PT1135530E

PT1135530E - Amplificação multiplex de loci curtos de repetição em tandem

Info

Publication number: PT1135530E
Application number: PT99965030T
Authority: PT
Inventors: James W Umm; Cynthia J Her
Original assignee: Promega Corp
Priority date: 1998-11-25
Filing date: 1999-11-24
Publication date: 2012-12-18
Also published as: JP2010081944A; CN100366753C; CN1332805A; JP5711887B2; CA2352042A1; EP1135530B1; US6479235B1; WO2000031306A9; HK1036638A1; JP2002530121A; AU774626B2; AU3103400A; EP1135530A2; BR9915597A; WO2000031306A2; WO2000031306A3; ES2394070T3; JP5456950B2; CN101230394A

Description

DESCRIÇÃO "AMPLIFICAÇÃO MULTIPLEX DE LOCI CURTOS DE REPETIÇÃO EM TANDEM"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção é genericamente direccionada para a detecção de marcadores genéticos num sistema genómico. A presente invenção é mais especificamente direccionada para a amplificação simultânea de múltiplos loci genéticos polimórficos distintos utilizando a reacção de polimerase em cadeia para determinar, numa reacção, os alelos de cada locus contidos no sistema multiplex.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A tipagem de ADN é normalmente utilizada para identificar a paternidade de crianças humanas e para confirmar a linhagem de cavalos, cães, outros animais e culturas agrícolas. A tipagem de ADN é também normalmente empregue para identificar a fonte de sangue, saliva, sémen e outros tecidos encontrados em cenas de crime ou outros sítios que requerem a identificação de restos mortais humanos. A tipagem de ADN é também empregue em casos clínicos para determinar o sucesso ou insucesso de transplante de medula óssea e presença de tecidos cancerosos particulares. A tipagem de ADN envolve a análise de alelos de ADN genómico com características de interesse, normalmente referidas como "marcadores". A maior parte dos métodos de tipagem em utilização 1 hoje em dia são especificamente concebidos para detectar e analisar diferenças no comprimento e/ou sequência de uma ou mais regiões de ADN marcador conhecidas por aparecer em, pelo menos, duas formas diferentes numa população. Esta variação de comprimento e/ou sequência é referida como ''polimorfismo". Qualquer região (i. e. "locus") de ADN em que tal variação ocorre é referida como um "locus polimórfico". Os métodos e materiais da presente invenção são concebidos para utilização na detecção de múltiplos loci de ADN, sendo alguns ou todos loci polimórficos.

Os marcadores genéticos que são suficientemente polimórficos no que respeita ao comprimento ou sequência foram desde há muito pensados para utilização em aplicações de identidade, tais como testes de paternidade e identificação de amostras de tecido recolhidas para análises forenses. A descoberta e desenvolvimento destes marcadores e métodos para análise destes marcadores passaram por várias fases de desenvolvimento ao longo dos últimos anos.

As primeiras variantes de ADN marcador identificadas foram simples substituições de bases, i. e., polimorfismos de sequência simples, que foram mais frequentemente detectados por ensaios de hibridação de Southern. Para exemplos de referências que descrevem a identificação destes marcadores, concebidos para serem utilizados para analisar ADN digerido com endonucleases de restrição com sondas radioactivas, ver: Southern, E. M. (1975), J. Mol. Biol. 98(3):503-507; Schumm, et ai. (1988), American Journal of Human Genetics 42:143-1 59; e Wyman, A. e White, R. (1980) Proc. Natl. Acad. Scir U.S.A. 77:6754-6758. 2 A geração seguinte de marcadores era constituída por variantes de tamanho, i. e. polimorfismos de comprimento, especificamente marcadores de "número variável de repetições em tandem" (VNTR) (Nakamura Y., et al. (1987), Science 235: 1616-1622; e Pat. U.S. N° 4963663 de White et al. (1990); Pat. U.S. N° 5411859 continuação de 4963663 de White et al. (1995)) e marcadores "minissatélite" (Jeffreys et al. (1985a), Nature 314:67-73; Jeffreys et al. (1985b) Nature 316:76-79., Pat. U.S. N° 5175082 para uma invenção de Jeffreys). Ambos os marcadores VNTR e minissatélite, contêm regiões de seguências praticamente idênticas repetidas em forma de tandem. A seguência de repetição central é de 10 a 70 bases de comprimento, com seguências de repetição central mais curtas referidas como repetições "minissatélite" e repetições mais longas referidas como VNTR. Diferentes indivíduos numa população humana contêm diferentes números de repetições. Os marcadores VNTR são geralmente mais frequentemente polimórficos do que polimorfismos de substituição de bases, apresentando por vezes até quarenta ou mais alelos num único locus genético. Contudo, o processo aborrecido de digestão com enzimas de restrição e subsequente análise de hibridação de Southern são ainda necessárias para detectar e analisar a maior parte destes marcadores. O avanço seguinte envolveu a junção da tecnologia da reacção de polimerase em cadeia (PCR) (Pat. U.S. N° 4683202 de Mullis, K.B.) com a análise de loci VNTR (Kasai, K. et al. (1990) Journal Forensic Science 35(5):1 196-1200). Foram descobertos loci VNTR amplificáveis que podiam ser detectados sem a necessidade de transferência de Southern. Os produtos amplificados são separados através de géis de agarose ou de poliacrilamida e detectados por incorporação de radioactividade 3 durante a amplificação ou por pós-coloração com prata ou brometo de etideo. Contudo, a PCR pode ser apenas utilizada para amplificar segmentos de ADN relativamente pequenos de forma fiável, i. e., apenas amplificando de forma fiável segmentos de ADN abaixo de 3000 bases de comprimento Ponce, M & Micol, L. (1992) NAR 20 (3): 623; Decorte R, et al. (1990) ADN Cell Biol. 9(6):461-469). Consequentemente, foram desenvolvidos muito poucos VNTR amplificáveis.

Nos últimos anos, a descoberta e desenvolvimento de repetições curtas em tandem polimórficas (STR) como marcadores genéticos estimulou o progresso no desenvolvimento de mapas de ligação, a identificação e caracterização de genes de doenças, e a simplificação e precisão da tipagem de ADN. Especificamente, com a descoberta e desenvolvimento de marcadores polimórfico e contendo repetições nucleotidicas (Litt e Luty (1989) Am J. Hum Genet 3 (4):599-605,- Tautz, D (1989) NAR 17:6463-6471 ; Weber e May (1989) Am J Hum Genet 44:388-396; Pat. Alemã N° DE 3834636 C2, inventor Tautz, D; Pat. U.S. N° 5582 79 de Weber, L.), STR com unidades de repetição de três a quatro nucleótidos (Edwards, A., et al. (1991 ) Am. J. Hum. Genet. 49: 746-756.; Hammond, H.A., et al. (1994) Am. J. Hum. Genet. 55: 175- 189; Fregeau, C.J.; e Fourney, R.M. (1993) BloTechnlques 15(1 ): 100-1 19.; Schumm, J.W. et al. (1994) no The Fourth International Symposium on Human Identification 1993, pp. 177-187 (pub. por Promega Corp., 1994); e Pat. U.S. N° 5364759 de Caskey et al.; Pat. Alemã N° DE 3834636 C2 de Tautz, D.) e STR com unidades de repetição de cinco a sete bases (Ver, e. g. , Edwards et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4791 ; Chen et al. (1993) Genomics 1 5(3) : 621-5; Harada et al. (1994) Am. J. Hum. Genet. 55: 175- 189; Comings et al. (1995) , Genomics 4 29(2):390-6; e Utah Marker Development Group (1995), Am. J. Genet. 57:619-628; e Jurka e Pethiyagoda (1995) J. Mol. Evol. 40: 1 20-126)), muitas das deficiências dos métodos anteriores foram ultrapassadas. Os marcadores STR são geralmente mais curtos do que marcadores VNTR, fazendo destes melhores substratos para amplificação do que a maior parte dos marcadores VNTR.

Os loci STR são semelhantes a locus VNTR amplificáveis em que os alelos amplificados em cada um destes locus podem ser diferenciados com base na variação do comprimento. Geralmente os referidos loci STR são menos polimórficos em cada locus individual do que os loci VNTR. Deste modo, é desejável amplificar e detectar sistemas de STR múltiplos numa única reacção de amplificação e separação para proporcionar informação para vários loci simultaneamente. Os sistemas que contêm vários loci são denominados sistemas multiplexo e muitos destes sistemas que contêm até 11 loci STR separados foram descritos. Ver, e. g. , Proceedings: American Academy of Forensic Sciences (Feb. 9-14, 1998), Schumm, James W. et al., p. 53, B88; Id., Gibson, Sandra D. et al., p. 53, B89; Id., Lazaruk, Katherine et al., p. 51 , B83; Sparkes, R. et al., Int J Legal Med (1996) 109:186-194; AmoFlTR Profiler™ PCR Amplification Kit User's Manual (1997), pub de Perkin-Elmer Corp. i-viii e 1-1 a 1-10: AmoFlSTR Profiler Plus™ PCR Amplification Kit User's Manual (1997), pub de Perkin-Elmer Corp., i-viii e 1-1 a 1-10; AmpFlSTR COfiler™ PCR Amplification Kit User Bulletin (1998), pub de Perkin-Elmer Corp. i-iii e 1-1 a 1-10; 9th International Symposium on Human Identification (7-10 de Outubro de 1998), pub. de Promega Corp., Staub, Rick W. et al., Resumo de Póster 15; Id., Willard, Jeanne M. et al., Resumo de Póster 73; e Id., 5

Walsh, P. Sean, et al., Resumo da Comunicação Oral para 8:50am-9:20am, Quinta-feira, 8 de Outubro de 1998.

Os protocolos de amplificação com loci STR podem ser concebidos para produzir pequenos produtos, geralmente de 60 a 500 pares de bases (pb) de comprimento, e os alelos de cada locus estão frequentemente contidos num intervalo de menos do que 100 pb. Isto permite a análise electroforética simultânea de vários sistemas no mesmo gel ou electroforese capilar através da concepção cuidadosa de iniciadores de PCR de modo a que todos os produtos de potencial amplificação de um sistema individual não se sobreponham num intervalo de alelos de outros sistemas. A concepção destes sistemas é limitada, em parte, pela dificuldade em separar múltiplos loci num único gel ou capilar. Isto ocorre porque existe uma compressão especial dos fragmentos de diferentes tamanhos, especialmente fragmentos longos em géis ou capilares, i. e., meios normalmente utilizados para a separação de fragmentos de ADN pelos especialistas na técnica. O documento WO 97/39138 refere-se a ensaios de perfil de ADN com base na co-amplificação de um conjunto de três a oito loci STR e avaliação dos alelos amplificados na mistura para determinar os alelos presentes em cada locus. O Federal Bureau of Investigation ("FBI") dos Estados Unidos estabeleceu e mantém um Sistema Combinado de índice de ADN ("CODIS"), uma base de dados de informação de tipagem de ADN. As agências locais, estatais e nacionais de aplicação da lei utilizam o sistema CODIS para comparar evidências forenses de ADN recolhidas em cenas de crime com informação de ADN na base de dados. O CODIS e outros sistemas de dados nacionais provaram 6 ser uma ferramenta eficaz para estas agências utilizarem na resolução de crimes violentos. (Ver, e. g. Niezgoda, Stephen, na Cambridge Healthtech Institute's Second Annual Conference on ADN Forensics: Science. Evidence and Future Prospects (17-18 de Nov. de 1998), pp. 1 -21; Niezgoda, Stephen em Proceedings From The Eighth International Symposium on Human Identification 1997. pub. de Promega Corporation (1998), pp 48-49; Frazier, Rachel R.E. et al. Id., pp. 56-60; Niezgoda, S.J. Profiles in ADN 1 (3) : 1 2-1 3; Werrett, D.J. e Sparkes, R. em Resumos de Comunicações orais: 9th International Symposium on Human Identification (7-10 de Out. de 1998) pp. 5-6). Até recentemente, apenas os dados de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição ("RFLP") obtidos a partir de uma análise de loci VNTR particulares foram considerados um componente crucial na base de dados. O FBI identificou recentemente treze loci STR polimórficos para inclusão na base de dados CODIS.

