CN102286480B - 影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的MUC13基因关键标记位点及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的MUC13基因关键标记位点及其在种猪遗传改良中的应用，它是利用大规模白色杜洛克×二花脸资源群体和15个中外猪种的远缘群体，通过全基因组扫描连锁定位、目的区域高密度SNP多点连锁精细定位、断点重组分析、基于连锁不平衡的远缘群体关联性分析、最后锁定了编码ETEC F4ac受体的目的基因-MUC13基因，并分离克隆了MUC13基因。在MUC13基因中鉴别到15个关键性突变位点。这15个突变位点在来自5个省份核心群的144头纯种杜洛克、长白、大白仔猪中与ETEC F4ac体外黏附表型基本共分离，最强相关的标记判定抗性/易感个体的准确性达97％(P＝1.59×10-21)。本发明为种猪ETEC F4ac腹泻病的抗病育种提供了一种新方法。
Description
技术领域
本发明涉及动物遗传育种领域，尤其是涉及一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的MUC13基因关键标记位点及其在种猪遗传改良中的应用。
背景技术
仔猪腹泻是养猪生产中的常见传染病，给世界养猪业造成了巨大经济损失。产肠毒素大肠杆菌F4(Enterotoxigenic Escherichia coli F4，ETECF4)是引发新生和断奶前仔猪腹泻病的最主要致病菌。以我国和丹麦为例，分别有约35％和40％的仔猪腹泻病是因ETEC F4侵染而引起的。在我国，其致死率在10％-30％之间，在个别地方甚至比这个比例更高，导致养猪出栏率、商品猪质量严重下降，经济效益受损。
ETEC F4的致病性取决于其是否与猪小肠上皮细胞表面刷状缘的受体特异性结合。这种结合发生后，ETEC F4大量繁殖产生肠毒素，致使肠上皮细胞分泌功能亢进，大量水和电解质进入肠腔，造成肠腔中大量液体积蓄，超过了肠壁重吸收能力而引起腹泻。因此，仔猪小肠上皮细胞有无ETEC F4受体是仔猪被ETEC F4感染时是否发病的关键。无受体猪表现为抵抗型，有受体猪则表现为易感型。分离和鉴别猪ETEC F4受体基因及其抗性位点因而成为猪ETEC F4腹泻抗病育种的关键。
已有的研究表明：猪ETEC F4受体是单基因控制的，呈显隐性遗传模式。携带显性基因S的猪对ETEC F4的粘附易感，隐性基因s纯合子猪则表现为抵抗型。常见西方商业猪种中，如大白、长白和杜洛克，均有一定比例的易感个体。ETEC易感性可以通过小肠刷状缘的体外黏附实验来判定，黏附的个体表现为易感，不黏附的个体表现为抵抗。ETEC F4根据免疫学特征分为ab，ac和ad三种亚型，其中F4ac在西方猪群中是最主要的致病菌。因而F4ac受体基因的定位和鉴别得到了国内外多个研究小组的重视。
1995年，瑞典Leif Andersson小组利用欧洲野猪×大白猪资源家系群体为材料，经过三代系谱的连锁分析，首次将ETEC F4ac受体定位于13号染色体，与Tf基因紧密连锁，并发现F4ab和F4ac受体位点紧密连锁，认为这两个受体是由同一受体控制的。2002年，瑞士Peter Vogeli小组以大白猪和大白×长白三代家系为材料，利用13号染色体更多的微卫星标记信息，将ETEC F4ac受体进一步定位于S0068和Sw1030之间，与其中的S0075和Sw225高度连锁(θ＝0.00)。这一结果在1年后瑞典Leif Andersson小组和丹麦
小组联合开展的基因定位研究中得到了验证，他们还利用FISH和辐射杂种细胞克隆板技术揭示ETEC F4ac受体位于13号染色体q41区(SSC13q41)，分别与人3号染色体的q28-29和q21区同源。2009年，瑞典Leif Andersson小组、丹麦
小组和瑞士PeterVogeli小组联合开展的精细定位将ETEC F4ac受体基因进一步缩小至SSC13q41的SW207与S0075之间。并提出该受体基因最有可能位于Sw207与MUC4之间的14Mb区域。
鉴别SSC13q41区域的位置候选基因是当前ETEC F4ac受体研究的重点。大量的免疫生化特性研究表明，黏蛋白型唾液糖蛋白(IMTGP)，74kDa的转铁蛋白(GV74)和小肠中性糖鞘H(mLad)符合ETEC F4ac受体的理化特征，其中黏蛋白型唾液糖蛋白与F4ab和F4ac结合，但不与F4ad结合，且该糖蛋白的存在与新生仔猪对ETEC F4ab或F4ac的敏感性高度相关，因而成为ETECF4ac受体候选基因选择的重要依据。国内外研究小组在获得了ETEC F4ac受体基因初步的染色体定位信息后，选择了黏附素糖蛋白编码基因(MUC基因家族)和转铁蛋白受体基因(TFRC)进行了研究，瑞士Peter Vogeli小组对TFRC、B3GnT5、B4GALT4和B4GALT4等4个基因进行了研究，但没有发现与F4ac黏附表型显著相关的候选基因和标记；丹麦
