CN101921854B

CN101921854B - 一种黄牛chemerin基因的单核苷酸多态性检测方法

Info

Publication number: CN101921854B
Application number: CN2010102556396A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 张亚; 朱金龙; 徐瑶; 蓝贤勇; 雷初朝
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2010-08-18
Filing date: 2010-08-18
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-08-18
Also published as: CN101921854A

Abstract

本发明公开了一种黄牛chemerin基因单核苷酸多态性的检测方法，其基因多态性包括：在黄牛chemerin基因第868位为A或G的碱基多态性；在黄牛chemerin基因第1021位为G或A的碱基多态性。上述黄牛chemerin基因的单核苷酸多态性为：以包含chemerin基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对(包括P和newP)为引物，PCR扩增黄牛chemerin基因；用限制性内切酶PvuII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛chemerin基因第868位和第1021位的单核苷酸多态性；该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生产性状密切相关的分子遗传标记，中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种黄牛chemerin基因的单核苷酸多态性检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛chemerin基因第868位和第1021位单核苷酸多态性的检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNPs包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

最近大量的研究表明脂肪组织不仅仅是一个能量储藏器官，它还能分泌许多脂肪因子，这些脂肪因子呈网络式的共同调控着机体的代谢活动，研究表明它们与二型糖尿病，肥胖，胰岛素抵抗及代谢综合征密切相关(BozaogluK，Bolton K，McMillan J，Zimmet P，Jowett J，Collier G，et al.Chemerin is anovel adipokine associated with obesity and metabolic syndrome.Endocrinology2007；148：4687-94)。

Chemerin也称作他扎罗汀诱导基因2(TIG2)或者视黄酸受体反应蛋白2(RARRES2)，是2007年日本科学家发现的一个新的脂肪细胞因子。它主要是在脂肪组织中大量表达，其它组织：肝脏，肺，脑垂体以及卵巢附睾中也有表达。黄牛chemerin基因定位于4号染色体上，由4个外显子和3个内含子组成，它的CDS区长489bp，共编码162个氨基酸。

Chemerin基因在脂肪细胞分化早期表达水平明显上调，一些体外研究表明chemerin促进脂肪细胞的分化并调节脂肪细胞的代谢(Roh SG，Song SH，Choi KC.Chemerin-a new adipokine that modulates adipogenesis via its ownreceptor.Biochem Biophys Res Commun.2007；362：1013-1018.)。Chemerin还可以通过自分泌和旁分泌的途径调节3T3-L1脂肪细胞对胰岛素的敏感度，增强胰岛素信号，促进细胞对葡萄糖的吸收(Takahashi M，Takahashi Y，et al.Chemerin enhances insulin signaling and potentiates insulin-stimulated glucoseuptake in 3T3-L1 adipocytes.FEBS Lett 2008；582：573-8.)。

目前，对于chemerin基因的研究多集中在免疫及对脂肪细胞的功能调控方面。在人上仅有一篇关于chemerin基因遗传变异的研究(Mussig K，StaigerH，Machicao F，Thamer C，Machann J，Schick F，Claussen CD，Stefan N，FritscheA，Haring HU.RARRES2，encoding the novel adipokine chemerin，is a geneticdeterminant of disproportionate regional body fat distribution：A comparativemagnetic resonance imaging study.Metabolism.2009；58：519-524.)，但是至今未见黄牛chemerin基因遗传变异或SNP研究的报道。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛chemerin基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛chemerin基因单核苷酸多态性的方法，以包含chemerin基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛chemerin基因；用限制性内切酶PvuII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果，分出6种不同的带型，AA带型表现为116bp和186bp条带，BB带型表现为116bp和153bp条带，CC带型只表现为299bp条带，AB带型表现为116bp、153bp和186bp条带，AC带型表现为116bp、186bp和299bp条带，BC带型表现为116bp、153bp和299bp条带。将这6种带型相应个体的PCR产物送测序，得到黄牛的chemerin基因的部分序列，将这些序列与NCBI公布的序列进行比较，发现在第868位和第1021位存在SNP多态性。

所述的引物对P为：

正向引物：5’-CGGAGCCCACCAGACAGG-3’18nt；

反向引物：5’-CAGCGGGCAGCAGCACAC-3’18nt；

将PCR产物送测序，根据测序结果及突变情况，在第1021位之后重新设计下游引物，并人为引入PvuII酶切位点，以引物对newP为引物，PCR扩增黄牛chemerin基因；