Os treze loci STR CODIS são HUMCSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, HUMFIBRA, HUMTH01 , HUMTPOX e HUMvWFA31. (Budowle, Bruce e Moretti, Tamyra nos Resumos de Comunicações orais: 9th International Symposium on Human Identification (7-10 de Out. de 1998) pp. 7-8) . Os dados de ambos os marcadores VNTR e STR são actualmente mantidos na base de dados CODIS. (Ver, e. g., Niezgoda, Stephen em Second Annual Conference on ADN Forensics. supra). Até à presente invenção, o número de loci que podia ser co-amplifiçado numa única reacção e depois analisado foi limitado. Especificamente, não foram desenvolvidos materiais ou métodos para utilização em amplificação multiplex de treze ou mais loci STR, muito menos que os treze loci STR polimórficos identificados para utilização na base de dados CODIS. 7

Os materiais e métodos do presente método são concebidos para utilização em análise multiplex de loci polimórficos de ADN particular de vários tipos, incluindo ADN de cadeia simples e de cadeia dupla a partir de uma variedade de diferentes fontes. A presente invenção representa uma significativa melhoria da tecnologia existente, trazendo poder de discriminação aumentado, precisão e processamento de perfis de ADN para análise de ligação, justiça criminal, testes de paternidade e outras aplicações forenses, médicas e de identificação genética.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona métodos para a identificação simultânea dos alelos presentes num conjunto de loci a partir de uma ou mais amostras de ADN compreendendo: obtenção de, pelo menos, uma amostra de ADN a ser analisada, selecção de um conjunto de loci da amostra de ADN, compreendendo os loci de repetições em tandem curtos D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, HUMCSF1P0, HUMFIBRA, HUMTH01, HUMTPOX e HUMvWFA31 co-amplificação dos loci no conjunto numa reacção de polimerase em cadeia, em que o produto da reacção é uma mistura de alelos amplificados a partir de cada loci co-amplifiçados no conjunto; e avaliação dos alelos amplificados na mistura para determinar os alelos presentes em cada um dos loci analisados no conjunto na amostra de ADN. A presente invenção tem utilização específica no campo das análises forenses, determinação de paternidade, monitorização de transplante de medula óssea, mapeamento de ligação e detecção de doenças genéticas e cancros. Permitindo os treze métodos da presente invenção aumentar significativamente a certeza com que se pode comparar ADN preparado a partir de diferentes amostras a partir do mesmo indivíduo. A necessidade de fazer coincidir ou distinguir precisamente as amostras que contêm quantidades muito pequenas de ADN é particularmente aguda em aplicações forenses, em que muitas condenações (e absolvições) se alteraram com a análise de tipagem de ADN.

Os cientistas, particularmente os cientistas forenses, entenderam desde logo a necessidade de analisar múltiplos loci de ADN polimórficos de modo a assegurar que uma coincidência entre duas amostras de ADN é estatisticamente significativa (Presley, L. A. et al., em The Third International Symposium on Human Identification 1992. pp. 245-269 (pub. De Promega Corp., 1993); Bever, R. A., et al., em The Second International Symposium on Human Identification 1991. pp. 103-128. (pub. de Promega Corp., 1992)). Contudo, até esta invenção, podia apenas analisar-se simultaneamente treze ou mais loci STR numa única reacção. Para compreender a importância destas capacidades de multiplexar, ajuda compreender alguma da matemática para lá da análise de tipagem de ADN. 9

Para propósitos de ilustração, supõe-se que todos os locus STR têm uma frequência de genótipo (i. e., padrão de dois alelos) de um em dez. por outras palavras, supõe-se que a probabilidade de dois indivíduos seleccionados ao acaso possuírem um tipo coincidente para um único STR é 1/10. Contudo, se dois diferentes loci STR forem analisados, a probabilidade de uma coincidência aleatória com ambos os sistemas é 1/100. Se forem analisados três loci STR, as probabilidades de uma coincidência aleatória com cada um dos três sistemas é 1/1000 e assim sucessivamente. Consequentemente, é fácil verificar como o aumento do número de loci STR analisados reduz a probabilidade de coincidências aleatórias na população geral, aumentando deste modo a probabilidade de poder identificar com precisão a presença de um suspeito numa cena de crime comparando a tipagem do indivíduo com provas da cena de crime. Argumento semelhante pode ser utilizado para concluir que o método desta invenção também aumenta a probabilidade de identificar com precisão um suposto pai num caso de paternidade, de fazer coincidir correctamente o tecido de medula óssea, de desenvolver resultados significativos a partir dos estudos de mapeamento de ligação e de detectar doenças genéticas e cancros.

Outras vantagens da invenção serão óbvias a partir da seguinte descrição detalhada da invenção e das figuras ilustrativas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 A é um gráfico do resultado da detecção de três cores fluorescentes dos produtos de amplificação simultânea dos 10 loci D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, HUMCSF1PO, HUMFIBRA, HUMTH01, HUMTPOX e HUMvWFA31 de uma amostra de ADN genómico humano, conforme detectado com o ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer no Exemplo 1. A Figura 1B é um gráfico do resultado da detecção de três cores fluorescentes de uma amostra de controlo processado da mesma forma da Figura IA, sem ADN genómico na reacção de amplificação. A Figura 2A é um gráfico do resultado da detecção de três cores fluorescentes dos produtos de amplificação simultânea dos loci D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, HUMCSF1PO, HUMFIBRA, HUMTH01, HUMTPOX, HUMvWFA31, G475, S159 e Amelogenina de uma amostra de ADN genómico humano, conforme detectado com o ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer no Exemplo 2. A Figura 2B é um gráfico do resultado da detecção de três cores fluorescentes de uma amostra de controlo processada da mesma forma da Figura 2A, sem ADN genómico substrato na reacção de amplificação. A Figura 3A é um gráfico do resultado da detecção de três cores fluorescentes dos produtos de amplificação simultânea dos loci D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, HUMCSF1PO, HUMFIBRA, HUMTH01, HUMTPOX, HUMvWFA31, G475, S159 e Amelogenina de uma amostra de ADN genómico humano, conforme detectado com um ABI PRISM® 377 ADN Sequencer no Exemplo 3. 11 A Figura 3B é um gráfico do resultado da detecção de três cores fluorescentes de uma amostra de controlo processada da mesma forma da Figura 3A, sen ADN genómico substrato na reacção de amplificação.

As Figuras 4A e 4B são imagens impressas a laser dos resultados da detecção dos produtos fluorescentes de amplificação simultânea dos locus D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, HUMCSF1P0, HUMFIBRA, HUMTH01, HUMTPOX, HUMvWFA31, G475, S159 e Amelogenina conforme detectado utilizando o canal de fluoresceína (Figura 4A) e canal da carboxi-tetrametilrrodamina (Figura 4B) de um Hitachi FMBIO® II Fluorescent Scanner, como descrito no Exemplo 4.

As Figuras 5A e 5B são imagens impressas a laser dos resultados da detecção dos produtos fluorescentes de amplificação simultânea dos locus D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, HUMCSF1 PO, HUMFIBRA, HUMTH01, HUMTPOX, HUMvWFA31, G475, S159 e Amelogenina conforme detectado utilizando o canal de fluoresceína (Figura 5A) e canal da carboxi-tetrametilrrodamina (Figura 5B) de um Hitachi FMBIO® II Fluorescent Scanner, como descrito no Exemplo 5.

As Figura 6A e 6B são imagens impressas a laser dos resultados da detecção dos produtos fluorescentes da amplificação simultânea dos locus D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, HUMCSF1P0, HUMFIBRA, HUMTH01, HUMTPOX, HUMvWFA31, C221, S159 e Amelogenina conforme detectado utilizando o canal de fluoresceína (Figura 6A) e canal da carboxi-tetrametilrrodamina (Figura 6B) de um Hitachi FMBIO® II Fluorescent Scanner, como descrito no Exemplo 6. 12

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A. Definições

As seguintes definições pretendem ajudar a proporcionar uma compreensão clara e consistente do âmbito e detalhe dos termos que se seguem, como utilizados para descrever e definir a presente invenção: "Escala alélica": um marcador de tamanho padrão que consiste em alelos amplificados a partir do locus. "Alelo": uma variação genética associada com um segmento de ADN, i. e., uma de duas ou mais formas alternativas de uma sequência de ADN que ocupa o mesmo locus. "Nomenclatura bioquímica": a nomenclatura bioquímica padrão é aqui utilizada, na qual as bases nucleotídicas são designadas como adenina (A) ; timina (T) ; guanina (G) ; e citosina (C) . Os nucleótidos correspondentes são, por exemplo, desoxiguanosina-5'-trifosfato (dGTP). "Polimorfismo de ADN": a condição na qual duas ou mais sequências de nucleótidos diferentes numa sequência de ADN coexistem na mesma população de cruzamento. "Locus" ou "locus genético": uma posição específica num cromossoma. Os alelos de um locus são localizados em sitios idênticos em cromossomas homólogos. 13 "Iniciador especifico para o locus": um iniciador que híbrida especificamente com uma porção do locus referido ou a sua cadeia complementar, pelo menos, para um alelo do locus e não híbrida eficientemente com outras sequências de ADN nas condições utilizadas no método de amplificação. "Repetição em tandem de pentanucleótido": uma subclasse dos polimorfismos de STR definidos abaixo. Salvo especificação em contrário, o termo "repetição em tandem de pentanucleótido" compreende STR perfeitos, em que a unidade de repetição é uma sequência de cinco bases e STR imperfeitos em que, pelo menos, uma unidade de repetição é uma repetição de cinco bases. "Reacção em cadeia pela polimerase" ou "PCR": uma técnica em que são utilizados ciclos de desnaturação, emparelhamento com o iniciador e extensão com polimerase de ADN para amplificar o número de cópias de uma sequência de ADN alvo em aproximadamente 106 vezes ou mais. 0 processo da reacção em cadeia pela polimerase para amplificar ácido nucleico está coberto pela Patente U. S. N° . 4683195 e 4683202, que são aqui incorporadas por referência para uma descrição do processo. "Loci de repetições em tandem curtas polimórficas": Loci STR, definidos abaixo, em que o número de elementos de sequência repetitiva (e comprimento global da sequência) numa região particular de ADN qenómico varia de alelo para alelo, e de indivíduo para indivíduo. "Conteúdo de informação de polimorfismo" ou "PIC": uma medida da quantidade de polimorfismo presente num locus 14 (Botstein et al., 1980). Os valores de PIC variam desde 0 a 1,0, com os valores mais elevados indicando graus de polimorfismo mais elevados. Esta medida apresenta geralmente valores mais pequenos do que a outra medida normalmente utilizada, i. e., a heterozigosidade. Para os marcadores que são altamente informativos (com heterozigosidades que ultrapassam cerca de 70%), a diferença entre heterozigosidade e PIC é ligeira. "Iniciador": um oligonucleótido de cadeia simples ou fragmento de ADN que híbrida com uma cadeia de ADN de um locus de tal modo que o terminal 3' do iniciador pode actuar como um sítio de polimerização utilizando uma enzima polimerase de ADN. "Par de iniciadores": dois iniciadores incluindo, o iniciador 1 que híbrida com uma cadeia simples numa extremidade da sequência de ADN a ser amplificada e o iniciador 2 que híbrida com a outra extremidade na cadeia complementar da sequência de ADN a ser amplificada. "Sítio do iniciador": a área do ADN alvo com a qual um iniciador híbrida. "Loci de repetições em tandem curtos" ou "Loci STR": regiões de ADN genómico que contêm elementos de sequência curtos, repetitivos de 3 a 7 pares de bases de comprimento. O termo STR também engloba um região de ADN genómico em que mais do que uma sequência simples de três a sete bases é repetida em tandem ou com bases intervenientes, desde que, pelo menos, uma das sequências seja repetida, pelo menos, duas vezes em tandem. Cada sequência repetida, pelo menos, uma vez numa STR é aqui referida como uma "unidade de repetição". 15

As sequências dos loci STR podem ser divididas em duas categorias gerais, perfeitas e imperfeitas. 0 termo STR "perfeita", como aqui utilizado, refere-se a uma região de ADN de cadeia dupla que contém uma unidade de repetição simples de três a sete bases repetida em tandem, pelo menos, duas vezes, e. g. (AAAAT) 2 · 0 termo STR "imperfeito", como aqui utilizado, refere-se a uma região de ADN que contém, pelo menos, duas repetições em tandem de uma unidade de repetição perfeita e, pelo menos, uma repetição de uma unidade de repetição imperfeita, em que a unidade de repetição imperfeita consiste numa sequência de ADN que pode resultar de uma, duas, três ou quatro inserções, deleções ou substituições de bases na sequência da unidade de repetição perfeita, e. g. (AAAAT) i2 (AAAAAT) 5AAT (AAATT) 4. Cada sequência de STR imperfeita contém, pelo menos, uma sequência de STR perfeita.

