saiki，et al.，Science，239：487-491，1988)，用100ng DNA、每个引物10pmol、10mM Tris-Hcl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、200μM dNTPs和1U Taq DNA多聚酶(Perkin-Elmer/Cetus)，25-100μl体积，起始变性95℃5分钟，以后95℃30秒；55℃1分钟；65℃1.5分钟/kb。

为了用PCR测序，PCR产物用Promega′s Magic Prep^TM试剂盒从低熔点胶中(GeneLine LMP agarose，Beckman Instruments)纯化，用[α-³⁵S]dATP(NEW/Dupont)和New England Biolabs循环测序试剂盒进行测序。B.突变的分析

等位基因特异寡核酸杂交(Conner，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：278-282，1983；Saiki，et al.，Nature，324：163-166，1986)用PCR产物进行，PCR产物煮沸后用冷18xSSC稀释，用斑点点样器(Schleicher and Schuell)点在magnaNT尼龙膜上(Micron Separation，Inc.)。合成的寡核苷酸长15碱基，突变或正常的核苷酸位于中央位置，如上所述，用[α-³²P]dCTP(ICN Biochemical)或Boehringer Mannheim Biochemical公司的3′端标记试剂盒所供给的地高辛-ddUTP标记。在所推荐的缓冲液中于在37℃杂交保温箱(Robbins Scientific)中杂交。在室温用2X SSC、0.1％SDS初步洗脱后，在含3M四甲基氯化铵(Sigma Chemical Co.)、50mM Tris-HCl pH 8.0、2mM EDTA中于46℃严格洗脱(Dilella，et al.，Meth.Enzymol.，152：447-451，1987)。对于地高辛标记的探针，根据厂家的要求，用化学发光法检测标记信号。

对改变了限制酶切位点的突变，作为对完全消化和异质的阳性对照，合成了包含一个额外被测酶切位点的PCR产物。根据厂家的指南(New England Biolabs)进行反应产物的消化，PCR产物可直接使用，或者先用pH8.2的50mM Tris乙酸缓冲液从低熔点胶中分离出来。限制酶酶解产物电泳后用澳化乙锭染色显示。

捕获-寡核苷酸核苷酸掺入(TONI)分析如所描述的进行(Prezant，et al.，Hum.Mut.，1：159-164，1992)。简单说来，3′端靠着突变位点而5′端生物素化的寡核苷酸通过掺入模板特异的下一个核苷酸而延长。平行的反应只包含一种对应于正常或异常序列的放射性[α-³²P]dNTP。放射标记的寡核苷酸反应产物被连接着磁珠的链抗生物素蛋白(Advanced Magnetics)所捕获，洗脱后在液闪计数仪上通过Cerenkov计数进行定量。

若进行Southern印迹杂交，1μg基因组血DNA用8UBsmA1(New England Biolabs)消化。经1.5％琼脂糖凝胶电泳，通过毛细现象转移到尼龙膜上(MagnaNT，Micron Separations，Inc.)，通过Amersham的多引物试剂盒用[α-³²P]dCTP标记标记mtDNA片段(在nt319和2590之间的PCR产物)，印迹膜与探针线在Boehringer Mannheim杂交缓冲液中55℃杂交16个小时。严格洗脱液包含0.1X SSC、0.1％SDS，在55℃洗脱。

在一个先天性母系遗传耳聋的阿拉伯-以色列家系中，rRNA基因的序列分析结果为12S rRNA基因中发现9个突变，在16S rRNA基因中发现3个，包括上述的4个Cambridge序列中的错误。在7个“真的”12S rRNA基因的突变中，有4个(825 T→A，851 A→G，930 G→A和1555 A→G)在对照组中很少见或从未见到；在16SrRNA基因中的一个突变(1822 T→C)也少见。除了1555 A→G突变外，这些残基在进化上不保守(Neefs，et al.，Nucl.Acids Res.，19 Supplement：1987-2018，1991；Gutell，et al.，Prog.in Nucl.Acid Res.& Molec.Biol.，32：155-216，1985；Gutell，et al.，Nucl.Acids Res.，26：167-180，1981)。