所述的引物对newP为：

上游引物：5’-CGGAGCCCACCAGACAGG-3’ 18nt；

下游引物：5’-ctctgggctggcgctcaccgtgtcAgc-3’27nt；

用PvuII限制性内切酶消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果同时鉴定黄牛的chemerin基因第868位和第1021位的碱基多态性。

所述的PCR扩增反应程序为：

95℃预变性5min；35个循环的94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶质量浓度为3.0％。

根据琼脂糖凝胶电泳结果同时鉴定黄牛的chemerin基因第868位和第1021位的碱基多态性存在三种单倍型：A(G-G)，B(G-A)和C(A-G)。这三种单倍型构成六种基因型AA(G-G，G-G)，BB(G-A，G-A)，CC(A-G，A-G)，AB(G-G，G-A)，AC(G-G，A-G)，和BC(G-A，A-G)。

本发明提供的黄牛chemerin基因单核苷酸多态性检测方法，第868位G到A的转换突变造成一个PvuII自然酶切位点的产生，而针对第1021位G到A的转换突变，通过引物设计人为的在下游引物的3’端引入碱基错配，当由G突变成A时，PCR扩增chemerin基因后在错配位置形成限制性内切酶PvuII识别位点，而突变没有发生时，PCR扩增chemerin基因后不能形成PvuII识别位点；通过电泳检测分型可以准确、快速、方便的同时检测到chemerin基因在第868位和第1021位的单核苷酸多态性。

与现有技术相比，本发明把测序技术筛查SNP和CRS-RFLP技术结合起来解决了SSCP的不稳定性和普通RFLP的局限性，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用在DNA水平上筛查和检测与黄牛生产性状密切相关的遗传标记，可用于黄牛的分子育种。

本发明对5个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛部分生长性状(初生重、体重和日增重)进行关联分析，为chemerin基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1为黄牛chemerin基因包含第868位和第1021位的多态位点的299bpPCR产物的PvuII酶切电泳结果；

图2为黄牛chemerin基因AA基因型PCR扩增产物测序图；

图3为黄牛chemerin基因AG基因型PCR扩增产物测序图；

图4为黄牛chemerin基因GG基因型PCR扩增产物测序图；

图5为黄牛chemerin基因GG基因型PCR扩增产物测序图；

图6为黄牛chemerin基因AG基因型PCR扩增产物测序图；

图7为黄牛chemerin基因AA基因型PCR扩增产物测序图。

具体实施方式

本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛chemerin基因第868位和第1021位同义密码子突变可能产生编码蛋白表达水平发生变化的单核苷酸多态性进行检测，下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、黄牛chemerin基因含第九外显子区域PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛(NC_007302.4)序列为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增包含黄牛chemerin基因第九外显子区域的PCR引物，其引物序列如下：

正向引物：5’-CGGAGCCCACCAGACAGG-3’18nt；

反向引物：5’-CAGCGGGCAGCAGCACAC-3’18nt；

以上述引物对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛chemerin基因(NC_007302.4序列)第一外显子区域及部分内含子第750～1190bp的441bp的基因片段；对扩增的片段进行测序鉴定后，发现当第868bp(即chemerin基因CDS区第12位)的G突变为A时，导致编码第4nt的氨基酸密码子由CTG突变为CTA，从而形成了亮氨酸的同义突变；并且这一突变形成了限制性内切酶PvuII的酶切位点。而第1021位的突变无自然酶切位点形成，不能通过直接酶切检验，而如果在第1021位处人工设计PCR引物错配，由A错配为T；当该位点由G突变成A时，newP引物扩增chemerin基因产物的第1020bp～1025bp序列为CAGCTG，形成了限制性内切酶PvuII的酶切位点，而突变没有发生时，PCR扩增chemerin基因后不能形成PvuII识别位点；这样就可以对两个位点的SNPs多态性同时进行检测；因此上游引物不变，而在第1021位附近重新设计下游引物；PCR扩增引物newP为：

上游引物：5’-CGGAGCCCACCAGACAGG-3’ 18nt；

下游引物：5’-ctctgggctggcgctcaccgtgtcAgc-3’27nt；

NewP引物扩增片段大小为299bp，用PvuII消化PCR产物，消化后片段的电泳检测如图1所示，其中，泳道从左向右分别为带型CC、带型AB、带型AA、带型AA、带型AA、M、带型AC、带型BB、带型BC、带型AA和带型CC。泳道M为Marker(100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp)。对扩增的片段进行测序鉴定后，其中，第857bp～1030bp的序列为如下所示：

