CN105420233A - Hbb基因突变和hla分型检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于高通量测序技术检测HBB基因突变和HLA分型的方法及相应的试剂盒。其中，所用的引物组合物包括特异性扩增人类胚胎β-地中海贫血HBB基因上下游1Mb范围内紧密连锁的多态性位点（SNP）的引物和特异性扩增人类白细胞抗原系统HLA-A基因上游、HLA-A基因与HLA-B基因之间、HLA-B基因与HLA-DRA基因之间、HLA-DRA基因与HLA-DQB1基因之间以及HLA-DQB1基因下游范围内紧密连锁的多态性位点（SNP）的引物。本发明的方法具有通用性、多位点SNP测序、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点。

Description

HBB基因突变和HLA分型检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因组突变检测领域，特别涉及HBB基因突变和白细胞抗原系统分型的检测。

背景技术

β-地中海贫血是在全世界范围最常见的单基因疾病，它是由于β珠蛋白基因突变导致β链的合成受到部分或完全抑制而引起的溶血性疾病。根据β珠蛋白基因表达的受抑制程度，β-地中海贫血分为两种类型：β珠蛋白链完全不能合成者称为β0地中海贫血，β-珠蛋白链尚能合成但合成量减少者称为β+地中海贫血。β-地中海贫血以小细胞低色素性溶血型贫血肝脾肿大(脾大明显)、骨髓扩增发育迟缓合并感染、骨骼改变等为主要临床症状。β-地中海贫血在南方地区最为高发，广东、广西β-地中海贫血携带率分别为2.54％和6.78％(ChenW,ZhangX,ShangX,etal.Themolecularbasisofbeta-thalassemiaintermediainsouthernChina:genotypicheterogeneityandphenotypicdiversity.BMCMedGenet.2010Feb25；11:31)。迄今为止，世界范围已发现800多种β地中海贫血的基因突变类型(http://globin.cse.psu.edu/cgi-bin/hbvar/query_vars3)。

目前国内外对β-地中海贫血的治疗分为产前诊断、规范性长期输血和去铁治疗、HLA相合的造血干细胞移植和脾切除术等(刘越,米佳,黄耀江.人类白细胞抗原基因研究进展[J].生物学教学.2007(11))。输血治疗存在铁负荷导致的并发症，骨髓移植则一直无法摆脱免疫排斥和移植抗宿主病的并发症，而造血干细胞具有重建个体造血系统的全能性和自我更新的能力，理论上将正常的β－珠蛋白基因导入造血干细胞并输回体内，使之获得适宜表达，患者将获得终生治疗。随着临床的需要、分子细胞生物学及分子生物学技术的快速发展，PGD已经从避免基因病遗传扩展到以移植造血干细胞为目的对植入前胚胎进行人类白细胞抗原(humanleucocyteantigen，HLA)分型的非疾病性检测(VerlinskyY,RechitskyS,SharapovaT,etal.PreimplantationHLAtesting.JAMA2004May；291(17):2079-85)。在器官移植和造血干细胞移植中，当同种异基因骨髓移植时，HLA不同时可引起免疫排斥反应。由于HLA具有高度多态性，供受者HLA的差异决定了同种异体器官移植后几乎不可避免地发生免疫排斥反应。配型匹配点越多，移植术后的效果就越理想，受者存活时间就越长。如果匹配的点少，移植后发生急、慢性宿主抗移植物反应(hostversusgraftreaction，HVGR)和移植物抗宿主病(GVHD)的机率明显增加，存活时间短，因此在器官移植、造血于细胞移植中HLA配型的意义重大。正是因为寻找HLA基因型一致的供者极其困难，近年国外有报道β-地中海贫血这种严重致残、致死而又无法根治的疾病在有需要进行造血干细胞移植患儿的家庭中，对植入前胚胎进行HLA配型联合或不联合基因遗传病的PGD检测，选择与患儿HLA基因型一致且正常的纯合子(不携带致病基因)或者杂合子(携带隐性致病基因)胚胎移植，创造一个救助者同胞(SaviourChild，SC)，分娩时使用SC的脐血或者骨髓用于治疗现存患儿，为治疗此类患者提供一种新的、效果可能更理想的途径(Tur-KaspaI,JeelaniR.ClinicalguidelinesforIVFwithPGDforHLAmatching.ReprodBiomedOnline2015Feb；30(2):115-9)。