根据PCR扩增的DNA片段的两条链的测序和SSCP/异源双螺旋分析，似乎所有的mtDNA突变都是同质的。此外，如果正常序列以10％或更高水平存在的话，在用检测突变的分析方法测定了至少12-20个家系成员时，应该检测出异质性。所有限制酶消化都是完全的，因为包含每种酶的PCR产物被选作对照位点。而且，在等位基因特异的寡核苷酸杂交中也没有发现异质的证据(Conner，同前；Saiki，同前；Dilella，同前)。

1555 A→G突变废除了一个BsmA I限制酶切位点，应用Southern印迹分析探索了其异质的可能性。正常mtDNA在这个区域有两个BsmA1片段(1106和1460bp)，而患者有相应的2566bp的突变片段。对来自阿拉伯-以色列家系中的3个成员(两个耳聋和1个未发病)、5个患耳毒性耳聋家系成员(4个来自家系A和1个为家系B的先证者)和一听觉对照的基因组DNA消化物进行了比较，没有发现异质的证据，因为耳聋家系成员没有正常大小的BsmA I片段。

在三个耳毒性耳聋的家系中，对表1中用粗体强调的阿拉伯-以色列家系中少见的突变进行了筛查，除了在三个家系中均存在1555A→G突变外，在他们中没有发现那些少见突变。

表1在阿拉伯-以色列家谱中的mtDNA突变

基因替代突变保守性* 检测** 突变对照数/对照总数12S rRNA 709：G→A 否 ASO 3/19

769：G→A 否 ASO 4/19

825：T→A 否 ASO 2/103

851：A→G 否 ASO 0/107

930：G→A 否 ASO 5/107

1018：G→A 否 ASO 4/19

1555：A→G ＝B，M，R ASO 0/27816S rRNA 1822：T→C 否 ASO 1/110tRNA agn 5704：C→T ＝B，M，R ASO 0/106tRNA agp 7521：G→A 否 ASO 3/19ATP酶6 8582：C→A(Ala→Val) 否 Fnu4H I、 1/109

8701：A→G(Thr→Ala) 否 TONI测定 4/16

8860：A→G(Thr→Ala) 否 Hha I(+) 13/17CO 3 9559：G→C(Arg→Pro) 否 TONI测定 5/5ND 3 10143：G→A(Gly→Ser) 否 Alu I(+) 1/107

10398：A→G(Thr→Ala) ＝B，M，R ASO 15/35ND 4 11025：T→C(Leu→Pro) ＝B ASO 0/109tRNA Ser(AGY)12236：G→A ＝B，M ASO 6/100ND 5 12950：A→G(A8n→Ser) ＝B，M，R，X Hha I 0/110

13105：A→G(Ile→Val) ＝B，M，R，X ASO 4/42Cytb 15884：G→A(Ala→Thr) 否 HaeIII(-)＊在牛(B)、小鼠(M)、大鼠(R)和爪蟾(X)中蛋白编码基因的氨基酸或rRNAs和tRNAs的核苷酸的保守性，否＝不保守。＊＊检测方法包括等位基因特异的寡核苷酸杂交(ASO)、PCR产物的RFLP分析和TONI分析(模板特异的核苷酸掺入分析)，(-)和(+)分别代表所显示的限制酶切位点的缺失和得到。除了以上的突变，我们发现了Cambridge共有序列上的6个已知为错的序列改变(在ntl438、13702、14199、14272、14368和15326)、蛋白编码基因中另外44个中性突变和Cambridge上的3个新错误(在nt740、2706和3107)(Prezant，et al.，已投稿)。以前所述的多态性包括位于nt8701、8860、9559和10398的突变(文献20、35、43、47)。用黑体表示的突变在对照组中的发生率＜5％。除了1555A→G突变在全部278个对照筛查外，对照组包括了阿拉伯-以色列人、高加索人、亚洲人和黑人各35个。

实施例2

散发性耳毒性耳聋突变的检测

本实施例描述了对无耳聋家族历史但在接触氨基糖苷后表现严重听觉丧失的个体的研究结果。

血标本采自36个学生(18个女性，18个男性)，年龄12至21岁，来自北京的三个耳聋学校和一个上海耳聋学校的学生。开始耳聋的时间是从1到10岁，听觉的丧失在抗生素治疗的6个月内被诊断，16例儿童接受链霉素，10例为庆大霉素，4例为卡那霉素，5例为庆大霉素和卡那霉素混用及1例链霉素和庆大霉素混用。大多数病例是门诊患者，对轻微发热性疾病(如上呼吸系统感染)给予抗生素治疗。听觉的丧失的严重性通过听力学测定为严重或明显。病史方面，没有其它家族成员耳聋，不知是否有其它家族成员经氨基糖苷治疗后听觉丧失。