Especificamente, cada sequência de STR, seja perfeita ou imperfeita inclui, pelo menos, uma unidade de sequência de repetição que surge, pelo menos, duas vezes em tandem, uma sequência de unidade de repetição que pode ser representada pela fórmula (I): (AwGxTyCz)n (I) em que A, G, T e C representam os nucleótidos que podem estar em qualquer ordem; w, x, y e z representam o número de cada nucleótido na sequência e variam desde 0 a 7 com a soma de w + x + y + z a variar entre 3 e 7; e n representa o número de vezes que a sequência é repetida em tandem e é, pelo menos, 2. 0 conjunto de loci analisados de acordo com a presente invenção inclui todos os treze loci CODIS, i. e D3S1358, 16 D5S818 D7S820, D8S1179, D13S317 D16S539, D18S51, D21S11 HUMCSF1P0, HUMFIBRA, HUMTH01, HUMTPOX e HUMvWFA31.

Pelo menos, um dos loci seleccionados para co-amplificação na presente reacção de multiplex é, de um modo preferido, um locus STR com uma unidade de repetição de cinco a sete bases ou pares de bases de comprimento, de um modo mais preferido, um locus STR com uma repetição de pentanucleótido. Como é demonstrado no Pedido de Patente U.S. com o número de Série 09/018584, que é aqui incorporado por referência, loci com tais repetições de comprimento intermédio podem ser amplificados com uma incidência minima de artefactos, e. g., devido a deslizamento da repetição. Três desses loci com repetições de pentanucleótidos, G475, C221 e S159, são incluídos nos conjuntos de loci identificados imediatamente acima. Os termos "G475", "C221", e "S159", como aqui utilizados, referem-se aos nomes atribuídos aos loci de repetição de pentanucleótidos identificados, como descrito no Pedido de Patente U.S. com o N° de Série 09/018584, incorporado por referência acima. Cada nome corresponde a um clone a partir do qual cada locus de pentanucleótido foi identificado. A sequência do clone G475, aí descrito como SEQ ID N° : 34, é aqui identificado como

SEQ ID N° : 108. A sequência do clone C221, aí descrito como SEQ ID N°: 2, é aqui identificada como SEQ ID N°: 109. A sequência do clone S159, aí descrita como SEQ ID N°: 26, é aqui identificada como SEQ ID N° : 110. Os iniciadores individuais e os pares de iniciadores identificados para utilização na amplificação de G475, C221 e S159 aí também podem ser utilizados para amplificar os mesmos loci nos conjuntos de, pelo menos, treze loci co-amplifiçados e analisados de acordo com a presente invenção. 17 0 conjunto de loci seleccionados para co-amplificação e análise de acordo com a invenção compreende ainda, de um modo preferido, pelo menos, um locus adicionalmente a, pelo menos, treze loci STR. 0 locus adicional inclui, de um modo preferido, um polimorfismo na sequência, ou outra caracteristica que identifica uma caracteristica particular que separa o ADN de um indivíduo do ADN de outros indivíduos na população. 0 locus adicional, de um modo mais preferido, é um locus que identifica o género da fonte da amostra de ADN analisado. Quando a amostra de ADN é ADN genómico humano, um locus de identificação do género, tal como o locus de Amelogenina é seleccionado, de um modo preferido, para co-amplificação e análise de acordo com o presente método. 0 locus da Amelogenina é identificado por GenBank como HUMAMELY (quando utilizado para identificar um locus no cromossoma Y contido no ADN de macho) ou como HUMAMELX (quando utilizada para identificar um locus no cromossoma X em ADN de machos ou fêmeas) . Quando o locus da Amelogenina é co-amplificado na mesma reacção de amplificação em multiplex como o conjunto de, pelo menos, treze loci de repetição curta em tandem, a sequência de, pelo menos, um dos iniciadores utilizado para amplificar este locus particular da reacção de amplificação por multiplex possui, de um modo preferido, uma sequência seleccionada de: SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 105, e SEQ ID N°: 87. D. Selecçao de iniciadores

Uma vez identificado um conjunto de loci para co-amplificação numa reacção de multiplex única, podem determinar-se iniciadores adequados para co-amplificar cada locus no conjunto. Deve ser tido cuidado na selecção da 18 sequência de iniciadores utilizada na reacção de multiplex. A selecção inapropriada de iniciadores pode produzir vários efeitos indesejáveis, tais como falha de amplificação, amplificação em múltiplos sítios, formação de dímeros de iniciadores, interacção indesejável de sequências de iniciadores a partir de diferentes loci, produção de alelos a partir de um locus que se sobrepõe com alelos de outro ou a necessidade de condições de amplificação ou protocolos para os diferentes loci que são incompatíveis num multiplex. Os iniciadores utilizados no presente método ou incluídos nos presentes kits da invenção são seleccionados, de um modo preferido, de acordo com o seguinte processo de selecção.

Os iniciadores são desenvolvidos e seleccionados, de um modo preferido, para utilização nos sistemas de multiplex da invenção empregando um processo re-iterativo de selecção de sequências de iniciador, misturar os iniciadores para co-amplificação dos loci seleccionados, co-amplificação dos loci, depois separação e detecção dos produtos amplificados. Inicialmente, este processo produz frequentemente os alelos amplificados de uma forma desequilibrada (i. e., rendimento de produto superior para alguns loci do que para outros) e podem também criar produtos de amplificação que não representam eles próprios os alelos. Estes fragmentos extra podem resultar de qualquer número de causas descritas acima. um ou ambos os

Para eliminar esses fragmentos extra dos sistemas de multiplex, são utilizados iniciadores individuais do conjunto total com iniciadores a partir do mesmo ou de outros loci para identificar que iniciadores contribuem para a amplificação dos fragmentos extra. Assim que dois iniciadores que geram um ou mais dos fragmentos são identificados, 19 contribuidores são modificados e retestados, seja num par isoladamente ou no sistema de multiplex (ou um subconjunto do sistema multiplex). Este processo é repetido até a avaliação dos produtos produzir alelos amplificados sem fragmentos extra ou com um nível aceitável no sistema multiplex.

Ocasionalmente, os fragmentos extra podem ser eliminados através da marcação do iniciador oposto num par de iniciadores. Esta alteração revela os produtos do iniciador oposto no passo de detecção. Este iniciador marcado de novo pode amplificar os verdadeiros alelos com maior fidelidade do que o iniciador previamente marcado criando os verdadeiros alelos como uma proporção maior do produto de amplificação total. A determinação da concentração do iniciador pode ser realizada antes ou após a selecção das sequências de iniciador final, mas é realizada, de um modo preferido, após essa selecção. De um modo geral, aumentar a concentração do iniciador para qualquer locus particular aumenta a quantidade de produto criado para esse locus. Contudo, este é também um processo re-iterativo porque aumentar o rendimento para um locus pode diminuir o rendimento para um ou mais loci diferentes. Além disso, os iniciadores podem interagir directamente afectando o rendimento dos outros loci. Aumentos lineares na concentração do iniciador não produzem necessariamente aumentos lineares no rendimento do produto para o locus correspondente. 0 equilíbrio de locus para locus é também afectado por um número de parâmetros do protocolo de amplificação, tal como a quantidade de molde utilizado, o número de ciclos de amplificação, a temperatura de emparelhamento do protocolo de ciclagem térmica e a inclusão ou exclusão de um passo de 20 extensão extra no final do processo de ciclagem. Um equilíbrio absoluto ao longo de todos os alelos e loci não é geralmente alcançado. 0 processo de desenvolvimento de sistema multiplex pode também ser um processo re-iterativo noutro sentido, descrito acima. Isto é, é possível, primeiro, desenvolver um sistema de multiplex para um número pequeno de loci, estando este sistema isento ou quase isento de fragmentos extra da amplificação. Os iniciadores deste sistema podem ser combinados com iniciadores para um ou mais loci adicionais. Esta combinação de iniciador expandido pode produzir ou não fragmentos extra da amplificação. Por sua vez, os novos iniciadores podem ser introduzidos e avaliados.

Um ou mais dos processos de selecção re-iterativos descritos acima são repetidos até ser identificado um conjunto completo de iniciadores que podem ser utilizados para co-amplificar os, pelo menos, treze loci seleccionados para co-amplificação como descrito acima. É entendido que muitos conjuntos diferentes de iniciadores podem ser desenvolvidos para amplificar um conjunto de loci particulares. A síntese dos iniciadores utilizados no presente método pode ser conduzida utilizando qualquer porcesso convencional para a síntese de oligonucleótidos conhecidos dos especialistas na técnica. Pelo menos, um iniciador para cada locus é, de um modo preferido, ligado covalentemente a um marcador corante, como descrito na Secção F, abaixo. A Tabela 1, abaixo, proporciona uma lista de sequências de iniciadores que foram determinados como sendo adequados para 21 utilização na amplificação dos loci STR polimórficos correspondentes ai listados. Pelo menos, um iniciador listado na Tabela 1 é, de um modo preferido, utilizado para amplificar, pelo menos, um dos locus seleccionados para co-amplificação e análise como descrito acima. É entendido que podem ser identificados outros iniciadores que são adequados para a amplificação simultânea dos loci listados abaixo. TABELA 1

Locus Iniciador SEQ ID N°: D7S820 1, 2, 80 e 81 D13S317 3, 4, 82 e 83 D5S818 5, 6, 84 e 85 D3S1539 7, 8 e 49 D17S1298 9 e 10 D20S481 11, 12, 52 e 53 D9S930 13, 14, 55 e 61 D10S1239 15, 16 e 54 D14S118 17 e 18 D14S562 19 e 20 D14S548 21 e 22 D16S490 23 e 24 Dl6 S 753 25 e 26 D17S1299 27 e 28 D16S539 29, 30, 58, 79 e 97 D22S683 31 e 32 HUMCSF1P0 33, 34, 77, 78 e 98 HUMTPOX 35, 36, 72 e 73 22 (continuação)

Locus Iniciador SEQ ID N°: HUMTH01 37, 38, 66, 67 e 103 HUMvWF A31 39, 40, 59, 60 e 76 HUMF13A01 41 e 42 HUMFESFPS 43 e 44 HUMBFXIII 45 e 46 HUMLIPOL 47 e 48 D19S253 50 e 51 D4S2368 56 e 5 7 D18S51 62, 63, 101 e 102 Locus Iniciador SEQ ID N°: D21S11 6 4 e 65 D3S1538 68, 69 e 106 HUMFIBRA 70, 71 e 107 D8S1179 74, 75 e 104 G475 88, 89 e 94 S15 9 90, 91, 92, 93, 95 e 96 C221 99 e 100

E. Preparaçao de amostras de ADN

Podem ser preparadas amostras de ADN genómico para utilização no método desta invenção utilizando qualquer método de preparação de ADN que seja compatível com a amplificação de ADN. Muitos desses métodos são conhecidos dos especialistas na técnica. Exemplos incluem, mas não estão limitados à purificação de ADN através de extracção com fenol (Sambrook, J., et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição,

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova 23

Iorque., pp. 9.14-9.19), e purificação parcial através de precipitação salina (Miller, S. et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:1 215) ou chelex (Walsh et al., (1991) BioTechniques 10:506-513, Comey, et al., (1994) Forensic Sei. 39:1254) e a libertação de material não purificado utilizando sangue não tratado (Burckhardt, J. (1994) PCR Methods and Applications 3:239-243, McCabe, Edward R.B., (1991) PCR Methods and Applications 1: 99-106, Nordvag, Bjorn-Yngvar (1992) BioTechniques 12:4 pp. 490-492).

Quando a, pelo menos uma, amostra de ADN, a ser analisada utilizando o método desta invenção é ADN genómico humano, o ADN é, de um modo preferido, preparado a partir de tecido, seleccionado do grupo consistindo de amostras de sangue, sémen, células vaginais, cabelo, saliva, urina, osso, amostras bocais, fluido amniótico que contêm células da placenta ou células fetais, vilosidades coriónicas e misturas de qualquer um dos tecidos listados acima.