小组在欧洲野猪×大白猪资源家系群体中，发现了Mucin 4基因内含子7的一个SNP标记与ETEC F4ac的黏附表型共分离，由此申请了一项国际发明专利。申请人就该位点的影响效应在自身构建的白色杜洛克×二花脸资源家系中开展了研究，发现该标记在始祖动物中没有多态性，而该资源家系的F2个体中有着充分分离的ETEC F4ac的黏附表型，这表明该SNP标记只是与ETECF4ac受体基因因果突变(causative mutation)呈一定连锁不平衡的分子标记，不能解释所有群体的ETEC F4ac受体遗传基础。因此，尽管国内外其他研究小组在ETEC F4ac受体基因鉴别方面取得了一定的进展，但仍未有重大的突破，迄今没有鉴别到真正的ETEC F4ac受体基因及其关键变异位点。
发明内容
本发明的第一个目的是提供影响新生和断奶前仔猪ETEC F4ac腹泻易感性/抗性的MUC13基因关键标记位点；通过现代分子生物学技术检测该基因关键标记位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群新生和断奶前仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。
本发明的第二个目的是影响仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的MUC13基因关键标记位点在种猪抗腹泻病性状遗传改良中的应用。
本发明的第一个目的是这样实现的：
1、实验动物与易感/抗性表型判定
1.1实验动物
本发明用于目的基因定位的家系动物均来自申请人所构建的白色杜洛克×二花脸猪资源家系群体。该资源家系以2头白色杜洛克公猪和17头二花脸母猪为祖代繁殖F1代，选59头F1母猪与9头F1公猪自交产生F2代，在此基础上再选择62头F2公猪149头F2母猪自交产生F3代个体。每个资源家系F2/F3群体个体均在240±3日龄屠宰。
本发明所使用的用于目的基因精细定位的远缘群体为292头纯种仔猪，其中代表我国6个生态类型(包括华南、华中、华北、江海、西南、高原型等)的12个地方猪种(含二花脸、金华猪、姜曲海猪、沙子岭猪、玉山黑猪、杭猪、通城猪、蓝塘猪、巴马香猪、莱芜猪、荣昌猪、藏猪)148头，每个猪种选取至少3个父系家系，每个家系选择3-4个6-8周龄个体；另外从5个不同省份大型商业种猪场购买144头杜洛克、长白、大白猪种，每个猪种同样选取至少3个父系家系，每个家系选择3-4个6-8周龄个体。
1.2易感/抗性表型判定
猪只屠宰后，取小肠空肠部分，提取小肠上皮细胞刷状缘，利用E.coliF4ac菌株黏附猪小肠上皮细胞刷状缘，通过相差显微镜检测细菌的黏附结果。每个样品检测20个以上的刷状缘，若有10％以上的刷状缘上至少有2个细菌黏附，判该样品为黏附型，若至少有2个细菌黏附的刷状缘不到10％，但有1-2个细菌黏附的刷状缘多于10％，判该样品为弱黏附型，否则判为不黏附型。黏附效果图如附图1所示。
2、全基因组扫描初步定位ETEC F4ac受体基因
本发明首先选用覆盖19条染色体的来自美国肉畜中心(MARC)网站公开的151个微卫星标记，在申请人所构建的白色杜洛克×二花脸资源家系200个F2代个体以及全部的F0与F1个体中进行全基因组扫描。具体如下：
2.1微卫星标记PCR扩增条件
微卫星标记聚合酶链式反应(PCR)反应体系为15μl，其中包含40ng基因组DNA(脱氧核糖核酸)，0.2mM dNTPs(合成DNA的四种脱氧核苷酸底物)，0.2μM引物，1.5mM Mg2+，1×PCR buffer(缓冲液)和1U DNA聚合酶(Taq酶)。PCR的扩增程序为94.0℃4min；40循环(94.0℃30sec，55-65℃20sec，72.0℃30sec)；72.0℃5min。
2.2微卫星标记扩增产物电泳及分析
PCR条件优化好之后，使用资源家系F1代个体基因组DNA进行微卫星多态性检测，并根据微卫星引物荧光标记颜色以及片段大小等因素对微卫星进行优化组合以提高毛细管电泳效率。PCR扩增后产物首先用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，然后用凝胶成像系统进行凝胶成像检测PCR产物的质量并确定PCR产物上样稀释倍数，然后对PCR产物进行适量稀释，取1μl组合稀释产物，加入10μl缓冲液(由购自美国ABI公司的Hi-DiTM去离子甲酰胺与