除了mtDNA核苷酸1261和2866之间的区域通过PCR扩增外，患者标本如同在实施例1中描述的一样进行处理。在25μl的体系中加入100ng DNA、每个引物各10pmol、10mM Tris-HCl pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、100μM dNTPs和1U Taq DNA多聚酶(Perkin-Elmer/Cetus)，开始在95℃变性5分钟，其后95℃变性30秒，54℃1分钟，65℃3.5分钟，在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪中扩增mtDNA(Saiki，etal.，Science，239：487-491，1988)。

通过等位基因特异的寡核苷酸杂交，研究结果显示在36例中有1例有12S rRNA基因1555 A→G突变。所有其它35例患者这个位置上为正常的A核苷酸。

1555A→G突变废除了一个BsmA I限制位点，应用Southern即迹分析对该突变异质性的可能性进行进一步研究。正常mtDNA在扩增的ntl261至2866区域有两个BsmA I位点，产生206、293和1106bp的限制性片段，而患者有206bp片段和相应突变的1399bp片段。在新近确定的具1555 A→G突变的患者中，Southern印迹分析没有显示异质的证据(＜＜1％)。对有1555 A→G突变的患者的临床咨询是他的母系亲属不能使用氨基糖苷。

本发明的许多实施方案已被描述。但是，必须知道，可进行许多改进而不脱离本发明的目的和范围。相应地，应该理解本发明不局限在具体描述的实施方案中，而只应由后附的权利要求书的范围而限定。

序列总结

序列ID NO.1是与正常线粒体12S rRNA核苷酸序列杂交的探针核苷酸序列。

序列ID No.2是与突变线粒体12S rRNA核苷酸序列杂交的探针核苷酸序列。

序列ID No.3是人线粒体12S rRNA 3′端核苷酸序列。

序列ID No.4是与序列ID No.3相应区域的大肠杆菌16S rRNA核苷酸序列。序列表(1)一般信息

(i)申请人：Cedars-Sinai Medical Center

(ii)发明名称：耳毒性耳聋易感性突变的检测方法

(iii)序列数目：4

(iv)联系地址：

(A)收信人：Spensley Horn Jubas&Lubitz

(B)街道：1880 Century Park East，Suite500

(C)城市：Los Angeles

(D)州：California

(E)国家：USA美国

(F)邮编：90067(v)计算机可读形式：

(A)媒介类型：软盘

(B)计算机：IBM兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOC

(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)本申请资料：

(A)申请号：PCT

(B)申请日期：1994年6月30日

(C)分类：(viii)律师/代理人信息：

(A)姓名：Gerardi，Michael M.

(B)注册号：33，698

(C)代表/档案号：FD-2773(ix)通讯联系信息：

(A)电话：(310)553-5050

(B)传真：(310)553-4619(2)SED ID NO：1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：15碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特性：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：1..15(xi)序列描述：SED ID NO：1：

CGACTTGTCT CCTCT(2)SED ID NO：2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：15碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特性：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：1..15(xi)序列描述：SED ID NO：2：CGACTTGCCT CCTCT(2)SED ID NO：3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：127碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：rRNA(ix)特性：

(A)名称/关键：misc_RNA

(B)位置：1..127(xi)序列描述：SED ID NO：3：AUGCACACCG CCCGUCACCC UCCUCAAGUA UACUUCAAAG GACAUUUAAC UAAAACCCCU 60ACGCAUUUAU AUAGAGGAGA RCAAGUCGUA ACAUGGUAAG UGUACUGGAA AGUGCACUUG 120GACGAAC 127(2)SED ID NO：4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：151碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：rRNA(ix)特征：

(A)名称/关键：misc_RNA

(B)位置：1..151(xi)序列描述：SED ID NO：4：AUGCACACCG CCCGUCACAC CAUGGGAGUG GGUUGCAAAA GAAGUAGGUA GCUUAACCUU 60CGGGAGGGCG CUUACCACUU UGUGAUUCAU GACUGGGGUG AAGUCGUAAC AAGGUAACCG 120UAGGGGAACC UGCGGUUGGA UCACCUCCUU A 151