Opcionalmente, as concentrações de ADN podem ser medidas antes da utilização no método da presente invenção, utilizando qualquer método convencional de quantificação de ADN conhecido dos especialistas na técnica. Nesses casos, a concentração de ADN é, de um modo preferido, determinada por medição espectrofotométrica, como descrito por Sambrook, J., et al. (1989), supra, Apêndice E.5 ou fluorometricamente utilizando uma técnica de medição, tal como a descrita por Brunk C. F., et al. (1979), Anal Biochem 92: 497-500. A concentração de ADN é, de um modo mais preferido, medida por comparação da quantidade de hibridação de padrões de ADN com uma sonda especifica para humanos, tal como a descrita por Waye, J.S., et al. (1991) "Sensitive and specific quantification of human genomic 24

deoxyribonucleic acid (ADN) in forensic Science specimens: casework examples," J. Forensic Sei., 36:1 1198-1203. A utilização de demasiado ADN molde nas reacções de amplificação pode produzir artefactos que surgem como bandas extra que não representam verdadeiros alelos.

F. Amplificação de ADN

Assim que uma amostra de ADN genómico é preparada, os loci alvo são co-amplifiçados no passo de amplificação de multiplex utilizando a reacção de polimerase em cadeia (PCR) (Saiki, R. K., et ai. (1985), Science 230: 1350-1354). A amostra de ADN é submetida a amplificação por PCR utilizando pares de iniciadores específicos para cada locus no conjunto. É feita referência à Listagem de Sequências no final desta descrição para detalhes das sequências dos iniciadores utilizados nos Exemplos abaixo, algumas dessas sequências são formas de realização alternativa desta invenção.

Pelo menos, um iniciador para cada locus é, de um modo preferido, ligada covalentemente a um marcador corante, de um modo mais preferido, um marcador corante de fluorescência. Os iniciadores e corantes ligados a estes são, de um modo preferido, seleccionados para a reacção de amplificação em multiplex, de modo a que os alelos amplificados utilizando iniciadores para cada locus marcados com uma cor não se sobreponham aos alelos dos outros loci no conjunto co-amplifiçado aí, utilizando iniciadores marcados com a mesma cor, quando os alelos são separados, de um modo preferido, através de electroforese em gel ou capilar. 25

Numa forma de realização particularmente preferida do método da presente invenção, pelo menos, um iniciador para cada locus co-amplifiçado na reacção de multiplex é marcado com um marcador fluorescente antes da utilização na reacção. Marcadores fluorescentes adequados para ligação aos iniciadores para utilização na presente invenção estão disponíveis comercialmente. Ver, e. g., marcadores de fluoresceína e carboxi-tetrametil-rodamina e seus derivados químicos em PE Biosystems and Molecular Probes. De um modo muito preferido, pelo menos, são utilizados, pelo menos, três marcadores diferentes para marcar os iniciadores diferentes utilizados na reacção de amplificação em multiplex. Quando é incluído um marcador de tamanho para avaliar a reacção de multiplex, os iniciadores utilizados para preparar o marcador de tamanho são, de um modo preferido, marcados com um marcador diferente dos iniciadores utilizados para amplificar os loci de interesse na reacção.

Os detalhes do protocolo de amplificação mais preferido para cada uma das combinações mais preferidas de loci para utilização no método desta invenção são apresentados nos Exemplos abaixo. Também é feita referência aos Exemplos para detalhes adicionais do processo específico relacionado com cada multiplex. As sequências dos iniciadores específicos para o locus utilizadas nos Exemplos incluem um número de nucleótidos que nas condições utilizadas na hibridação, são suficientes para hibridar com um alelo do locus a ser amplificado e para ser essencialmente isento da amplificação de alelos de outros loci. E feita referência à Patente U.S. 5192659 atribuída a Simons, cujo ensinamento é aqui incorporado por referência para uma descrição mais detalhada dos iniciadores específicos para o locus. 26

G. Separação e Detecção de Fragmentos de ADN

Assim que é produzido um conjunto de alelos amplificados a partir do passo de amplificação em multiplex do presente método, os alelos amplificados são avaliados. 0 passo de avaliação deste método pode ser realizado através de qualquer um de vários meios diferentes, sendo os mais preferidos descritos abaixo. A electroforese é, de um modo preferido, utilizada para separar os produtos da reacção de amplificação em multiplex, de um modo mais preferido, electroforese capilar (ver, e. g., Buel, Eric et al. (1998), Journal of Forensic Sciences; 43: (1) pp. 164-170) ou electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (ver, e. g., Sambrook, J. et al. (1989) In Molecular Cloning — A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 13.45-13.57). Os processos da preparação do gel e de electroforese e condições para utilização adequadas no passo de avaliação do método desta invenção são ilustrados nos Exemplos, abaixo. A separação de fragmentos de ADN num gel de poliacrilamida desnaturante e em electroforese capilar ocorre com base principalmente no tamanho do fragmento.

Assim que os alelos amplificados são separados, os alelos e qualquer outro ADN no gel ou capilar (e. g., marcadores de tamanho de ADN ou uma escala alélica) podem ser então visualizados e analisados. A visualização do ADN no gel pode ser realizada utilizando qualquer uma de várias da técnica anterior, incluindo coloração com prata ou repórteres, tais como radioisótopos, agentes de fluorescência, agentes quimioluminescentes e enzimas em combinação com substratos 27 detectáveis. Contudo, o método preferido para detecção de multiplexes contendo treze ou mais loci é a fluorescência (ver, e. g. , Schumm, J. W. et ai. em Proceedings from the Eighth International Symposium on Human Identification, (pub. 1998 por Promega Corporation), pp. 78-84; Buel, Eric et al. (1998), supra.), em que os iniciadores para cada locus na reacção de multiplexagem são seguidos por detecção dos produtos que empregam um detector fluorométrico. As referências citadas acima, que descrevem métodos na técnica anterior de visualização de alelos, são aqui incorporadas por referência.

Os alelos presentes na amostra de ADN são, de um modo preferido, determinados por comparação com um padrão de tamanho tal como um marcador de ADN ou uma escala alélica específica para o locus para determinar os alelos presentes em cada locus na amostra. 0 marcador de tamanho mais preferido para avaliação de uma amplificação multiplex contendo dois ou mais STR de loci polimórfico consiste numa combinação de escalas alélicas para cada um dos loci a serem avaliados. Ver, e. g., Puers, Christoph et al., (1993) Am J. Hum Genet. 53:953-958, Puers, Christoph, et al. (1994) Genomics 23:260-264. Ver também, Pat. U.S. N° 5599666; 5674686; e 5783406 para descrições de escalas alélicas adequadas para utilização na detecção de loci STR e métodos de construção de escalas aqui reveladas.

Após a construção de escalas alélicas para loci individuais, estas podem ser misturadas e aplicadas em gel de electroforese ao mesmo tempo que ocorre a aplicação das amostras amplificadas. Cada escala alélica co-migra com alelos na amostra a partir do locus correspondente. 28

Os produtos das reacções de multiplex da presente invenção podem ser avaliados utilizando uma pista de padrão interno, um tipo especializado de marcador de tamanho configurado para correr na mesma pista de um gel de poliacrilamida gel ou no mesmo capilar. A pista interna padrão, de um modo preferido, consiste numa série de fragmentos de comprimento conhecido. 0 padrão da pista interna, de um modo mais preferido, é marcado com um corante fluorescente que se distingue de outros corantes na reacção de amplificação.

Após a construção do padrão da pista interno, este padrão pode ser também misturado com amostra amplificada ou escalas alélicas e aplicado para electroforese para comparação de migração em diferentes pistas de electroforese em gel ou diferentes capilares de electroforese capilar. Variação na migração do padrão de pista interno indica variação no desempenho do meio de separação. A quantificação desta diferença e correlação com as escalas alélicas permite a correcção na determinação de alelos nas amostras desconhecidas. H. Técnica de Detecçao Preferida: Detecção Fluorescente

Numa das formas de realização mais preferidas do método desta invenção, é utilizada detecção fluorescente para avaliar os alelos amplificados na mistura produzida pela reacção de amplificação em multiplex. Abaixo apresenta-se um breve sumário sobre o modo como esse método de detecção é praticada de um modo preferido.

Com o advento de imagiologia fluorescente automatizada, pode ser alcançada uma detecção e análise de produtos de amplificaçao 29 multiplex mais rápida. Para análise fluorescente, um iniciador fluorescente marcado pode ser incluído na amplificação de cada locus. Os iniciadores fluorescentes marcados, de um modo preferido, adequado para utilização na presente invenção incluem os iniciadores marcados com fluoresceína (FL-) , marcados com carboxi-tetrametil-rodamina (TMR-) , e marcados com 5,6-carboxi-rodamina 6G (R6G), tal como são ilustrados nos Exemplos, abaixo. A separação dos fragmentos amplificados produzidos utilizando esses iniciadores marcados é alcançada, de um modo preferido, através de electroforese em placa de gel ou electroforese capilar. Os fragmentos separados resultantes podem ser analisados utilizando equipamento de detecção de fluorescência tal como um ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer, um ABI PRISM® 377 ADN Sequencer (Applied Biosistemas Division, Perkin Elmer, Foster City, CA) , ou um Hitachi FMBIO® II Fluorescent Scanner (Hitachi Software Engineering America, Ltd. South San Francisco, CA) .

Em resumo, o método desta invenção é, de um modo muito preferido, praticado utilizando detecção fluorescente como o passo de detecção. Neste método de detecção preferido, um ou ambos de cada par de iniciadores utilizados na reacção de amplificação em multiplex possui um marcador fluorescente ligado a este e, como resultado, os alelos amplificados produzidos pela reacção de amplificação são marcados com fluorescência. Nesta forma de realização muito preferida da invenção, os alelos amplificados são subsequentemente separados por electroforese capilar e os alelos separados são visualizados e analisados utilizando um analisador de imagem fluorescente. A detecção fluorescente é preferida em relação aos métodos radioactivos de marcação e detecção, porque não requer a 30 utilização de materiais radioactivos e todos os problemas de regulação e segurança que acompanham a utilização desses materiais. A detecção fluorescente que emprega iniciadores marcados é também preferida em relação a outros métodos não radioactivos de detecção, tal como coloração de prata, porque os métodos fluorescentes de detecção revelam geralmente menos artefactos de amplificação do que coloração com prata. 0 número mais pequeno de artefactos é devido, em parte, ao facto de serem apenas detectadas cadeias de ADN amplificado com marcadores ligados na detecção fluorescente, embora ambas as cadeias de cada alelo amplificado de ADN produzido a partir da reacção de amplificação em multiplex sejam coradas e detectadas utilizando o método de detecção por coloração com prata.

EXEMPLOS

Os Exemplos seguintes são apresentados para ilustrar as vantagens da presente invenção e para assistir um especialista na técnica da sua produção e utilização. Os Exemplos pretendem ser ilustrativos, e não pretendem, de modo algum, limitar de outra forma o âmbito das reivindicações ou protecção atribuída pela patente.

As amostras de ADN genómico humano ensaiadas no Exemplo abaixo foram preparadas a partir de sangue ou células de cultura de tecidos, utilizando um processo convencional descrito por Miller e Dykes em (Miller, S. et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 1215). Os métodos de isolamento e quantificação aí descritos são 31 geralmente conhecidos dos especialistas na técnica e sao preferidos, mas não necessários, para aplicação da invenção.

Cada Exemplo abaixo é um exemplo da utilização do método desta invenção, para determinar simultaneamente os alelos presentes em, pelo menos, treze loci a partir de uma ou mais amostras de ADN de ADN genómico humano. Cada conjunto de loci co-amplifiçado abaixo inclui os treze loci repetidos em tandem curtos identificados para utilização no sistema CODIS (i. e., D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 e HUMCSF1P0). Alguns conjuntos de loci co-amplifiçados abaixo também incluem um ou mais loci de repetição em tandem curtos adicionais, tais como loci com repetições de pentanucleótidos (e. g., G475, S159 ou C221), e um locus não STR, Amelogenina. A Tabela 2 resume qual o conjunto de loci que foi co-amplifiçado na reacção de amplificação em multiplex descrito em cada Exemplo abaixo. A tabela também indica qual o par de iniciadores que foi utilizado para amplificar cada um desses locus em cada uma dessas reacções multiplex. Um iniciador de cada par de iniciadores listado na Tabela 2 foi marcado fluorescentemente antes de ser utilizado na reacçao de amplificação em multiplex Em alguns casos, foi utilizado um marcador diferente para marcar iniciadores para diferentes loci, de modo a que os alelos produzidos utilizando os diferentes iniciadores podem ser distinguidos de um outro quando detectados com um dispositivo de detecção fluorescente activada por laser.