β珠蛋白基因簇位于11号染色体短臂上，覆盖50kb，其结构如图1。从5'→3'分别为胚胎ε球蛋白基因、胎儿Gγ和Aγ球蛋白基因、假基因φβ、δ和β球蛋白基因。每一编码球蛋白的基因均包含3个外显子、2个内含子。在ε球蛋白基因上游20kb处，有β球蛋白基因的定位控制序列(locus-control-region，LCR)，它包括5个红细胞系特异的核酸酶高酶位点，调控着其下游基因的表达(OlivieriNF,Thebeta-thalassemias.NEnglJMed.1999Jul8；341(2):99-109)。

β珠蛋白肽链含146个氨基酸，由β珠蛋白基因所编码。β珠蛋白基因全长1605bp，含3个外显子和2个内含子。β-地中海贫血的分子基础是β珠蛋白基因的点突变或核苷酸序列缺失，造成β珠蛋白链合成的减少或缺失。中国人群中已发现的大部分突变集中在基因的3'端调控区、外显子1、内含子1和外显子2中，以CD41-42(-CTTT)、IVS-II-654(C>T)、CD17(A>T)、TATA盒nt-28(A>G)、CD71-72(+A)和nt-29(A>G)这6种突变类型较为常见，约占中国人β-地中海贫血基因突变总数的93.3％(杜传书.地中海贫血研究的现状与未来[J].中华医学遗传学杂志,1996,13(5):257)。

β-地中海贫血的遗传方式为常染色体隐性遗传，即两条染色体上的HBB基因均存在缺陷时才会导致β-地中海贫血。一条染色体上的HBB基因正常，而另一条染色体上的HBB基因存在缺陷不会致病，此时称之为β-地中海贫血携带者。若男女双方均为β-地中海贫血携带者，生育β-地中海贫血患儿的风险为25％(图2)。

人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)系统是一群与人体免疫应答反应密切相关的基因簇，位于第6号染色体短臂6p21.31区，长约3600kb，占人类基因组的1/3000，现已完成其全序列的测定(Completesequenceandgenemapofahumanmajorhistocompatibilitycomplex.TheMHCsequencingconsortium.Nature.1999Oct28；401(6756):921-3)。它是人类基因组中至今为止最复杂、最具多态性的遗传体系，其等位基因的多态性影响着免疫应答和抗原肽的递呈等。

HLA的基因结构HLA复合体目前分为HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ和HLA-Ⅲ三类基因(见图3)。HLA-Ⅰ类基因区靠近染色体顶端，长约1500kb，区内基因被命名为经典的HLA-A、B、C和非经典的HLA-E、F、G等基因。HLA-Ⅱ类基因最靠近染色体着丝点，长约1000kb，被命名为HLA-D。HLA-D又划分为HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP等亚区，此外还有DMA、DMB、LMP2、LMP7、TAP1以及TAP2等基因位点。HLA-Ⅲ类基因区位于Ⅱ类基因与Ⅰ类基因区之间，长约1000kb，已检出40多个基因，包括编码补体蛋白C2、因子B、C4A和C4B等基因(BodmerJG,MarshSG,AlbertEDetal.1995.NomenclatureforfactorsoftheHLAsystem.TissueAntigens,46(1):1-18)。

β-地中海贫血基因检测方法有：限制性片段长度多态性连锁分析、探针斑点杂交技术、反向点杂交方法、缺口PCR(Gap-PCR)、扩增不应突变系统、单链构向多态性、DNA芯片技术、DNA序列测定法、实时荧光定量、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、高效液相色谱技术(HPLC)。当父母双方携带有明确的HBB基因致病位点，可以通过产前干预措施阻止致病位点向下一代传递。HLA基因分型方法有：PCR-SSOP(序列特异性寡核苷酸探针)、PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)、PCR-SSP(序列特异性引物)、PCR-SNP(单核苷酸多态性)、SBT(直接测序分型)和基因芯片。但目前这些基因检测方法灵敏度低，只适合于采用新生儿外周血作为检测对象，不适合针对单细胞的移植前筛查。因此急需开发一种检测试管婴儿技术中胚胎HBB基因突变检测和HLA基因分型方法的新方法。