Claims

1.检测人类耳毒性耳聋遗传素因的方法，包括：

检测人类组织中野生型线粒体rRNA基因编码序列的改变或该序列表达产物的改变，所述改变表明对耳毒性耳聋易感。

2.权利要求1的方法，其中表达产物是一种rRNA。

3.权利要求2的方法，其中rRNA是12S rRNA。

4.权利要求2的方法，其中野生型线粒体rRNA的改变是通过组织来源的rRNA与线粒体rRNA基因探针的杂交检测。

5.权利要求1的方法，其中野生型线粒体rRNA基因编码序列的改变是用线粒体rRNA基因编码序列的探针与从组织中分离出的DNA杂交检测。

6.权利要求5的方法，进一步包括：

将来自对耳毒性耳聋不易感个体的线粒体DNA与线粒体rRNA基因编码序列的探针进行Southern杂交；和

比较线粒体rRNA基因探针与潜在易感耳毒性耳聋个体的组织的杂交和与不易感耳毒性耳聋个体的组织的杂交。

7.权利要求5的方法，其中线粒体rRNA基因编码序列的探针检测限制片段长度多态性。

8.权利要求1的方法，其中野生型线粒体rRNA基因编码序列改变的检测是通过当分子(1)线粒体rRNA基因或从组织中分离出的线粒体rRNA，和(2)与人野生型线粒体rRNA基因编码序列互补的核酸探针相互杂交后形成双螺旋时，鉴定分子(1)和(2)间的错配来进行。

9.权利要求5的方法，其中线粒体rRNA基因编码序列的探针与主要由核苷酸648到1601或其一部分组成的线粒体rRNA核苷酸序列杂交。

10.权利要求9的方法，其中线粒体rRNA基因编码序列进一步包含旁侧调节序列。

11.权利要求1的方法，其中野生型线粒体rRNA基因编码序列的改变通过组织中线粒体rRNA基因序列的扩增和扩增的线粒体rRNA序列与核酸探针的杂交而被检出，

所述的探针包含正常或突变序列的线粒体rRNA序列。

12.权利要求1的方法，其中野生型线粒体rRNA基因编码序列的改变通过组织中线粒体rRNA基因分子克隆和克隆的线粒体rRNA基因的全部或部分的测序而检测。

13.权利要求1的方法，其中野生型线粒体rRNA基因编码序列的改变的检测出包括对缺失突变的筛查。

14.权利要求1的方法，其中野生型线粒体rRNA基因编码序列的改变的检测包括对点突变的筛查。

15.权利要求1的方法，其中野生型线粒体rRNA基因编码序列的改变的检测包括对插入突变的筛查。

16.权利要求1的方法，其中野生型线粒体rRNA基因编码序列的改变的检测包括对重排突变的筛查。

17.权利要求1的方法，其中耳毒素是一种氨基糖苷。

18.检测人类耳毒性耳聋的遗传素因的方法，包含：

检测人类组织中野生型核基因编码序列的改变或该序列的表达产物的改变，改变提示对耳毒性耳聋的易感性。

19.权利要求18的方法，其中核基因表达产物是线粒体核糖体蛋白亚基。

20.权利要求18的方法，其中核基因表达产物与耳毒素摄取或运输有关。

21.权利要求18的方法，其中核基因表达产物与耳毒素代谢有关。

22.与人类线粒体rRNA基因编码序列或该序列表达产物的改变互补的核酸探针，其中所述的改变伴有耳毒性耳聋。

23.权利要求22的核酸探针，其中所述序列的表达产物是12S rRNA。

24.权利要求22的核酸探针，其中所述的改变是1555核苷酸从腺嘌呤到鸟嘌呤的改变。

25.检测野生型线粒体rRNA基因或基因表达产物改变的试剂盒，其中所述的改变伴有耳毒性耳聋，所述的试剂盒包含被分隔的包装，在紧密限制下容纳一个或多个容器，容器中装有与所述改变互补的核酸探针。

26.权利要求24的试剂盒，其中试剂盒包含多个重叠或邻接的核酸探针。

27.权利要求25的试剂盒，其中探针能同整个线粒体rRNA基因杂交。

28.权利要求24的试剂盒，其中rRNA基因编码12SrRNA。