Três diferentes marcadores fluorescentes foram utilizados nos Exemplos a seguir, descrito como "FL" para indicar marcados com fluoresceina, "TMR" para indicar marcados com carboxi- 32 tetrametil-rodamina, e "R6G" para indicar 5,6-carboxirrodamina 6G na Tabela 2, a seguir. A Tabela 2 também indica que o iniciador de cada par de iniciadores utilizados na reacção de amplificação em multiplex foi deste modo marcado em cada Exemplo (e. g., "FL-69" significa o iniciador com SEQ ID N°: 69 foi marcado na sua extremidade 5' com fluoresceina antes de ser utilizado numa reacção de amplificação multiplex). No texto de cada um dos Exemplos, contudo, a abreviatura da marca é colocada imediatamente antes da SEQ ID N° do iniciador marcado utilizado na reacção de amplificação aqui descrita (e. g., "FL-SEQ ID N0:2” em vez de "FL-2") . TABELA 2

Loci Amplificados Par de Iniciadores: SEQ ID Na utilizados Marcador(es) Fluorescentes Utilizadas | D3S1398 68,69 FL-69 1 HUMTHOI FL-66 021S11 mm FL-66 0188S1 62,83 FL-82 HUMVWFAS1 78,40 T&5R-4G D8S117Ô 74,75 TMR-7S HUMTPOX 72,73 TtóB-73 HOMFiBSA 70,7! TMR-70 S D5S818 84,85 R8&86 I 0138317 82,83 I & t [ nmm | /&&&&? D16SS39 29,79 I II6G-79 j humcsfipo 77,78 I R6G'78 33 ™Ί Exemplo 1 Loci Amplificados L ............... .....................Ϊ Par de Iniciadores: SEQ ID N2 utilizados Marcador(es) Fluorescentes Utilizadas 2,3 B3S13$8 ! ee,ea 71,-63 WMTH01 86,87 Fi-86 1 D21S11 mm FL-65 OliSil «2,63 FL-m. 1 S47I 88,89 MS Amelogenina se,»? TMR'86 HUIWWA31 78,40 TMR-40 D8S117B 74,78 TMR-78 HUMTOX j 72,73 TMR-73 HUMFtBftA 70,71 tMR-70 osssia 84,85: R8G-8S ! 0138317 82,83 B60-83 078820 80,81 R80-B0 0183638 20,7» R8G-73 nyycsFiPo 77,78 R6G-78 sus 80,81 R60-01 | 4· 0381368 63,69 61*69 HUMTH01 eaj7 FL-86 021SI1 MM R-66 D18SS1 62,83 Ft-62 0475 88,68 FL-88 Amelogenina 88,87 TMR-86 BUMvWFASI 78,40 TWtR-40 0831179 74,75 TMft*75 HUMTPOX 72,73' TMft»73 HimnmA 70,71 ti Λ £S& TMH*’70 D13S317 82,83 FL4S3 078820 80*81 i Ft-80 HUMCSF1P0 77,78 t L~ / ςί | FL-78 SI ss ........................................................................ 80,31 ! Fl-31 34

Exemplo 1 j Loci Amplificado Par de Iniciadores: SEQ ID N2 utilizados Marcador(es) 3 Fluorescentes Utilizadas 5 D3S13S8 ! 68.68 FL-68 HUMTH01 66,67 Fl-66 D21S11 64,66 | R*65 OlSSil 82,83 | FL»82 G47S 88,94 I FL-S4 Amelogenina 86.87 twwmi HUMVWFÂ31 78.40 !Mfi«40 D8S1179 74,76 Typ*7S HUItfTPOX 72,73 TMIF73 HUMRB8A 70.71 TMR»70 DS3818 84,66 FL-8S i D13S31? 62,63 M3 078820 80,81 FL'80 016SS39 29.78 Fl-'7f nmcmm 77,78 FL-7B mm mM FL-SF e nsmsm 68,106 FL*89 1 HUMTH01 38,103 FL-3S D 21 S11 84,86 FL458 D18SS1 101,102 Ft-101 | 1 s1ss 92,93 FL-93 | $ Amelogenina 106,8? TMR-10S HUMvWFA31 jTifòSS 4 i: ?8f40 $ <5 Λλ -5¾££ TMR-40 l. 1 jp 33- HUMTP0X * U#.. i 0 72,.73 \ Μ Η - 1 TMR-72 HUMBPIA. 70,107 mfrio DSS818 84,88 FL-8S D13S317 3,4 1 Fb4 D7S82Ô 80,81 Ft~SG D18S538 { 28,97 | FL-2S I HUMCSF1 PO | 77,88 Fl«98 ! l C221 | 98,100 1 Ft-Si ! 35 EXEMPLO 1

Detecçao Fluorescente da Amplificação Multiplex dos Loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539 e HUMCSF1P0 conforme detectado com o ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer

Neste Exemplo, um ADN molde foi amplificado simultaneamente nos loci individuais D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, HUMvWF A31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539 e HUMCSF1PO num único vaso de reacção . A amplificação por PCR foi efectuada em 25 pL de Tampão 1 x Gold ST*R (50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 a 25 °C), 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl2, 160 pg/mL de BSA e 200 pM de cada um dos dATP, dCTP, dGTP e dTTP) utilizando 1 ng de molde e 3,25 U de AmpliTaq Gold™ ADN Polymerase. Foi empregue um GeneAmp® PCR System 9600 (Perkin Elmer, Foster City, CA) com o seguinte protocolo de amplificação: 96 °C durante 12 min., depois 10 ciclos de 94 °C durante 30 s, rampa durante 68 s para 58 °C, mantida durante 30 s, rampa 50 s para 70 °C, mantida durante 45 s, seguido por 20 ciclos de 90 °C durante 30 s, rampa 60 s para 58 °C, mantida durante 30 s, rampa durante 50 s, para 70 °C, mantida durante 45 s, seguida por 1 ciclo de 60 °C durante 30 min.

Vinte e seis iniciadores de amplificação foram utilizados em combinação, incluindo 0,12 pM de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 68] e 2 [FL-SEQ ID N°: 69] de D3S1358, 0,08 pM de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N°: 66] e 2 [SEQ ID N°: 67] de HUMTH01, 0,3 pM de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°:64] e 2 [FL-SEQ ID N° : 65] de D21S11, 0,2 pM de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N° : 62] e 2 [SEQ ID N° : 63] de D18S51, 36 1,1 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ id N°: 76] e 2 [TMR-SEQ ID N°: 40] de HUMvWFA31, 1,8 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°:74] e 2 [TMR-SEQ ID N° : 75] de D8S1179, 0,6 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 72] e 2 [TMR-SEQ ID N° : 73] de HUMTPOX, 2,4 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [TMR-SEQ ID N° : 70] e 2 [SEQ ID N° : 71] de HUMFIBRA, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 84] e 2 [R6G-SEQ ID N°: 85] de D5S818, 0,1 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 82] e 2 [R6G-SEQ ID N°: 83] de D13S317, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [R6G-SEQ ID N° : 80] e 2 [SEQ ID N°: 81] de D7S820, 0,15 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 29] e 2 [R6G-SEQ ID N° : 79] de D16S539, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 77] e 2 [R6G-SEQ ID N°: 78] de HUMCSF1PO.

Os produtos amplificados foram separados utilizando um ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer. As amostras de ADN foram misturadas com 24 pL de uma solução de aplicação (formamida desionizada) e 1,0 pL de um padrão interno de tamanho, desnaturado a 95 °C durante 3 min., e arrefecido em gelo antes da injecção. A separação foi efectuada utilizando o Performance Optimized Polymer 4 (POP-4) (Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA) num capilar 47 cm x 50 pm. O módulo de corrida do fabricante GeneScan© GS STR P0P4 (Id.) (1 mL) A foi utilizado. As condições para a electroforese foram uma injecção de 5 segundos, o kV da injecção foi de 15,0, o kV da corrida foi 15,0, a temperatura de corrida foi 60 °C, o tempo de corrida foi de 28 minutos e o foi utilizado o filtro virtual A. A Figura IA é uma impressão dos resultados do varrimento dos fragmentos amplificados de cada locus separado e detectados com 37 o ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer, como descrito acima. A Figura IA mostra os produtos de amplificação de uma amostra de ADN simultaneamente co-amplifiçada para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539 e HUMCSF1PO. Os picos apresentados no Painel A são marcados com fluoresceína, os picos apresentados no Painel B são marcados com carboxi-tetrametil-rodamina, e picos apresentados no Painel C são marcados com 5,6 carboxirrodamina 6G. A Figura 1 B é uma impressão dos resultados do varrimento de uma amostra preparada da mesma forma que a amostra varrida na Figura 1 A, excepto que não foi utilizado ADN molde na reacção de amplificação. Os picos nesta figura são produtos de ruído resultantes da conjugação do corante e procedimentos de purificação e de causas indefinidas. EXEMPLO 2

Detecção Fluorescente da Amplificação Multiplex dos Loci D3S1358, HUMTH01, D21S1, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1PO e S159 conforme detectado com o ABI PRISM® 310 Genetic

Analyzer

Neste Exemplo, um ADN molde foi amplificado simultaneamente nos loci individuais D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1PO e S159 num único vaso de reacção. A amplificação por PCR foi efectuada em 25 pL de Tampão 38 1 x Gold ST*R (50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 a 25 °C) , 0,1% de Triton X-100, 1,5 mM MgCl2, 160 μg/mL de BSA e 200 μΜ de cada um dos dATP, dCTP, dGTP e dTTP) utilizando 1 ng de molde e 4 U de AmpliTaq Gold™ ADN Polymerase. Foi empregue um GeneAmp* PCR System 9600 (Perkin Elmer, Foster City, CA) com o seguinte protocolo de amplificação: 96 °C durante 12 min., depois 10 ciclos de 94 °C durante 30 s, rampa durante 68 s. para 58 °C, mantida durante 30 s, rampa 50 s. para 70 °C, mantida durante 45 s, seguido por 20 ciclos de 90 °C durante 30 s, rampa de 60 s. para 58 °C, mantida durante 30 s, rampa durante 50 s, para 70 °C, mantida durante 45 s, seguida por 1 ciclo de 60 °C durante 30 min.

Foram utilizados trinta e dois iniciadores de amplificação em combinação, incluindo 0,12 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 68] e 2 [FL-SEQ ID N° : 69] de D3S1358, 0,08 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N°: 66] e 2 [SEQ ID N°: 67] de HUMTH01, 0,3 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 64] e 2 [FL-SEQ ID N°: 65] de D21S11, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N° : 62] e 2 [SEQ ID N° : 63] de D18S51, 0,24 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N° : 88] e 2 [SEQ ID N°: 89] de G475, 0,6 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [TMR-SEQ ID N°: 86] e 2 [SEQ ID N°: 87] de Amelogenina, 1,1 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 76] e 2 [TMR-SEQ ID N°: 40] de HUMvWFA31, 1,8 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 74] e 2 [TMR-SEQ ID N° : 75] de D8S1179, 0,6 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 72] e 2 [TMR-SEQ ID N°: 73] HUMTPOX, 2,4 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [TMR-SEQ ID N° : 70] e 2 [SEQ ID N° : 71] de HUMFIBRA, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 84] e 2 [R6G-SEQ ID N°: 85] de D5S818, 0,1 μΜ de cada um dos iniciadores 39 1 [SEQ ID N° : 82] e 2 [R6G-SEQ ID N° : 83] de D13S317, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [R6G-SEQ ID N° : 80] e 2 [SEQ ID N°: 81] de D7S820, 0, 15 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 29] e 2 [R6G-SEQ ID N° : 79] de D16S539, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 77] e 2 [R6G-SEQ ID N° : 78]de HUMCSF1PO, 0,1 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 90] e 2 [R6G-SEQ ID N°: 91] de S159.