-400HD ROX以100∶1比例混合而成)，进行混合、振荡和离心后，上样于ABI3130XL自动遗传分析仪(3130XL Genetic Analyzer，ABI公司，美国)进行毛细管电泳。经美国ABI公司提供的公用的DataCollection Software V.30收集PCR产物电泳检测后的原始荧光信号，采用美国ABI公司提供的公用的Genemapper3.7读取微卫星片段的大小，并校正错误数据后，将Excel格式的数据转换成CRIMAP(2.4)软件要求的数据格式，再次检验所有个体的基因型。根据家系记载，确保所有个体的数据符合家系分离规律。然后利用公用的CRIMAP软件进行连锁分析，结果如图2所示。从图中可知，ETEC F4ac受体基因被初步定位于猪13号染色体(SSC13)的SW207与S0075之间，这个区域大约17cM。
3、目的区域精细定位ETEC F4ac受体基因
申请人在ETEC F4ac受体位点初步定位的区域(SW207-S0075)及其两翼附近区域新增分子标记至51个(含33个微卫星和18个单核苷酸多态性标记)，各标记引物信息见表1。将这些标记在白色杜洛克×二花脸资源家系群体755个F2代个体及全部F0与F1个体中进行基因分型。33个微卫星标记的检测方法与上述全基因组扫描中的微卫星标记检测方法相同。18个单核苷酸多态性标记(SNP)的检测方法采用SNaPshot方法进行，具体如下：
3.1SNP标记的PCR扩增条件
在25μl的PCR反应体系中，包括25ng猪基因组DNA，1.0mM MgCl2，100mM dNTP，正反向引物各10pmol，2单位Taq酶及1×PCR buffer(上海生物工程公司，中国)。扩增条件为：94℃4min；94℃30s，56-65℃30s，72℃30s，共35个循环；最后在72℃延伸10min。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。取3μl PCR产物，加入1μl ExoSAP-IT酶(上海国药集团公司，中国)37℃孵育15min，然后80℃处理15min灭活酶。PCR产物纯化后稀释4倍备用。
3.2SNaPshot反应及产物纯化
SNaPshot反应体系为：SNaPshot反应混合物(Multiplex ReadyReaction Mix)2μl；SNaPshot延伸引物0.5μl(引物终浓度为0.2μmol/L)；上述纯化稀释PCR产物1.5μl；去离子水1μl。SNaPshot循环参数为96℃10s，50℃5s，60℃30s，共25循环。取5μl SNaPshot反应产物加入0.57μl 10×buffer和0.1μl CIP(SNaPshot反应产物纯化酶)在37℃下孵育1h，然后75℃处理15min灭活酶达到产物纯化效果，-20℃保存备用。
3.3遗传分析仪电泳及判型
电泳混合体系包括：9.25μl Hi-Di formamide(甲酰胺变性剂)；0.5μl上述经纯化后的SNaPshot反应产物；0.25μl GeneScan 120 LIZ sizestandard(电泳分子内标)。体系混合后于95℃变性5min，然后立即置于冰上处理2min。离心上样。具体判型方法如附图3所示。
表1用于ETEC F4ac受体基因精细定位的微卫星和SNP标记引物信息
附注：*表示用于资源家系F3代基因分型的标记。
3.4多点连锁分析
采用公用的ALLEGRO软件对51个遗传标记位点与ETEC F4ac受体基因位点进行多点连锁分析。多点连锁分析结果显示，ETEC F4ac受体基因位点被精细定位于SSC13 UMNP997与S0075之间4.3cM的区域(图4)。
4、断点重组分析精细定位ETEC F4ac受体基因
为了进一步缩小ETEC F4ac受体基因的染色体区域，申请人以0.5cM间距开发序列标签位点(STS)及其SNP标记(引物详见表2)，判定白色杜洛克×二花脸F2(755头)和F3个体(450头)在这些SNP位点的基因型。基因分型方法使用上述的SNaPshot方法进行。根据F2和F3抗性个体在这些位点的遗传重组断点分析，利用特定重组模式的发生并导致黏附表型改变来进行受体基因的断点重组判定以实现精细定位。在耳号为1487的F2代抗性个体中，申请人发现在多点连锁分析精细定位的UMNP997-S0075区域内S0283标记处发生了断点重组，由此将ETEC F4ac受体基因确定在UMNP997至S0283之间。进一步在耳号为3314的F3抗性个体中发现在UMNP997-S0283区域内的UMNP358标记处发生断点重组，由此最终将ETEC F4ac受体基因精细定位于UMNP997和S0283之间2.3cM的染色体区域。