ATGTGGCAG

CTGCTCCCCCTGGCCCTGGGGCTGGGCACCATGGGCTTGGGCAGGGCGGAGCTCACGACGGCCCAGCACCGGGGCCTGCAGGTGGCCCTGGAGGAGTTCCACAAGCATCCACCCGTGCTGTGGGCCTTCCAGGTGACCAGCGTGGACAAT GCAGACACG

2、以引物对P、引物对NewP进行PCR扩增待测黄牛的chemerin基因片段

(1)、黄牛样本的采集

本发明具体以5个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：河南南阳牛(225)，陕西秦川牛(219)，河南平顶山市郏县红牛(389)；山东鲁西牛(165)；吉林草原红牛(220)。

表1黄牛样本的采集

(2)血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24∶1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12)5℃保温10h左右；

13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次；

14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

(3)PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorf离心管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行PvuII酶切消化反应。

1)PCR总反应体系为25μL，见表2；

表2本发明的PCR反应体系

体系成分	体积(μL)
		10×PCR缓冲液(MBI)	2.5
MgCl₂(25mmol/L)	1.5
		dNTPs(2.5mmol/L)	2.5
上游引物(10pmol/L)	0.25
		下游引物(10pmol/L)	0.25
Taq DNA聚合酶(0.5U/μL)	2.0
		DNA模板(50ng/μL)	1.0
灭菌超纯水(H₂O)	15.0
		总体积	25.0

2)PCR总反程序，见表3；

表3本发明的PCR反应程序

3)PvuII酶切反应体系25μL，见表4。

表4本发明的PvuII酶切反应体系

体系成分	体积(μL)
		PCR产物	12.5
10×缓冲液(含BSA)	2.5
		Pvu II(10U/μL)	1.0
灭菌超纯水(H₂O)	9.0
		总体积	25.0

注：酶切消化条件为37℃，5～10h。

3、PCR产物酶切及RFLP检测

1)制作质量浓度2％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压电泳30min，电泳结束后EB染色；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000 凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性：

用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断并区分出不同的带型：

Chemerin基因的第868bp碱基为G时，newp扩增的chemerin基因产物的第863bp～868bp序列为CAGCTG，该序列正是限制性内切酶PvuII的识别位点，当由G突变为A时，此处就不存在PvuII的识别位点；chemerin基因的第1021bp碱基由G突变为A时，newp扩增的chemerin基因产物的第1020bp～1025bp为CAGCTG，PvuII将能识别该位点，当没有发生突变时，此处就不存在PvuII的识别位点；所以扩增一次PCR，用一种限制性内切酶就可以同时分析两个SNPs。

由于黄牛为2倍体，所以黄牛基因组的chemerin基因的第868位和第1021位的SNP，经过PvuII酶切及3％琼脂糖凝胶电泳后，可显示出不同基因型的条带，结果为：

如图1所示，泳道从左向右分别为带型CC、带型AB、带型AA、带型AA、带型AA、M、带型AC、带型BB、带型BC、带型AA和带型CC，其中泳道M为Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。纯合子AA型的两条DNA链在第868位都能被PvuII切开，而第1021位均不能被切开，所以表现为116bp和186bp的条带；纯合子BB型的两条DNA链在第868位和第1021位均能被PvuII切开，所以表现为116bp和156bp的条带；纯合子CC型的两条DNA链在第868位和第1021位均不能被PvuII切开，所以仅表现为299bp的条带；而杂合子AB型的两条DNA链在第868位都能被PvuII切开，而第1021位一条能被切开，另外一条不能被切开，所以表现为116bp、153bp和186bp的条带；杂合子AC型的两条DNA链在第868位一条能被PvuII切开，另外一条不能被切开，而第1021位都不能被切开，所以表现为116bp、186bp和299bp的条带；杂合子BC型的两条DNA链在第868位一条能被PvuII切开，另外一条不能被切开，同样第1021位一条能被PvuII切开，另外一条不能被切开，所以表现为116bp、153bp和299bp的条带。根据条带的个数和条带的大小，将六种基因型区分开，从而检测这两处的SNP多态性。

4、不同基因型个体PCR产物的纯化和测序

PCR-RFLP检测之后，挑选出不同基因型个体，进行PCR扩增，并分别对PCR产物进行切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2min。12000rpm离心1min收集DNA溶液。