采用试管婴儿技术能有效帮助有需要进行造血干细胞移植的β-地中海贫血患儿家庭。选择与患儿HLA基因型一致且正常的纯合子(不携带致病基因)或者杂合子(携带隐性致病基因)胚胎移植，创造一个救助者同胞(SaviourChild，SC)，分娩时使用SC的脐血或者骨髓用于治疗现存患儿，为治疗此类患者提供一种新的、效果可能更理想的途径。

试管婴儿技术是将卵子与精子取出后置于特定的培养液内培养、受精，受精卵在恒温孵箱中发育为胚胎后移植回母体子宫，最终发育成胎儿。挑选健康胚胎移植并且与患儿HLA基因型一致是成功治疗造血干细胞移植的β-地中海贫血患儿的关键因素。

发明内容

本发明设计了一种基于高通量测序技术检测HBB基因突变和HLA分型的方法。

本发明的第一方面提供了一种检测HBB基因突变的引物组合物，其包括特异性扩增人类胚胎β-地中海贫血HBB基因上下游1Mb范围内紧密连锁的多态性位点(SNP)的引物。

优选地，所述特异性扩增人类胚胎β-地中海贫血HBB基因上下游1Mb范围内紧密连锁的多态性位点(SNP)的引物的上下游序列分别选自SEQIDNO:2n-1和SEQIDNO:2n，其中n为1～69的自然数。

在一个特定的实施方案中，所述检测HBB基因突变的引物组合物包括SEQIDNO:1-138的全部引物序列。

本发明的第二方面提供了一种HLA分型的引物组合物，其包括特异性扩增人类白细胞抗原系统HLA-A基因上游、HLA-A基因与HLA-B基因之间、HLA-B基因与HLA-DRA基因之间、HLA-DRA基因与HLA-DQB1基因之间以及HLA-DQB1基因下游范围内紧密连锁的多态性位点(SNP)的引物。

优选地，所述特异性扩增人类白细胞抗原系统HLA-A基因上游、HLA-A基因与HLA-B基因之间、HLA-B基因与HLA-DRA基因之间、HLA-DRA基因与HLA-DQB1基因之间以及HLA-DQB1基因下游范围内紧密连锁的多态性位点(SNP)的引物的上下游序列分别选自SEQIDNO:2n-1和SEQIDNO:2n，其中n为70～266的自然数。

在一个特定的实施方案中，所述HLA分型的引物组合物包括SEQIDNO:139-532的全部引物序列。

本发明的第三方面提供了一种HBB基因突变和HLA分型的检测产品，其由本发明的引物组合物制备得到。

在一个特定的实施方案中，所述检测产品为试剂盒，其包括：

1)用于文库构建的反应试剂，包括：特异性结合引物、通用PCR引物、多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs、反应缓冲液；

2)用于纯化PCR的反应产物的试剂；优选地，其包括产物纯化磁珠及缓冲液。优选地，所述试剂盒还包括：

3)阴性质控品；

4)阳性质控品。

本发明的第四方面提供了一种HBB基因突变和HLA分型的检测方法，其包括以下步骤：

1)提取体外培养的囊胚滋养层细胞经全基因组扩增；

2)磁珠纯化全基因组扩增产物；

3)提取夫妻双方全血DNA；

4)利用本发明的引物组合物通过多重PCR扩增单体型目标区域；

5)纯化PCR产物，并测序；

6)将测定的胚胎和夫妻3方的DNA序列进行比对，判断胚胎的单倍体型。

其中，步骤1)中所述囊胚滋养层细胞全基因组扩增方法优选为多重置换扩增(MDA)。

步骤5)中采用IontorrentPGM或IontorrentProton进行测序。

步骤6)中利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列，用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组，最后分析目标位点覆盖倍数和基因型。