5、ETEC F4ac受体基因的锚定
申请人在UMNP997-S0283 2.3cM的目的区域及其两翼采用直接测序法开展了高密度SNP搜寻和鉴别，在此区域内设计了34对引物(详见表2)，分别在远缘群体白色杜洛克和二花脸中选择表型黏附和抗性个体各2头，以其DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件同上所述，PCR产物经QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN，德国)纯化，委托上海华大六一公司测序。使用公用的DNAStar软件包中的SeqMan软件分析鉴别SNP，共鉴别到104个SNP标记。选择其中分布均匀和具有代表性的70个SNP，在已有经黏附表型测定的15个中、西方猪种远缘群体292个个体中使用飞行时间质谱技术(MassARRAY Analyzer Compact)进行多态性检测，飞行时间质谱技术略述如下：
PCR反应体系为5μl，其中包含8ng基因组，0.05mM dNTPs，0.1μM引物，4.0mM Mg2+，1×PCR缓冲液和0.5U Hotstar Taq DNA聚合酶(Qiagen，德国)。PCR的扩增程序为94.0℃15sec；45循环(94.0℃20sec，56℃30sec，72.0℃1min)；72.0℃3min；4.0℃保存。SAP酶(Qiagen，德国)纯化处理，降解扩增用的dNTP，以确保延伸反应只延伸一个碱基。SAP酶反应体系为7μl，其中包含5μl PCR产物，SAP酶0.3μl(1.7U/μl)，10×缓冲液0.17μl。SAP纯化的程序为37.0℃40min；85.0℃5min；4.0℃保存。单碱基延伸iPLEX反应体系为9μl，其中包含7μl经SAP酶纯化处理的PCR产物，iPLEX终止混合液0.2μl，10×iPLEX缓冲液0.2μl，iPLEX延伸引物0.94μl，iPLEX酶0.041μl。iPLEX反应程序为94.0℃30sec；40循环(94.0℃5sec，5循环(52℃5sec，80.0℃5sec))；72.0℃3min；4.0℃保存。树脂除盐纯化反应和上样：取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置15min。将反应结束的384孔板4000rpm离心30s，每孔加入16μL去离子水，倒置在树脂板上面，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜。以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板60min，3200rpm，5min离心后备用。将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的MassARRAYSpectroCHIP芯片。将样品转移到SpectroCHIP芯片后，即可放入质谱仪(SEQUENOM，美国)进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析。
检测结果采用公用的SHE软件进行关联性分析，分析结果如图5所示。从分析结果图中可看出，与黏附表型关联显著性最高的SNP位点，即图中的M13A(SEQ ID NO：2中46529bp处的SNP)，位于MUC13基因。此外，已有报道ETEC F4ac受体为黏蛋白型唾液糖蛋白，在申请人精细定位的UMNP997-S0283受体基因区域中表达黏液素糖蛋白的仅有MUC13、MUC4和MUC20三个基因。申请人通过基因组织表达实验显示MUC4基因在小肠组织中呈极低丰度表达，MUC20基因呈中度且多种组织广谱表达，而MUC13基因表现为小肠组织的高度特异性表达(结果未显示)。结合上述远缘群体的SNP标记关联性分析结果，从而锁定MUC13基因为ETEC F4ac受体目的基因。
表2 UMNP997-S0283目的区域SNP鉴别的引物信息
6、ETEC F4ac受体基因(MUC13基因)关键突变位点的鉴别
6.1MUC13基因新的全长cDNA序列的分离