8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

根据琼脂糖凝胶电泳结果，把不同基因型个体的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含116bp和186bp条带的基因型为AA个体，其第868位和第1021位的测序图的确表示为(G-G，G-G)；含116bp和153bp条带的基因型为BB个体，其第868位和第1021位的测序图的确表示为(G-A，G-A)；只含299bp条带的基因型为CC个体，其第868位和第1021位的测序图的确表示为(A-G，A-G)；含116bp、153bp和186bp条带的基因型为AB个体，其第868位和第1021位的测序图的确表示为(G-A，G-G)；含116bp、186bp和299bp条带的基因型为AC个体，其第868位和第1021位的测序图的确表示为(G-G，A-G)；含116bp、153bp和299bp条带的基因型为BC个体，其第868位和第1021位的测序图的确表示为(G-A，A-G)；如图2、3、4、5、6和7所示。

5、黄牛chemerin基因SNP位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+......+N_Aan)/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n 个互不相同的复等位基因。

本研究所涉及的等位基因为A和G，所以具体的基因频率计算公式为：

P_A＝(2N_AA+N_AG)/2N

P_G＝(2N_GG+N_AG)/2N

式中，P_A，P_G分别表示等位基因A和G等位基因的频率，N_AA、N_AG和N_GG分别表示AA、AG和GG基因型的个体数量，N表示总群体数目。

在不同黄牛品种chemerin基因SNPs中单倍型A频率变化幅度在52.5％～66.1％，单倍型B频率变化幅度在5.8％～9.8％，单倍型C频率变化幅度在26.1％～66.6％之间，如表5所示。

表5黄牛chemerin基因PvuII多态位点基因频率分布表

6、黄牛chemerin基因SNP位点基因效应的关联分析

基因型数据：PvuII识别的基因型(AA、BB、CC、AB、AC和BC)。

生产数据：南阳牛初生重，以及6月、12月、18月和24月的体重、体尺和日增重数据。

关联分析模型：

先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS(16.0)软件的GLM过程分析基因型和瓶中对各性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijkl＝μ+BF_i+Month_j+G_k+e_ijkl

其中：Y_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，BF_i为第i个品种和农场的固定效，Month_j为第j个月观测的固定效应，G_k为第k个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijkl为随机误差。

结果表明(见表6)：在24月龄，BC基因型个体的体高和坐骨端宽均高于AA基因型个体且差异极显著(P＜0.01)；BC基因型个体的体高和坐骨端宽与AA和AC基因型个体相比，差异显著(P＜0.05)；而其它基因型之间差异不明显(P＞0.05)。对于编码区的同义突变，目前大家普遍接受的一种观点是同义突变可能影响着基因表达的调控水平。本发明发现的两处突变可能的解释是当第868位由G突变为A时，原有的编码Leu的密码子CTG发生突变为CTA，导致在转录的mRNA在翻译过程由于携带该氨基酸的tRNA丰度不同而影响翻译的效率，同样的解释适合于第1021位G到A的突变，编码Ala的密码子GCG发生突变为GCA，从而影响该蛋白的表达量。

表6Chemerin基因PvuII多态位点与南阳牛各月龄体重和日增重之间的方差分析

注：具有不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同的大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。

Claims

1.一种黄牛chemerin基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

以包含黄牛chemerin基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛chemerin基因；

所述的引物对P为：

正向引物：5’-CGGAGCCCACCAGACAGG-3’18nt；

反向引物：5’-CAGCGGGCAGCAGCACAC-3’18nt；

所述的引物对newP为：

上游引物：5’-CGGAGCCCACCAGACAGG-3’ 18nt；

下游引物：5’-ctctgggctggcgctcaccgtgtcAgc-3’27nt；

2.如权利要求1所述的黄牛chemerin基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；35个循环的94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的黄牛chemerin基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0％。

4.如权利要求1所述的黄牛chemerin基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，用一种PvuII限制性内切酶同时识别第868位和第1021位所在的PvuII酶切位点。

5.如权利要求1所述的黄牛chemerin基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果同时鉴定黄牛的chemerin基因第868位和第1021位的碱基多态性存在三种单倍型：A(G-G)，B(G-A)和C(A-G)；这三种单倍型构成六种基因型AA(G-G，G-G)，BB(G-A，G-A)，CC(A-G，A-G)，AB(G-G，G-A)，AC(G-G，A-G)，和BC(G-A，A-G)。