Os produtos amplificados foram separados utilizando um ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer. As amostras de ADN foram misturadas com 24 pL de uma solução de aplicação (formamida desionizada) e 1,0 pL de um padrão interno de tamanhos, desnaturado a 95 °C durante 3 min., e arrefecido em gelo antes da injecção. A separação foi efectuada utilizando o Performance Optimized Polymer 4 (POP-4) (Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA) num capilar 47 cm x 50 pm. Foi utilizado o módulo de corrida do fabricante GeneScan® GS STR POP4 (ld.)(1 mL) A. As condições para a electroforese foram uma injecção de 5 segundos, o kv da injecção foi 15,0, o kV da corrida foi de 15,0, a temperatura de corrida foi de 60 °C, o tempo de corrida foi de 28 minutos e o filtro virtual A foi utilizado. A Figura 2A é uma impressão dos resultados do varrimento dos fragmentos amplificados de cada locus separados e detectados com o ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer, como descrito acima. A Figura 2A apresenta os produtos de amplificação de uma amostra de ADN simultaneamente co-amplifiçada para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1PO e S159. Os picos apresentados no Painel A são marcados com fluoresceina, os picos apresentados no Painel B são marcados com 40 carboxitetrametil-rodamina, e os picos apresentados no Painel C são marcados com 5,6 carboxirrodamina 6G. A Figura 2B é uma impressão dos resultados de varrimento de uma amostra preparada da mesma forma que a amostra varrida na Figura 2A, excepto que não foi utilizado ADN molde na reacção de amplificação. Os picos nesta figura são produtos de ruído resultantes da conjugação do corante e processos de purificação e de causas indefinidas. EXEMPLO 3

Detecção Fluorescente da Amplificação Multiplex dos Loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31,

D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1PO e S159 conforme detectado com o ABI PRISM® 3 77 ADN

Sequencer

Neste Exemplo, um ADN molde foi amplificado como no

Exemplo 2. Os produtos amplificados foram separados utilizando um ABI PRISM® 377 ADN Sequencer. Isto foi efectuado utilizando um

gel 5% Long Ranger™ Acrylamide de 0,2 mm de espessura, (FMC

BioProducts, Rockland, ME), 7 M de ureia. As amostras de ADN foram misturadas com 1,5 pL de uma solução de aplicação (88,25% de formamida, 4,1 mM de EDTA, 15 mg/mL de Azul Dextrano) e 0,5 pL de um padrão interno de tamanho, desnaturado a 95 °C

durante 2 min., e arrefecido em gelo antes de aplicação. A electroforese foi efectuada utilizando os módulos do fabricante de GeneScan® para Prerun (PR GS 36A-2400) e Run (GS 36A-2400). O 41 tempo de corrida foi de 3 horas e o filtro virtual A foi utilizado. A Figura 3A é uma impressão de resultados de varrimento dos fragmentos amplificado de cada locus separados e detectados com o ABI PRISM® 377 ADN Sequencer, como descrito acima. A Figura 3A apresenta os produtos de amplificação de uma amostra de ADN simultaneamente co-amplifiçada para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1P0 e S159. Os picos apresentados no Painel A são marcados com fluoresceina, os picos apresentados no Painel B são marcados com carboxitetrametil-rodamina, e os picos apresentados no Painel C são marcados com 5,6 carboxirrodamina 6G. A Figura 3B é uma impressão dos resultados do varrimento de uma amostra preparada da mesma forma que a amostra varrida na Figura 3A, excepto que não foi utilizado ADN molde na reacção de amplificação. Os picos nesta figura são produtos de ruído resultantes da conjugação de corante e processos de purificação e de causas não definidas. 42 EXEMPLO 4

Detecção Fluorescente de Amplificação em Multiplex de Loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31,

D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1PP e S159 conforme detectado com o Hitachi FMBIO® II

Fluorescent Scanner

Neste exemplo, dois ADN molde foram cada um amplificado simultaneamente em cada um de três diferentes combinações de locus seleccionados a partir dos loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX,

HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1P0 e S159. A amplificação de cada combinação de locus incluiu 5 ng de molde num único tubo de reacção que contém 25 pL de Tampão 1 x Gold ST*R (50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 a 25 °C) , 0,1% Triton X-100, 1,5 mM de MgCl2 160 pg/mL de BSA e 200 pM de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP).

Foi empregue um GeneAmp® PCR System 9600 (Perkin Elmer, Foster City, CA) com o seguinte protocolo de amplificação: 96 °C durante 12 min., depois 10 ciclos de 94 °C durante 30 s, rampa durante 68 s. para 58 °C, mantida durante 30 s, rampa 50 s. para 70 °C, mantida durante 45 s, seguido por 22 ciclos de 90 °C durante 30 s, rampa 60 s. para 58 °C, mantida durante 30 s, rampa durante 50 s, para 70 °C, mantida durante 45 s, seguida por 1 ciclo de 60 °C durante 30 min.

Foram utilizados trinta e dois iniciadores de amplificação nas seguintes concentrações, incluindo 0,225 pM de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 68] e 2 [FL-SEQ ID N°: 69] de D3S1358, 43 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N°: 66] e 2 [SEQ ID N° : 67] de HUMTH01, 1,0 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°:64] e 2 [FL-SEQ ID N°: 65] de D21S11, 1,0 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N°: 62] e 2 [SEQ ID N° : 63] de D18S51, 2,8 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N°: 88] e 2 [SEQ ID N°: 89] de G475, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [TMR-SEQ ID N°: 86] e 2 [SEQ ID N°: 87] de Amelogenina, 0,3 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 76] e 2 [TMR-SEQ ID N°: 40] de HUMvWFA31, 1,5 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 74] e 2 [TMR-SEQ ID N° : 75] de D8S1179, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 72] e 2 [TMR-SEQ ID N°: 73] de HUMTPOX, 2,0 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [TMR- SEQ ID N° : 70] e 2 [SEQ ID N° : 71] de HUMFIBRA, 0,55 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 84] e 2 [FL-SEQ ID N° : 85] de D5S818, 1,1 M de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 82] e 2 [FL-SEQ ID N°: 83] de D13S317, 1,7 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N° : 80] e 2 [SEQ ID N° : 81] de D7S820, 3,3 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 29] e 2 [FL-SEQ ID N°: 79] de D16S539, 0,5 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 77] e 2 [FL-SEQ ID N° : 78] de HUMCSF1PO, 2,0 M de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 90] e 2 [FL-SEQ ID N°: 91] de S159,

Na primeira combinação de locus, cada molde foi amplificado utilizando 2,5 U de AmpliTaq Gold™ ADN Polymerase e iniciadores para cada locus utilizado nas concentrações acima descritas para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX e HUMFIBRA. Na segunda combinação de locus, todos os trinta e dois iniciadores, acima, nas concentrações descritas, e foram utilizadas 4 U de AmpliTaq

Gold™ ADN Polymerase para amplificar ADN molde em todos os dezasseis loci, D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, 44

Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1PO e S159 num único vaso de reacção. Na terceira combinação, cada molde foi amplificado utilizando 1,5 U de AmpliTaq Gold™ ADN Polymerase e os iniciadores para cada locus utilizado nas concentrações acima descritas para os loci D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1P0 e S159 .

Os produtos de amplificação foram separados por electroforese através de um gel desnaturante de poliacrilamida a 4% com 0,4 mm de espessura (19:1 proporção de acrilamida para bis-acrilamida) que continha 7 M de ureia (Sambrook et al., (1989)) e que foi quimicamente reticulado a 2 placas de vidro (Kobayashi, Y. (1988), BRL Focus 10: 73-74). As amostras de ADN foram misturadas com 3,5 pL de uma solução de aplicação (10 mM a NaOH, 95% de formamida, 0,05% de azul de bromofenol) e 0,5 pL de um padrão interno de tamanho, desnaturado a 95 °C durante 2 min., e arrefecido em gelo antes da aplicação. Os produtos separados foram visualizados por detecção dos sinais fluorescentes utilizando o Hitachi FMIBO® II fluorescent scanner (Hitachi Software Engineering America, Ltd. South San Francisco, CA) . Os filtros de passa banda a 505 nm e 585 nm, respectivamente, foram utilizados para a detecção de loci marcados com fluoresceína e loci marcados com carboxi-tetrametil-rodamina, respectivamente. Um filtro de passa banda de 650 nm foi utilizado para a detecção do padrão interno de pista (dados do padrão interno, não apresentados). É feita referência às Figuras 4A e 4B, que apresentam os fragmentos resultantes de cada reacção de amplificação. A Figura 4A apresenta os resultados do varrimento 505 nm (canal de 45

Fluoresceína) e a Figura 4B apresenta os resultados do varrimento a 585 nm (canal da carboxi-tetrametilrrodamina) das mesmas pistas do gel de poliacrilamida. Para cada ADN molde, a pista 1 apresenta os resultados da amostra de ADN que foi simultaneamente co-amplifiçada para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX e HUMFIBRA. A pista 2 apresenta os resultados da amostra de ADN simultaneamente co-amplifiçada para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, HUMCSF1PO e S159. A pista 3 apresenta os resultados da amostra de ADN simultaneamente co-amplifiçada para os loci D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, HUMCSF1P0 e S159. EXEMPLO 5

Detecçao Fluorescente de Amplificação em Multiplex dos Loci

kJ J- ^ ^ f D8S1179, j.±v_/ra-i,í.±\j _i_ f HUMTPOX, j. ^ j. j. f j_/. HUMFIBRA, D5S818, D7S82Q, D13S317, D16S539, HUMCSF1PO e S159 conforme detectado com o Hitachi FMBIO® II

Fluorescent Scanner

Neste exemplo, dois ADN molde foram cada um amplificado simultaneamente em cada uma de duas diferentes combinações de locus seleccionados a partir dos loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX,

HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1P0 e S159. A amplificação de cada combinação de locus incluiu 5 ng de molde num único vaso de reacção que contém 25 pL de Tampão 1 x Gold ST*R (50 mM de KC1, 10 mM de Tris-HCIl (pH 8,3 a 25 °C) , 0,1% de 46

Triton X—100, 1,5 mM de MgCl2, 160 ug/mL de BSA e 200 μΜ de cada um dos dATP, dCTP, dGTP e dTTP).

Foi empregue um GeneAmp* PCR System 9600 (Perkin Elmer, Foster City, CA) com o seguinte protocolo de amplificação: 96 °C durante 12 min., depois 10 ciclos de 94 °C durante 30 s, rampa durante 68 s. para 58 °C, mantida durante 30 s, rampa 50 s. para 70 °C, mantida durante 45 s, seguido por 22 ciclos de 90 °C durante 30 s, rampa 60 sec. para 58 °C, mantida durante 30 s, rampa durante 50 s, para 70 °C, mantida durante 45 s, seguida por 1 ciclo de 60° C durante 30 min.

Foram utilizados trinta e dois iniciadores de amplificação nas seguintes concentrações, incluindo 0,225 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 68] e 2 [FL-SEQ ID N°: 69] de D3S1358, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N°: 66] e 2 [SEQ ID N° : 67] de HUMTH01, 1,0 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 64] e 2 [FL-SEQ ID N°: 65] de D21S11, 1,0 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N° : 62] e 2 [SEQ ID N° : 63] de D18S51, 2,8 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 88] e 2 [FL-SEQ ID N°: 94] de G475, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [TMR-SEQ ID N°: 86] e 2 [SEQ ID N°: 87] de Amelogenina, 0,3 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°:76] e 2 [TMR-SEQ ID N°: 40] de HUMvWFA31, 1,5 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 74] e 2 [TMR-SEQ ID N° : 75] D8S1179, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 72] e 2 [TMR-SEQ ID N°: 73] de HUMTPOX, 2,0 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [TMR-SEQ ID N°: 70] e 2 [SEQ ID N°: 71] de HUMFIBRA, 0,55 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 84] e 2 [FL-SEQ ID N°: 85] de D5S818, 1,1 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 82] e 2 [FL-SEQ ID N°: 83] de D13S317, 1,7 μΜ de cada um dos iniciadores 47 1 [FL-SEQ ID N° : 80] e 2 [SEQ ID N° : 81] de D7S820, 3,3 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 29] e 2 [FL-SEQ ID N°: 79] de D16S539, 0,5 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 77] e 2 [FL-SEQ ID N° : 78] de HUMCSF1PO, 2,0 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 95] e 2 [FL-SEQ ID N°: 96] de S159.

Na primeira combinação de locus, cada molde foi amplificado utilizando 2,5 U de AmpliTaq Gold™ ADN Polymerase e os iniciadores para cada locus utilizados nas concentrações acima descritas para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX e HUMFIBRA. Na segunda combinação de locus, todos os trinta e dois iniciadores, acima, nas concentrações descritas, e foram utilizadas 4 U de AmpliTaq Gold™ ADN Polymerase para amplificar ADN molde em todos os dezasseis loci, D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1PO e S159 num único vaso de reacção. A separação e visualização de produtos amplificados foram como descritas no Exemplo 4. É feita referência às Figuras 5A e 5B, que apresentam os fragmentos resultantes de cada reacção de amplificação. A Figura 5A apresenta os resultados do varrimento a 505 nm (canal de Fluoresceína) e a Figura 5B apresenta os resultados do varrimento a 585 nm (canal da carboxi-tetrametilrrodamina) das mesmas pistas do gel de poliacrilamida. Para cada molde, pista 1 apresenta os resultados da amostra de ADN simultaneamente co-amplifiçada para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX e HUMFIBRA e 48 pista 2 apresenta os resultados da amostra de ADN simultaneamente co-amplifiçada para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, HUMCSF1PO e S159. EXEMPLO 6

Detecçao Fluorescente de Amplificação em Multiplex dos Loci

D8S1179, íj. wj. j. j. ϋ w j. r HUMTPOX, j. ^ j. j. r J-' - HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1PO e C221 conforme detectado com o Hitachi FMBIO® II

Fluorescent Scanner

Neste exemplo, dois ADN molde foram, cada um, amplificado simultaneamente em cada de três diferentes combinações de locus seleccionados a partir dos loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, S15 9, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX,

HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1P0 e C221. A amplificação de cada combinação de locus incluía 10 ng de molde num único vaso de reacção contendo 25 pL de Tampão 1 x Gold ST*R (50 mM de KC1, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3 a 25 °C) , 0,1% de

Triton X-100, 1,5 mM de MgCl2, 160 pg/mL de BSA e 200 pM de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP).

Foi empregue um GeneAmp® PCR System 9600 (Perkin Elmer, Foster City, CA) com o seguinte protocolo de amplificação: 96 °C durante 12 min., depois 10 ciclos de 94 °C durante 30 s, rampa durante 68 s. a 60 °C, mantida durante 30 s, rampa de 50 s. a O o O mantida durante 45 s, seguido por 20 ciclos de 90 °C durante 30 s, rampa 6 0 s. para 60 °C, mantida durante 30 s, 49 rampa durante 50 s, para 70 °C, mantida durante 45 s, seguida por 1 ciclo de 60 °C durante 30 min.

Trinta e dois iniciadores de amplificação foram utilizados nas seguintes concentrações, incluindo 0,75 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 106] e 2 [FL-SEQ ID N°: 69] de D3S1358, 0,3 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N° : 38] e 2 [SEQ ID N°: 103] de HUMTH01, 2,0 μΜ cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 64] e 2 [FL-SEQ ID N°: 65] de D21S11, 0,3 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N° : 101] e 2 [SEQ ID N° : 102] de D18S51, 2,0 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°:92] e 2 [FL-SEQ ID N°: 93] de S159, 0,15 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [TMR- SEQ ID N° : 105] e 2 [SEQ ID N° : 87] de Amelogenina, 1,0 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 76] e 2 [TMR-SEQ ID N°: 40] de HUMvWFA31, 1,25 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [TMR-SEQ ID N°:104] e 2 [SEQ ID N°: 75] de D8S1179, 0, 75 μΜ cada um dos iniciadores 1 [TMR-SEQ ID N° : 72] e 2 [SEQ ID N°: 73] de HUMTPOX, 1,5 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [TMR-SEQ ID N° : 70] e 2 [SEQ ID N°: 107] de HUMFIBRA, 0,55 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 84] e 2 [FL-SEQ ID N° : 85] D5S818, 1,1 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N°: 3] e 2 [FL-SEQ ID N°: 4] de D13S317, 1,7 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N° : 80] e 2 [SEQ ID N° : 81] de D7S820, 3,3 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N°: 29] e 2 [SEQ ID N°: 97] de D16S539, 0,25 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [SEQ ID N° : 77] e 2 [FL-SEQ ID N° : 98] de HUMCSF1PO, 1,0 μΜ de cada um dos iniciadores 1 [FL-SEQ ID N°: 99] e 2 [SEQ ID N°: 100] de C221.

Na primeira combinação de locus, cada molde foi amplificado utilizando 2,5 U de AmpliTaq Gold ADN Polymerase e os 50 iniciadores para cada locus utilizados nas concentrações acima descritas para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, S159,

Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX e HUMFIBRA. Na segunda combinação de locus, todos os trinta e dois iniciadores, acima, nas concentrações descritas e 4 U de AmpliTaq Gold™ ADN Polymerase foram utilizadas para amplificar ADN molde em todos os dezasseis loci, D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, S159,

Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1PO e C221 numa único tubo de reacção. Na terceira combinação, cada molde foi amplificado utilizando 1,5 U de AmpliTaq Gold™ ADN Polymerase e os iniciadores para cada locus utilizados nas concentrações acima descritas para os loci D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, HUMCSF1P0 e C221.

Os produtos de amplificação foram separados e detectados como descrito no Exemplo 4, excepto que cada amostra dos produtos de amplificação foi diluída 1:4 em 1 x Tampão STR (50 mM de KC1, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3 a 25 °C) , 0,1% de

Triton X—100, 1,5 mM de MgCl2, e 200 μΜ de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP) . Os produtos de amplificação diluídos (2,5 pL) foram misturados com 2,5 pL de uma solução de aplicação (10 mM de NaOH, 95% de formamida, 0,05% de azul de bromofenol), sem uma pista de padrão interno, desnaturado a 95 °C durante 2 min., e arrefecido em gelo antes de aplicação. É feita referência às Figuras 6A e 6B, que apresenta os fragmentos resultantes de cada reacção de amplificação. A Figura 6A apresenta os resultados do varrimento a 505 nm (canal de Fluoresceína) e a Figura 6B apresenta os resultados do varrimento a 585 nm (canal da carboxi-tetrametilrrodamina) das 51 mesmas linhas do gel de poliacrilamida. Para caca molde de ADN, a pista 1 apresenta os resultados da amostra de ADN simultaneamente co-amplifiçada para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, S159, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, e HUMFIBRA. A pista 2 apresenta os resultados da amostra de ADN simultaneamente co-amplifiçada para os loci D3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, G475, Amelogenina, HUMvWFA31, D8S1179, HUMTPOX, HUMFIBRA, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, HUMCSF1P0, e C221. A pista 3 apresenta os resultados da amostra de ADN simultaneamente co-amplifiçada para os loci D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, HUMCSF1P0 e C221

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Schumm, James W. <110> Sprecher, Cynthia J. <120> Amplificação Multiplex de Loci Curtos de Repetição em Tandem <130> 8976.112 <150> US 08/316544 <151> 1994-09-30 <150> US 08/632575 <151> 1996-04-15 <160> 110 <170> WordPerfect 7.0 (convertido para formato de texto DOS)

<210> 1 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens 52 <222> D7S820 <400> 1 gaacacttgt catagtttag aacg 24 <210> 2 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D7S820 <400> 2 ctgaggtatc aaaaactcag agg 23 <210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D13S317 <400> 3 acagaagtct gggatgtgga 20 <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D13S317 53 <400> 4 20 gcccaaaaag acagacagaa <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D5S818 <400> 5 gggtgatttt cctctttggt 20 <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D5S818 <400> 6 tgattccaat catagccaca 20 <210> 7 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D3S1539 54 <4Ο0> 7 26 tctctttcca ttactctctc catagc <210> 8 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D3S1539 <400> 8 agtgctgttt tagcttccag ga 22 gtaggtcttt tggttgccag tatg 24 <210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D17S1298 <400> 9 <210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D17S1298 <400> 10 55 tgtcagtaaa cctgtgacct gagt 24 <210> 11 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D20S481 <400> 11 aatggtgaga aatgggtt, <210> 12 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D20S481 <400> 12 tttccggctt tgtgtcat <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D9S930 <400> 13 26 25 56 20 23 tggacaacag agtgagatgc <210> 14 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D9S930 <400> 14 gctatgggaa ttacaagcag gaa <210> 15 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> Dl 0 S ] .239 <400> 15 ctttgaaatg gacccctagc taatgt 26 <2 10> 16 <2 11> 21 <2 12> ADN <2 13> Homo sapiens <2 22> D10S1239 57 <4 Ο 0> 16 21 caccctgtcc ccagctatct g <210> 17 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D14S118 <400> 17 cagcttgggc aacataggg 19 <210> 18 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D14S118 <400> 18 caaactcctg aggtcaaaca atcc 24 <210> 19 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D14S562 58 <4Ο0> 21 21 cttggagggt ggggtggcta a <210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D14S562 <400> 20 cgaaattttg ttgccttgct ctgg 24 <210> 21 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D14S548 <400> 21 cctgggcaac agagtgagac t 21 <210> 22 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D14S548 59 <4Ο0> 22 2 4 acccagcttt aacagtttgt gctt <210> 23 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapienss <222> D16S490 <400> 23 gggcggacac agaatgtaaa ate 23 <210> 24 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D16S490 <400> 24 aaacccaaat agatgacagg caca 24 <2 10> 25 <2 11> 24 <2 12> ADN <2 13> Homo sapiens <2 22> D16S753 60 <4Ο0> 25 2 4 gcactccagg ctgaatgaca gaac <210> 26 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> Dl6 S 753 <400> 26 gcagtgccgc ctatttttgt gaat 24 <210> 27 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D17S1299 <400> 27 accctgatga gatagcactt gagc 24 <210> 28 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D17S1299 61 <4Ο0> 28 2 4 cactgtgtgg aggtgtagca gaga <210> 29 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D16S539 <400> 29 gggggtctaa gagcttgtaa aaag 24 <210> 30 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D16S539 <400> 30 tgtgcatctg taagcatgta tctatc 26 <2 10> 31 <2 11> 23 <2 12> ADN <2 13> Homo sapiens <2 22> D22S683 62 <4Ο0> 31 23 cgaaggttgc attgagccaa gat <210> 32 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D22S683 <400> 32 ggtggaaat gcctcatgta gaaa 24 <210> 33 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMCSF1P0 <400> 33 aacctgagtc tgccaaggac tagc 24 <210> 34 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMCSP1P0 63 <4Ο0> 34 ttccacacac cactggccat cttc 24 <210> 35 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMTPOX <400> 35 actggcacag aacaggcact tag 24 <210> 36 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMTPOX <400> 36 ggaggaactg ggaaccacac aggt 24 <210> 37 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMTHOl <400> 37 attcaaaggg tatctgggct ctgg 24 64 <210> 38 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMTHOl <400> 38 gtgggctgaa aagctcccga ttat 24 <210> 39 <211> 29 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMvWFA31 <400> 39 gaaagcccta gtggatgata agaataatc 29 <210> 40 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMvWFA31 <400> 40 ggacagatga taaatacata ggatggatgg 30 65 <210> 41 <211> 24 <212> DN24A <213> Homo sapiens <222> HUMF13A01 <4 Ο 0> 41 gaggttgcac tccagccttt gcaa 24 <210> 42 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMF13A01 <400> 42 ttcctgaatc atcccagagc 2 4 <210> 43 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMFESFPS <400> 43 23 gctgttaatt catgtaggga agg 66 <210> 44 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMFESFPS <400> 44 gtagtcccag ctacttggct actc 24 <210> 45 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMBFXIII <400> 45 tgaggtggtg tactaccata 20 <210> 46 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMBFXIII <400> 46 gatcatgcca ttgcactcta 20 67 <210> 47

<211> 24 <212> ADN

<213> Homo sapiens <222> HUMLIPOL <400> 47 ctgaccaagg atagtgggat atag 24

<210> 48 <211> 23 <212> ADN

<213> Homo sapiens <222> HUMLIPOL <400> 48 23 18 ggtaactgag cgagactgtg tct

<210> 49 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D3S1539 <400> 49 ccaccctttc agcaccag 68 <210> 50 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D19S253 <400> 50 atagacagac agacggactg 20 <210> 51 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D19S253 <400> 51 gggagtggag attacccct <210> 52 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D20S481 <400> 52 aaagctctct gaagcaggtg t 21 69 <210> 53 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D20S481 <400> 53 cagattgcac tagaaagaga ggaa 24 <210> 54 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D10S1239 <400> 54 caccctgtcc ccagctatct 23 <210> 55 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D9S930 <400> 55 agttgaatct tgagtctctc agagtca 27 70 <210> 56 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D4S2368 <400> 56 tgtactcatt ttcccgcaat gatg 24 <210> 57 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D4S2368 <400> 57 tcagaaagta gggtctgggc tctt 24 <210> 58 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D16S539 <400> 58 tgtgcatctg taagcatgta tctatcat 28 71 <210> 59 <211> 32 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMvWFA31 <400> 59 gaaagcccta gtggatgata agaataatca gt 32 <210> 60 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMvWFA31 <400> 60 ggacagatga taaatacata ggatggatgg ata 33 <210> 61 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D9S930 <400> 61 gctatgggaa ttacaagcag gaaac 25 72 <210> 62 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D18S51 <400> 62 ttcttgagcc cagaaggtta 20 <210> 63 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D18S51 <400> 63 ctaccagcaa caacacaaat aaac 24 <210> 64 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D21S11 <400> 64 atatgtgagt caattcccca ag 22 73 <210> 65 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D21S11 <400> 65 tgtattagtc aatgttctcc agagac 26 <210> 66 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMTH01 <400> 66 gtgatt ccca ttggcctgtt <210> 67 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMTH01 <400> 67 attcctgtgg gctgaaaagc tc 22 74 <210> 68 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D3S1358 <400> 68 gcagtccaat ctgggtgac 19 <210> 69 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D3S1358 <400> 69 atgaaatcaa cagaggcttg 20 <210> 70 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMFIBRA <400> 70 ggctgcaggg cataacatta 20 75 <210> 71

<211> 22 <212> ADN

<213> Homo sapiens <222> HUMFIBRA <400> 71 tctatgactt tgcgcttcag ga 22 <210> 72 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMTPOX <400> 72 gcacagaaca ggcacttagg 20 <210> 73 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMTPOX <400> 73 cgctcaaacg tgaggttg 18 76 <210> 74 <211> 32 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D8S1179 <400> 74 attgcaactt atatgtattt ttgtatttca tg 32

<210> 75 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D8S1179 <400> 75 28 33 accaaattgt gttcatgagt atagtttc

<210> 76 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMvWFA31 <400> 76 gccctagtgg atgataagaa taatcagtat gtg 77 <210> 77 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMCSF1P0 <400> 77 ccggaggtaa aggtgtctta aagt 2 4 <210> 78 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMCSF1PO <400> 78 atttcctgtg tcagaccctg tt 22 <210> 79 <211> 29 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D16S539 <400> 79 gtttgtgtgt gcatctgtaa gcatgtatc 29 78 <210> 80 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D7S820 <400> 80 atgttggtca ggctgactat g 21 <210> 81 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D7S820 <400> 81 gattccacat ttatcctcat tgac 24 <210> 82 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D13S317 <400> 82 attacagaag tctgggatgt ggagga 26 79 <210> 83 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D13S317 <400> 83 ggcagcccaa aaagacaga <210> 84 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D5S818 <400> 84 ggtgattttc ctctttggta tcc 23 <210> 85 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D5S818 <400> 85 agccacagtt tacaacattt gtatct 26 80 <210> 86

<211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> Amelogenin <400> 86 ccctgggctc tgtaaagaa 19

<210> 87 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> Amelogenin <400> 87 atcagagctt aaactgggaa gctg 24

<210> 88 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> G475 <400> 88 2 4 taccaacatg aaagggtacc aata 81 <210> 89 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> G475 <400> 89 tgggttatta attgagaaaa ctcctta 27 <210> 90 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> S159 <400> 90 gccatgatca caccactaca 20 <210> 91 <211> 26 <212> ADN <213> Homo <222> S15 9 sapiens <400> 91 26 ccgattttta attgggttgt cttatt 82 <210> 92 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> S15 9 <400> 92 gccatgatca caccactaca <210> 93 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> S159 <400> 93 ccgattttta attgggttgt <210> 94 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> G475 <400> 94 tgggttatta attgagaaaa ctccttacaa ttt 33 83 <210> 95 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> S15 9 <400> 95 gcacagtggc taattgtacc <210> 97 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D16S539 <400> 97 gtttgtgtgt gcatctgtaa gcat 24 <210> 96 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> S159 <400> 96 tttttaatag gtcatgattt tgtgat 26 84 <210> 98

<211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMCSF1P0 <400> 98 cctgtgtcag accctgttct aagt 24

<210> 99 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> C221 <400> 99 aacagggata tgcactggta ataga 25

<210> 100 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> C221 <400> 100 21 tgcataaaac cctggttggt c 85 <210> 101 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D18S51 <400> 101 caaacccgac taccagcaac <210> 102 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D18S51 <400> 102 gagccatgtt catgccactg <210> 103 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> HUMTHOl <400> 103 gtgattccca ttggcctgtt cctc 24 86 <210> 104 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D8S1179 <400> 104 tggcaactta tatgtattttt gtatttc 28 <210> 105 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> Amelogin <400> 105 ccctgggctc tgtaaagaat agtg 2 4 <210> 106 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <222> D3S1358 <400> 106 19 actgcagtcc aatctgggt 87 <210> 107

<211> 21 <212> ADN

<213> Homo sapiens <222> HUMFIBRA <4 0 0> 107 ctatgacttt gcgcttcagg a 21

<210> 108 <211> 1000 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> de um pGem3Zf( + )biblioteca de plasmídeo <222> Clone S159 <400> 108 aaaccccgtc tctactaaaa atacaaaagt tagttgagca tggtggcacg 50 ggcctgtaat cccacctata atcccaccta ctcgggaggc tgaggcagga 100 gaatcgcttg aacccaggat ggggcgattg cagtgagccg agatcgtgcc 150 actgcactcc agcctgggtg acagagcgag actccatctc aaaaaaaaaa 200 aaaaaaaaca gaatcatagg ccaggcacag tggctaattg taccttggga 250 ggctgagacg ggaggatcga gaccatcctg ggcaccatag tgagacccca 300 tctctacaaa aaaaaaaaaa aatttttttt aaatagccag gcatggtgag 350 gctgaagtag gatcacttga gcctggaagg tcgaagctga agtgagccat 400 gatcacacca ctacactcca gcctaggtga cagagcaaga caccatctca 450 agaaagaaaa aaaagaaaga aaagaaaaga aaagaaaaga aaagaaaaga 500 aaagaaaaga aaaaacgaag gggaaaaaaa gagaatcata aacataaatg 550 taaaatttct caaaaaaatc gttatgacca taggttaggc aaatatttct 6 00 tagatatcac aaaatcatga cctattaaaa aataataata aagtaagttt 650 88 catcaaaact aaaaagacac aaaaggactt ccaattaaaa atataaatgt ggcaggcgga ggtgaaaccc taaaagttct gccacaggct gtgtccagat atcggcaaaa gtccgggcgc tcacttgagg tgtctctaat actcttcaaa aagagaaagt taaagaattc gatttgaaga gatggtaatc tcaggagttt aaaaatacaa agatacctta acttctaatc ttacacatca gatatttaac ccagcacttt aggaccagtc aaattagctg taaagaaagt acatatctaa ataagacaac caaagaaaac gagaggccga tggccaacat ggtgtggtgg 700 750 800 850 900 950 1000 <210> 109 <211> 411 <212> ADN <213> Homo sapiens de plasmídeo <220> de um pGem3Zf(+)biblioteca <222> Clone C221 <400> 109 gatcacttgc gatgacccct tttgcacctg aagagggact ttgttttgtt tcagtgttgg gtcagatgcc gtcctgggcc tggctgggat catccctgcc gccctaccca tcaggcaagg aagttttgtt ttgttttgtt aatgctctct ggaattgggg tcggtcctgg acacagtttc cttgtcatgg cttaaacagg ttgttttgtt ttgtttttct tgtagcagtg gtgcgcttgg cttggagagg ctcctctgga cattggggac gatatgcact ttgttttgtt gaagaagtcc gcggctgctg gtgcagctgc tgcagctcac aactgggggt atgaacacac ggtaatagaa ttgttttgtt ctagaagcgc ctggttccgg atttcatctg agccacttca 50 100 150 200 250 300 350 400 411

<210> 110 <211> 335 <212> ADN 89

Homo sapiens de um pGem3Zf(+)biblioteca Clone de plasmideo <213> <220> <222> <400> 110 gatcacgcca

3.3.g3.3.3.cLgcLcL aagaaaagaa aattctttcc gttatgtaat cattttataa cagaactagc G475 ttgcactcca aagaaaagaa aattgtaagg atgtatcaat cattatatca aagaggaaac aaaggaaaag gcctgggcga aagaaaagaa agttttctca catgatacta tgcatgcaag tgatgtttga agaagtgaat ctgagcaaga aagaaaagaa attaataacc agcactttac gtaatgagta ggctactttg gtatc ctcagtctca aagaaaagaa caaataagag acacatgtat ttattttcct cttaagaccg

Lisboa, 30 de Novembro de 2012

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para identificar simultaneamente os alelos presentes num conjunto de loci de uma ou mais amostras de ADN, compreendendo: (a) proporcionar uma amostra de ADN a ser analisada, (b) seleccionar um conjunto de loci da amostra de ADN, compreendendo loci de repetições em tandem curtas D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, HUMCSF1P0, HUMFIBRA, HUMTH01, HUMTPOX e HUMvWFA31; (c) co-amplificar os loci no conjunto numa reacção de amplificação em multiplex, em que o produto da reacção é uma mistura de alelos amplificados de cada um dos loci co-amplifiçados no conjunto; e (d) avaliar os alelos amplificados na mistura para determinar os alelos presentes em cada um dos locus analisados no conjunto na amostra de ADN; em que a reacção de amplificação multiplex é uma reacção de polimerase em cadeia.
2. Método da reivindicação 1, em que a reacção de amplificação multiplex é efectuada utilizando, pelo menos, um iniciador para, pelo menos, um locus no conjunto de, pelo menos, treze loci seleccionados no passo (b) , em que o iniciador possui uma sequência seleccionada de um dos grupos de sequências de iniciadores consistindo de: SEQ ID N°: 62, SEQ ID N°: 63, SEQ ID N° : 101, e SEQ ID N° : 102, quando um dos locus no conjunto é D18S51; 1 SEQ ID N°: 64 e SEQ ID N°: 65, para o locus D21S11; SEQ ID N° : 37, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 66, SEQ ID N°: 67, e SEQ ID N°: 103, para o locus HUMTH01 SEQ ID N°: 68, SEQ ID N°: 69, e SEQ ID N°: 106, para o locus D3S1358; SEQ ID N°:70, SEQ ID N° : 71, e SEQ ID N°: 107, para o locus HUMFIBRA; SEQ ID N° : 35, SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 72, e SEQ ID N° : 73 , para o locus HUMTPOX; SEQ ID N° : 74 , SEQ ID N° : 75 e SEQ ID N°: 104, para o locus D8S1179; SEQ ID N° : 39 , SEQ ID N° : 40, SEQ ID N 0 : 59, SEQ ID N° : 60 e SEQ ID N° : 76 , para o locus HUMvWFA31; SEQ ID N° : 33 , SEQ ID N° : 34, SEQ ID N 0 : 77, SEQ ID N° : 78 e SEQ ID N° : 98 , para o locus HUMCSF1PO; SEQ ID N° : 29 , SEQ ID N°: 30, SEQ ID N 0 : 58, SEQ ID N° : 79 e SEQ ID N° : 97 , para o locus D16S539; SEQ ID N° : 1, SEQ ID N° : 2, SEQ ID N° : 80 e SEQ ID N°: 81, para O locus D 7 S 8 2 0; SEQ ID N° : 3, SEQ ID N° : 4, SEQ ID N° : 82 e SEQ ID N°: 83, para O locus D13S317; SEQ ID N° : 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N° : 84 e SEQ ID N°: 85, para 0 locus D5S818.
3. Método da reivindicação 1, em que o conjunto de loci seleccionados no passo (a) do método compreende ainda, pelo menos, um locus adicional seleccionado do grupo de loci consistindo de: G475; S159; C221 e Amelogenina.
4. Método da reivindicação 3, em que a reacção de amplificação multiplex é efectuada utilizando, pelo menos, um 2 oligonucleótido iniciador possuindo, pelo menos, uma sequência seleccionada de um dos grupos de sequências de iniciadores consistindo de: SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 89, e SEQ ID N°: 94, quando um dos locus no conjunto é G475; SEQ ID N°: 90, SEQ ID N° : 91 , SEQ ID N° : 92, SEQ ID N° : 93, SEQ ID N°: 95 e SEQ ID N°: 96, quando um dos locus no conjunto é S159; SEQ ID N° : 99 e SEQ ID N° : 100, quando um dos locus no conjunto é C221;e SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 87 e SEQ ID N°: 105, quando um dos locus no conjunto é o locus Amelogenina.
5. Método da reivindicação 1, em que os alelos amplificados são avaliados por comparação dos alelos com um padrão de tamanhos, em que o padrão de tamanhos é seleccionado do grupo de padrões de tamanhos consistindo num marcador de ADN e de uma escala alélica específica para o locus.
6. Método da reivindicação 1 em que a amostra de ADN a ser analisada foi preparada a partir de tecido humano, em que o tecido humano é seleccionado do grupo de tecido humano consistindo de sangue, sémen, células vaginais, cabelo, saliva, urina, osso, amostra bucal, fluido amniótico contendo células da placenta ou células fetais e misturas de qualquer dos tecidos listados acima. Lisboa, 30 de Novembro de 2012 3