根据已报道的猪MUC13基因的部分cDNA序列(序列号为：EU046996)设计引物F1和R1(见表3)，获得1148bp的cDNA片段。以此序列片段设计引物F2进行5’RACE，获得部分cDNA序列。通过生物信息学方法，利用人、牛、狗、马、猫和鼠的MUC13蛋白羧基端序列信息预测MUC13蛋白羧基端的保守编码区。然后利用牛该保守同源区cDNA序列设计引物F3再次进行5’RACE从而获得新的全长cDNA序列。全长cDNA序列特征如序列表SEQ ID NO 1。MUC13基因cDNA序列所编码的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO 3。
6.2MUC13基因全长基因组序列的获取
根据所获得MUC13基因的cDNA序列，采用人-猪比较基因组法，结合生物信息学法设计引物对M13-1-F/M13-1-R、M13-2-F/M13-2-R、M13-3-F/M13-3-R、M13-4-F/M13-4-R、M13-5-F/M13-5-R、M13-6-F/M13-6-R(详见引物表3)。PCR反应体系包括25ng猪基因组DNA，1.0mM MgCl2，100mM dNTP，正反向引物各10pmol，2单位DNA聚合酶(Taq酶)及1×PCRbuffer(上海博彩公司，中国)。扩增条件为：94℃4min；94℃30s，55-65℃30s，72℃70s，共32个循环；最后在72℃延伸10min。扩增片段采用QIAquick PCR产物纯化试剂盒纯化，由上海华大六一公司测序。使用公用的DNAStar软件包中的SeqMan软件分析测序结果，并结合已有的cDNA序列从而获取MUC13基因全长DNA序列，全长DNA序列特征如序列表SEQ ID NO2。
6.3MUC13基因关键SNP位点的鉴别
使用上述分离的MUC13基因全基因序列的6对引物，扩增二花脸和杜洛克抗性和易感个体基因组DNA，PCR反应条件同上，PCR产物直接纯化测序，使用公用的DNAStar软件包中的SeqMan软件分析测序结果，在MUC13全基因序列上共鉴别到179个单核苷酸多态位点(SNPs)。
选择MUC13全基因序列上鉴别到的104个SNPs位点在已有体外黏附表型测定的12个代表6种生态类群的中国地方猪种和3个西方引进猪种共计292个个体中采用上述MassARRAY飞行时间质谱技术进行大规模SNP基因分型。将SNP分型结果与ETEC F4ac体外黏附表型进行关联性分析。结果如图6所示。通过关联性分析，申请人共发现15个关键性SNPs(详见表4)可用于判定易感/抗性个体，其准确性大于84％，关联性P值小于1.93×10-14，其中最强相关的标记(SNP C104660T)准确率大于97％(P＝1.59×10-21)。这15个关键性SNPs位点是与MUC13基因上的因果突变(causativemutation)呈极度连锁不平衡状态的标记或本身即为因果突变。根据它们与黏附表型的强相关，可以很好的将这15个SNPs标记用于猪抗腹泻病遗传育种生产实践中，通过分子标记选育逐世代选择抗性的个体，以培育抗ETEC F4ac腹泻病的种猪新品系。
表3 MUC13基因克隆引物信息
本发明的第二个目的是这样实现的：本发明利用MUC13基因的15个关键标记位点及侧翼DNA序列信息，采用分子生物学技术鉴别个体基因型，以判定个体对ETEC F4ac腹泻的易感性/抗性，从而针对抗腹泻病性状选育改良种猪。
申请人自2003年以来利用自身构建的大规模白色杜洛克×二花脸资源家系群体，在755个具有ETEC F4ac体外黏附表型的F2个体和390个F3个体中，开展了基于183个微卫星位点的全基因组连锁分析、目的区域高密度标记的IBD分析及断点重组分析，将ETEC F4ac受体基因精细定位于13号染色体q41区(SSC13q41)临近S0283的约2.3cM区域。在精细定位基础上，构建了包括20个功能基因座位的SSC13q41人-猪高分辨率比较基因图谱。进一步通过15个远缘群体292个个体的连锁不平衡关联性分析，最终鉴别到了目的受体基因及能准确判定易感和抗性个体的关键突变位点，由此创建了一项高效、准确的新生和断奶前仔猪腹泻病的抗病育种新技术。
本发明鉴别了影响新生和断奶前仔猪腹泻易感/抗性的MUC13基因的关键标记位点，通过现代分子生物学技术检测该基因的关键标记位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。本发明为种猪ETEC F4ac腹泻病的抗病育种提供了一种新方法。
附图说明
图1ETEC F4ac与刷状缘的黏附检测结果，(a)为不黏附型，(b)为黏附型；
图2ETEC F4ac受体基因的全基因组连锁分析初步定位结果；
图3为C104660T位点的SNaPshot判型图，其中a为CC型；b为CT型；c为TT型；
图4为ETEC F4ac受体基因的目的区域多点连锁分析精细定位结果；
图5为UMNP997-S0283目的区域高密度SNP基因型与ETEC F4ac黏附表型关联性分析结果图；