本发明的第五方面提供了一种造血干细胞移植的胚胎移植前诊断方法，其使用本发明的方法确定胚胎的HBB基因突变情况和HLA分型情况。

本发明的优越性主要有以下几点：

(1)通用性：本发明采用了HBB基因69个SNP和HLA区域197个SNP进行分析，可用于有需要进行造血干细胞移植的β-地中海贫血患儿家庭胚胎移植前诊断。

(2)多位点SNP测序：基于第二代测序技术，本发明可以对HBB基因附近和HLA区域的多个SNP进行分析，不需依赖已知的探针和设计探针。

(3)高通量：基于高通量测序技术，本发明可以高通量地处理HBB突变和HLA分型的单倍体，通过在每个样品上加上不同的标签序列，可以一次地对大量样品进行分析。

(4)成本低：随着测序技术的不断发展和测序成本的不断降低，以及一次对大量样品进行分析，本发明对HBB突变和HLA分型的单倍体分析的成本也在不断下降。

(5)高灵敏度：本发明可用于3～5个细胞的分析，因此适合于试管婴儿技术中胚胎移植前的检测。

(6)特异性强：本发明选取千人基因组计划数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)中HBB基因上下游1Mb范围内CHB(北方汉人)和CHS(南方汉人)最小等位基因频率均大于0.2的高频突变位点，去除多聚核苷酸(polyN)和位点上下游50bp序列中GC含量>70％的多态性位点，并选择unique比对到人类基因组hg19的60个SNP突变位点和HBB基因作为目标区域。同样的方法，根据2011年欧洲生殖委员会PGD组指导原则(HartonGL,DeRyckeM,FiorentinoFetal.ESHREPGDconsortiumbestpracticeguidelinesforamplification-basedPGD.HumReprod.2011Jan；26(1):33-40)。分别在HLA-A基因上游、HLA-A基因与HLA-B基因之间、HLA-B基因与HLA-DRA基因之间、HLA-DRA基因与HLA-DQB1基因之间以及HLA-DQB1基因下游及各自基因上共选择197个高频突变位点作为目标区域。登陆https://www.ampliseq.com/网站分别提交HBB和HLA目标位点及区域设计引物，这些引物具有很高的特异性。

附图说明

图1β珠蛋白基因簇结构。

图2β地中海贫血遗传方式。X.常规“2+1+1”家系，父母均为携带者，子代可能为以下四种基因型(A1：正常人；A2、A3：携带者；A4：患者)。

图3HLA结构示意图。

图4β-地中海贫血症家系单体型结果。E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9为该家系胚胎，不同单体型元件用不同灰度标示：F1()和F2()为父亲HBB基因上下游1M区域的两条单体型链，M1()和M2()为母亲HBB基因上下游1M区域的两条单体型链，D先证者为β-地中海贫血症HBB基因β654/β17双重杂合子突变，因此可以推断D先证者HBB基因上下游1M的两条HBB突变链分别来自父母双方的β17和β654突变链。“透明标底”(C)标示HBB突变碱基位置，“反色标底”()表示该链在此处发生基因脱扣。“？”表示该链在此处未检测到读段。

图5人类白细胞抗原HLA家系单体型结果。E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9为该家系胚胎，不同单体型元件不同颜色标示，F1()和F2()为父亲HBB基因上下游1M区域的两条单体型链，M1()和M2()为母亲HBB基因上下游1M区域的两条单体型链，D先证者人类白细胞抗原HLA基因区域的两条HLA链分别来自母亲的M1和父亲的F1链。“反色标底”()标示该链在此处发生基因脱扣。“？”表示该链在此处未检测到读段。

具体实施方式

在本发明中，读段(reads)是指测序获得的序列片段。

在本发明中，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

在本发明中，单体型(Haplotype)是指位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合，又称单倍体型或单元型。

本发明中，基因组DNA的获取是当胚胎发育至囊胚期时取出外围滋养层细胞3～5个，运用全基因组扩增方法对细胞中基因组DNA进行富集。

在本发明中，目标区域DNA分子富集采用的是多重PCR扩增的方法。具体原理和方法请参见生厂商提供的说明书，将DNA分子富集为比较集中的一定大小的片段。在本发明的一个特定实施方案中，DNA片段大小在125～275bp的大小。

在本发明中，针对人类HBB基因及HLA区域，分别设计69对和197对序列特异性引物。这些引物的特点为：(1)在目标染色体上序列唯一；(2)位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度；(3)HBB基因69对引物混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中能进行69重反应。HLA区域197对引物混合到1个PCR反应管中，在1个PCR反应管中能进行197重反应。

在本发明中，所采用的测序方法可以为高通量测序方法。DNA片段长度分布在125～275bp之间。在本发明的一个特定实施方案中，测序平台为IonTorrentPGM，得到DNA长度分布在125～275bp之间的DNA序列分子。

在本发明中，测序深度可以是300～3000×，即每条特异PCR扩增产物被测序300～3000次，例如在本发明的一个特定实施方案中，测序深度为1000，即该条特异PCR扩增产物被测序1000次。

本发明中，当待测的DNA分子来自多个受试样品时，每个样品可以被加上不同的标签序列(barcode)，以用于在测序过程中进行样品的区分(MicahHamady,JeffreyJWalker,JKirkHarrisetal.Error-correctingbarcodedprimersforpyrosequencinghundredsofsamplesinmultiplex.NatureMethods,2008,5(3))，从而实现同时对多个样品进行测序。

本发明中，基因组参考序列可以来自公共数据库。例如，人类基因组序列可以是NCBI或者ucsc数据库中的人类基因组参考序列。

本发明中，序列比对可以通过任何一种序列比对程序，例如本领域技术人员可获得的TorrentMappingAlignmentProgram(TMAP)和BWA(Burrow-Wheeler-Aligner)进行比对，将读段与参考基因组序列比对，得到读段在参考基因组上的位置。

本发明中，利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列，用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组，最后分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。

在本发明的一个特定实施方案中，HBB基因突变和HLA分型的检测方法包括以下步骤：

DNA提取及测序：按照MDA全基因组扩增法(Qiagen试剂盒)提取细胞DNA后，按照IonAmpliSeq^TMLibraryKits2.0标准建库流程进行建库。在这个过程中，胚胎MDA全基因组扩增通过目标区域多重PCR扩增为集中在125～275bp左右的DNA分子，两端加上测序所用接头，每个样品被加上不同的标签序列(barcode)，从而在一次测序得到的数据中可以使多个样品的数据区分开。

比对及统计：利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列，用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组，最后分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。

本发明用于对适用人群进行β-地中海贫血胚胎移植前诊断，有利于提供遗传咨询和提供临床决策依据。本发明适用人群可以是β-地中海贫血携带者和患者。

下面将对本发明实施例中的方案进行清楚完整的描述，但本发明并不受其限制，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，基于本发明的实施例，本领域技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围；同样地，实施例的附图仅仅是本发明一部分实施例的附图，本领域技术人员根据这些附图所获得的其他附图，也都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例9例胚胎β-地中海贫血及人类白细胞抗原HLA移植前诊断

1.建库和测序

在一个家系中母亲生出1例β-地中海贫血症患儿，经基因检测该β-地中海贫血症患儿为β-地中海贫血HBB基因β654/β17双重杂合子突变，父方为β17杂合携带者，母方为β654杂合携带者。按照全基因组扩增方法，获取该家系9例胚胎样本细胞DNA，用Qubit(Invitrogen,theQuant-iTTMdsDNAHSAssayKit)定量，并分离10ng进行后续实验。

按照IonAmpliSeq^TMLibraryKits2.0标准建库流程进行建库。简而言之，多重PCR扩增产物的DNA分子两端加上测序所用的接头，在一定条件下使核酸分子成簇生长，然后在IonTorrentPGM上测序，得到片段长度分布在125bp～275bp目标区域的DNA片段序列。

本实施例中使用的PCR引物系统为表1所示的HBB基因引物(其中，每一对正向引物和反向引物的序列分别如SEQIDNO:2n-1和SEQIDNO:2n所示，n为1～69的自然数)和表2所示的HLA分型引物(其中，每一对正向引物和反向引物的序列分别如SEQIDNO:2n-1和SEQIDNO:2n所示，n为70～266的自然数)。

表1HBB基因引物

表2HLA分型引物

对于获自上述9例胚胎细胞的DNA样品按照IonTorrent官方公布的测序说明书进行操作。

2.比对与统计

利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列、用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组、分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。

3.数据分析

分析HBB基因69个SNP、β⁶⁵⁴、β¹⁷及HLA基因197个SNP在染色体上的位置和基因型，通过merlin-1.1.2构建单体型，胚胎中不符合遗传规律的纯和基因型判断为等位基因脱扣，然后利用已经建好的单体型对胚胎的单体型进行是否致病性及是否配型合适判断。

4.结果

选取HBB基因区域及其侧翼10bp作为目标区域，另外在该基因上下游1M区域内选择59个高度紧密连锁的SNP作为遗传标记构建β-地中海贫血症家系单体型(单体型结果如图4)。根据β-地中海贫血症家系单体型结果可以推断：E1为致病胚胎，E2胚胎为父源携带者胚胎、E3为致病胚胎，E4胚胎为父源携带者胚胎，E5为正常胚胎，E6为致病胚胎，E7胚胎为母源携带者胚胎、E8为正常胚胎、E9为正常胚胎。

选取HLA-A基因上游，HLA-A与HLA-B之间，HLA-B与HLA-DRA之间，HLA-DRA与HLA-DQB1之间，以及HLA-DQB1下游作为目标区域，选择197个高密度紧密连锁的SNP作为遗传标记构建人类白细胞抗原HLA家系单体型(单体型结果如图5)。根据人类白细胞抗原HLA家系单体型结果可以推断：胚胎E4、E5、E6、E8配型合适，E1、E2、E3、E7、E9配型失败。

利用造血干细胞治疗选择β-地中海贫血患儿，选择与患儿HLA基因型一致且正常的纯合子(不携带致病基因)或者杂合子(携带隐性致病基因)进行胚胎移植，创造一个救助者同胞(SaviourChild，SC)，分娩时使用SC的脐血或者骨髓用于治疗现存患儿。根据以上实验结果：E4、E5、E8胚胎适合移植。

Claims (13)

1.一种检测HBB基因突变的引物组合物，其特征在于包括特异性扩增人类胚胎β-地中海贫血HBB基因上下游1Mb范围内紧密连锁的多态性位点(SNP)的引物。

2.根据权利要求1所述的引物组合物，其中，所述HBB基因为人类HBB基因。

3.根据权利要求1所述的引物组合物，其中，所述特异性扩增人类胚胎β-地中海贫血HBB基因上下游1Mb范围内紧密连锁的多态性位点(SNP)的引物的上下游序列分别选自SEQIDNO:2n-1和SEQIDNO:2n，其中n为1～69的自然数。

4.根据权利要求1所述的引物组合物，其包括SEQIDNO:1-138的全部引物序列。

5.一种HLA分型的引物组合物，其特征在于包括特异性扩增人类白细胞抗原系统HLA-A基因上游、HLA-A基因与HLA-B基因之间、HLA-B基因与HLA-DRA基因之间、HLA-DRA基因与HLA-DQB1基因之间以及HLA-DQB1基因下游范围内紧密连锁的多态性位点(SNP)的引物。

6.根据权利要求5所述的引物组合物，其中，所述HLA为人类HLA。

7.根据权利要求5所述的引物组合物，其中，所述特异性扩增人类白细胞抗原系统HLA-A基因上游、HLA-A基因与HLA-B基因之间、HLA-B基因与HLA-DRA基因之间、HLA-DRA基因与HLA-DQB1基因之间以及HLA-DQB1基因下游范围内紧密连锁的多态性位点(SNP)的引物的上下游序列分别选自SEQIDNO:2n-1和SEQIDNO:2n，其中n为70～266的自然数。

8.根据权利要求5所述的引物组合物，其包括SEQIDNO:139-532的全部引物序列。

9.一种检测HBB基因突变和HLA分型的引物组合物，其特征在于包括权利要求1-4任一项所述的引物组合物和权利要求5-8任一项所述的引物组合物。

10.一种HBB基因突变和HLA分型的检测产品，其由权利要求1-4任一项所述的引物组合物和权利要求5-8任一项所述的引物组合物制备得到。

11.根据权利要求10的检测产品，其为检测试剂盒。

12.根据权利要求11的检测产品，其包括：

(1)用于文库构建的反应试剂，包括：特异性结合引物、通用PCR引物、多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs、反应缓冲液；

(2)用于纯化PCR的反应产物的试剂；优选地，其包括产物纯化磁珠及缓冲液。

13.根据权利要求12的检测产品，其还包括：

(3)阴性质控品；

(4)阳性质控品。