图6为MUC13基因内高密度SNP基因型与ETEC F4ac黏附表型关联性分析结果图。
具体实施方式
下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
选择种猪核心群个体，利用上述飞行时间质谱技术或SNaPSHOT技术检测MUC13基因15个位点的基因型，选择有利的等位基因型个体留种，群体继代选育后改良种群的抗仔猪腹泻病性能。
实施例：
利用144头纯种仔猪包括杜洛克、长白、大白猪种作为实验动物，这些猪只从5个大型商业种猪场购买，每个猪种选取至少3个父系家系，每个家系选择3-4个1-2月龄个体。这144头纯种仔猪屠宰后，开展猪小肠上皮细胞刷状缘ETEC F4ac体外黏附表型测定实验，实验方法及判型标准如前所述。
采用上述飞行时间质谱技术或SNaPSHOT技术对MUC13基因15个位点在上述144头纯种仔猪中进行SNP基因分型。对各SNP位点的基因型与ETECF4ac体外黏附猪小肠刷状缘的表型进行关联性统计分析(见表4)。
结果表明MUC13基因15个关键位点的基因型均与黏附表型基本共分离。以其中的SNP位点SNP C104660T为例，T等位基因为易感基因，C等位基因为抗性基因；基因型TT和CT个体对ETEC F4ac的侵染易感，CC型个体对ETEC F4ac的侵染具有抵抗性。CC型个体是抗腹泻病型猪的选育改良所需的基因型个体。在商业种猪核心群中，继代选育CC型个体，可以显著地改良种群的抗腹泻病性状，减少仔猪的死亡率，并最终可望育成抗新生和断奶仔猪腹泻病的专门化新品系。
表4 MUC13关键SNP位点在实验猪群体中的基因型与ETEC F4ac黏附表型的关联性
序列表
<210>2
<211>202443
<212>DNA
<213>Jiangxi Agricultural University
<220>
<221>N＝A，T，C，G
<400>2
Claims (9)
1.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO2，并且第104660bp处为C或T；或者第97350bp处为C或T；
2.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO2，并且第94436bp处为A或C；或者第97583bp处为A或G；
3.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO2，并且第98183bp处为A或G；或者第84443bp处为C或T；
4.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO2，并且第84473bp处为A或G；或者第61069bp处为C或T；
5.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO2，并且第61395bp处为C或T；或者第89269bp处为A或G；
6.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO2，并且第73825bp处为C或T；或者第75000bp处为A或C；
7.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO2，并且第67131bp处为C或T；或者第73106bp处为A或G；
8.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO2，并且第73359bp处为C或G。
9.权利要求1-8中任意一项所述的核苷酸序列在选育改良种猪抗腹泻病性状中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111221 |
|
| C49 | Reinstatement of patent right or utility model | ||
| RA01 | Restoration of patent right |
Former decision: deemed withdrawal of patent application after publication Former decision publication date: 20130529 |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140507 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |