CN110669863B

CN110669863B - 柑橘线粒体InDel分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110669863B
Application number: CN201911042998.0A
Authority: CN
Inventors: 郭文武; 李超超; 张帅; 解凯东; 伍小萌; 徐强; 邓秀新
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2039-10-30
Also published as: CN110669863A

Abstract

本发明公开了一组柑橘线粒体InDel分子标记及其应用，属于植物分子标记辅助种质资源鉴定技术领域。本发明的5对柑橘线粒体InDel分子标记引物序列如SEQ ID NO.1‑10所示，使用本发明的分子标记引物能够可快速、准确鉴定橘属、枳属和山金柑种质，能够鉴定柑橘原生质体融合后代线粒体来源，能够分析亲本未知柑橘品种母本来源。本发明在保护和利用野生柑橘资源上具重要意义。

Description

柑橘线粒体InDel分子标记及其应用

技术领域

本发明属于植物分子标记辅助种质资源鉴定技术领域，具体涉及用于鉴定柑橘属、山金柑和枳属种质资源的一组线粒体InDel分子标记及其应用。

背景技术

柑橘是芸香科(Rutaceae)柑橘属植物，起源于我国喜马拉雅山脉，是世界第一大果树，也是我国南方最重要的果树。柑橘及其近缘属植物种类繁多，柑橘具有无融合生殖、无性系变异频繁等特点，而且不同的种属间易杂交，如柑橘属和枳属等植物可以互相杂交，柑橘属内植物更是杂交频繁，因此柑橘属植物核遗传背景更加复杂，核分子标记引物特异性差。同时细胞融合作为一项成熟的技术在柑橘育种中已取得不少研究成果，但由于缺乏可用于鉴别线粒体的分子标记，也存在着再生植株线粒体来源鉴定困难的问题。

目前各类分子标记已广泛用于柑橘研究，但应用较广的多为核基因组分子标记，线粒体分子标记较少。线粒体是动植物细胞内一种特殊的细胞器，拥有自己的基因组，在细胞生命活动中起着重要作用。线粒体DNA在有性生殖中具有母系遗传遗传现象，即子代线粒体DNA全部来自母本，不与父本发生交换重组。利用线粒体分子标记除可以区分品种、鉴别细胞融合后代线粒体基因来源外，在鉴定柑橘母本来源的应用上有着独特作用。同时线粒体DNA突变和重组率比核基因组低，使得基于线粒体基因组开发的分子标记比核基因组更加稳定可靠。但目前柑橘上使用的线粒体分子标记大多是根据拟南芥、油菜等作物的线粒体基因组开发得来，在柑橘上的应用范围窄，特异性差。

本发明利用柚(华柚1号)、葡萄柚(鸡尾葡萄柚)、宽皮橘(国庆1号温州蜜柑、鄂柑1号碰柑、默科特橘橙、红橘)、橙(冰糖橙、伏令夏橙、纽荷尔脐橙)、山金柑和枳的线粒体基因组开发了5对稳定可靠特异性强的柑橘线粒体的分子标记，通过简单的PCR反应和琼脂糖凝胶电泳即可区分柑橘属、枳属以及山金柑的线粒体基因组，可用于柑橘品种鉴定、谱系演化分析、分子辅助育种。

发明内容

本发明的目的在于提供5对利用利用柚(华柚1号)、葡萄柚(鸡尾葡萄柚)、宽皮橘(国庆1号温州蜜柑、鄂柑1号碰柑、默科特橘橙、红橘)、橙(冰糖橙、伏令夏橙、纽荷尔脐橙)、山金柑和枳的线粒体DNA开发得到的可快速、准确鉴定柑橘属、山金柑以及枳属种质资源的线粒体InDel分子标记引物及基于所述分子标记引物开发的产品。

本发明的目的还在于提供上述分子标记引物在鉴定柑橘及其近缘属(山金柑、枳属等)种质中的应用与方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

柑橘线粒体InDel分子标记引物，包括下述5对引物：

HBF：CCCGCCCTTAGGAGATTG，

HBR：TCCCTCGGACTCGGAAAG；

G1F：ACGCTTTGGTTAGGCTTGG，

G1R：GGCTCGAATGCCTTTACG；

ZKF：CCTCGTCGGATTCGTTCA，

ZKR：CACGGGTCATGCCTCAAT；

SJGF：GCGGTTGCACCGACTCAA，

SJGR：CTTGCTGGGCACGGTTTT；

BTCF：AAAGCACCGCTCGCTCAA，

BTCR：AATGGGTAACTCACGAACTAAAGAA。

所述的引物对HBF/HBR，以柚(华柚1号)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳可得到一条长度为443bp的亮带，以葡萄柚(鸡尾葡萄柚)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳可得到一条长度为443bp的亮带，以橙(冰糖橙、伏令夏橙、纽荷尔脐橙)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为443bp的亮带，以宽皮橘(国庆1号温州蜜柑、鄂柑1号碰柑、默科特橘橙、红橘)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为745bp的亮带，以山金柑材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为745bp的亮带，以枳材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为749bp的亮带。

所述的引物对G1F/G1R，以柚(华柚1号)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳可得到一条长度为196bp的亮带，以葡萄柚(鸡尾葡萄柚)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳可得到一条长度为196bp的亮带，以橙(冰糖橙、伏令夏橙、纽荷尔脐橙)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为196bp的亮带，以宽皮橘(国庆1号温州蜜柑、鄂柑1号碰柑、默科特橘橙、红橘)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为165bp的亮带，以山金柑材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为196bp的亮带，以枳材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为196bp的亮带。

所述的引物对ZKF/ZKR，以柚(华柚1号)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳可得到一条长度为266bp的亮带，以葡萄柚(鸡尾葡萄柚)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳可得到一条长度为266bp的亮带，以橙(冰糖橙、伏令夏橙、纽荷尔脐橙)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为266bp的亮带，以宽皮橘(国庆1号温州蜜柑、鄂柑1号碰柑、默科特橘橙、红橘)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为240bp的亮带，以枳材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为266bp的亮带，以山金柑材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为266bp的亮带。

所述的引物对SJGF/SJGR，以柚(华柚1号)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳可得到一条长度为154bp的亮带，以葡萄柚(鸡尾葡萄柚)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳可得到一条长度为154bp的亮带，以橙(冰糖橙、伏令夏橙、纽荷尔脐橙)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为154bp的亮带，以宽皮橘(国庆1号温州蜜柑、鄂柑1号碰柑、默科特橘橙、红橘)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为154bp的亮带，以山金柑材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为129bp的亮带，以枳材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为154bp的亮带。

所述的引物对BTCF/BTCR，以柚(华柚1号)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳可得到一条长度为168bp的亮带，以葡萄柚(鸡尾葡萄柚)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳可得到一条长度为168bp的亮带，以橙(冰糖橙、伏令夏橙、纽荷尔脐橙)材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增经琼脂糖凝胶电泳会得到一条长度为149bp的亮带。

一种鉴定柑橘及其近缘属种质资源的试剂盒，包含上述线粒体InDel分子标记引物。

上述线粒体InDel分子标记引物在鉴定柑橘属、枳属和山金柑种质中的应用。

一种鉴定柑橘原生质体融合后代线粒体来源的方法，包括以下步骤：

(1)DNA提取：提取待鉴定柑橘原生质体融合后代及其亲本的基因组DNA；

(2)PCR扩增：以步骤(1)中提取的DNA为模板，利用上述能区分双亲的任一线粒体InDel分子标记引物对进行PCR扩增；

(3)电泳检测：用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，得到电泳图，根据样品间条带的一致性来判断待检测样品线粒体基因组来源。

一种分析亲本未知柑橘品种母本来源的方法，包括以下步骤：

(1)DNA提取：提取待鉴定柑橘种质的基因组DNA；

(2)PCR扩增及检测：首先用引物HBF/HBR，以待鉴定品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测；

a：若检测到443bp的条带，则待鉴定品种的母本来源为柚或橙；进一步用引物BTCF/BTCR进行PCR扩增、电泳检测，若检测到168bp的条带则待鉴定品种的母本来源为柚，若检测到149bp的条带则待鉴定品种的母本来源为橙；

b：若检测到745-749bp的条带，则待鉴定品种的母本来源为宽皮橘、枳或山金柑；进一步分别用引物G1F/G1R、ZKF/ZKR、SJGF/SJGR进行PCR扩增、电泳检测，用引物G1F/G1R扩增检测到165bp的条带则待鉴定品种的母本来源为宽皮橘，用引物ZKF/ZKR扩增检测到240bp的条带则待鉴定品种的母本来源为枳，用引物SJGF/SJGR扩增检测到129bp的条带则待鉴定品种的母本来源为金山柑。

本发明的优点在于：

(1)柑橘上鉴定传统使用的线粒体引物来自于拟南芥、油菜等，本发明的引物对来自柚(华柚1号)、葡萄柚(鸡尾葡萄柚)、宽皮橘(国庆1号温州蜜柑、鄂柑1号碰柑、默科特橘橙、红橘)、橙(冰糖橙、伏令夏橙、纽荷尔脐橙)、山金柑和枳的线粒体基因组，分辨率高，稳定性强，无须繁琐的筛选引物步骤，大大节省了鉴定时间；

(2)本发明的引物对除了可以鉴定不同柑橘类型的线粒体以外还可以鉴定未知柑橘品种的母本来源，在保护和利用野生柑橘资源上也具重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1的检测结果电泳图。图中：1翡翠柚，2无酸柚，3华柚1号，4沙田柚，5高班柚，6垫江柚，7晚白柚，8琯溪蜜柚，9胡柚，10马叙葡萄柚，11星露比葡萄柚，12鸡尾葡萄柚，13锦橙，14暗柳橙，15红暗柳橙，16早金甜橙，17纽荷尔脐橙，18BuDD血橙，19红肉脐橙，20冰糖橙，21大红甜橙，22哈姆林甜橙，23伏令夏橙，24朋娜脐橙，25奉节脐橙，26莽山野橘，27道县野橘，28江永野橘，29莽山野柑，30南丰蜜桔，31红橘，32克里曼丁橘，33立花橘，34归湖酸橘，35八月橘，36牛肉红橘，37柳叶橘，38本地早橘，39沙糖橘，40乳橘，41大红袍红橘，42南橘，43朱红橘，44朱沙橘，45黄陵庙橘，46城固冰糖橘，47日来1号温州蜜柑，48国庆1号温州蜜柑，49行柑，50虎头柑，51沃柑，52茶枝柑，53无核碰柑，54蕉柑，55不知火丑橘，56清江碰柑，57清见，58默科特橘橙，59秋辉橘橙，60山金柑，61早实枳，62枳，M：1kbMarker；a-e分别为使用引物对HBF/HBR、G1F/G1R、ZKF/ZKR、SJGF/SJGR、BTCF/BTCR进行扩增的检测结果电泳图。

图2为本发明实施例2的检测结果电泳图。图中：1国庆1号温州蜜柑，2华柚2号，3华柚1号，M：500bp Marker。

图3为本发明实施例3的检测结果电泳图。图中：1沙田柚，2鸡尾葡萄柚，3冰糖橙，4国庆1号温州蜜柑，5沙田柚，6鸡尾葡萄柚，7冰糖橙，M1：1kb Marker，M2 500bp Marker。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，下述实施例中所用的材料、试剂等均可从商业途径得到；实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明的分子标记引物的获得：首先基于第2代或3代测序技术对柚(华柚1号)、葡萄柚(鸡尾葡萄柚)、宽皮橘(国庆1号温州蜜柑、鄂柑1号碰柑、默科特橘橙、红橘)、橙(冰糖橙、伏令夏橙、纽荷尔脐橙)、山金柑和枳的线粒体基因组进行建库测序，再使用生物信息学软件挖掘特异性线粒体InDel位点并设计引物，最后通过实验筛选得到的5对特异性引物。

分子标记引物具体如下：

HBF：CCCGCCCTTAGGAGATTG，

HBR：TCCCTCGGACTCGGAAAG；

G1F：ACGCTTTGGTTAGGCTTGG，

G1R：GGCTCGAATGCCTTTACG；

ZKF：CCTCGTCGGATTCGTTCA，

ZKR：CACGGGTCATGCCTCAAT；

SJGF：GCGGTTGCACCGACTCAA，

SJGR：CTTGCTGGGCACGGTTTT；

BTCF：AAAGCACCGCTCGCTCAA，

BTCR：AATGGGTAACTCACGAACTAAAGAA。

在本发明中，所述引物的来源没有任何限制，委托序列合成公司合成即可。在本发明实施例中，所述引物委托北京擎科生物技术有限公司合成。

本发明对上述材料的基因组DNA提取方法不作特别限定，本领域常规制备基因组DNA方法即可。

下面结合实施例，对本发明提供的5对柑橘线粒体InDel分子标记引物在柑橘中的应用清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)DNA提取：采用CTAB法提取柑橘属、枳属以及山金柑共62个品种的基因组DNA，品种编号见图1附图说明。

(2)PCR扩增：分别利用引物对HBF/HBR、G1F/G1R、ZKF/ZKR、SJGF/SJGR对上述62个品种的基因组DNA进行PCR扩增，利用引物对BTCF/BTCR对1-25号品种进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系为：PCR反应Mix液5μL，正反引物(10mmol/L)各0.5μL，DNA模板(100ng/μL)1μL和ddH₂O 3μL。PCR扩增步骤为：94℃变性5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，35个循环；72℃，5min，12℃，30min，4℃保存。

(3)电泳检测：用2.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，电泳液为条件为：1×TAE缓冲液(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH＝8.0)，电压60V，电泳80min。电泳完毕，使用凝胶成像系统(UVP)对胶进行拍照并保存图片。

检测结果见图1：图1a显示1-25号条带443bp，26-62号条带为745-749bp，表明引物对HBF/HBR可以将柚(1-9号)、葡萄柚(10-12号)、橙(13-25号)与宽皮橘(26-59号)、山金柑(60号)和枳类(61-62号)区分开；图1b显示26-59号条带为165bp，1-25号和60-62号条带为196bp，表明G1F/G1R可以将宽皮柑橘类与柚、葡萄柚、橙、山金柑和枳区分开；图1c显示61-62条带为240bp，1-60号条带为266bp，表明用引物对ZKF/ZKR，可以将枳与柚、葡萄柚、橙和山金柑区分开；图1d显示60号条带为129bp，1-59号和61-62号条带为154bp，表明引物对SJGF/SJGR可以将山金柑与柚、葡萄柚、橙和枳区分开；图1e显示1-12号条带为168bp，13-25号条带为149bp，表明引物对BTCF/BTCR可以将柚、葡萄柚与橙区分开。

实施例2

(1)DNA提取：采用CTAB法提取胞质杂种华柚2号、国庆1号温州蜜柑、华柚1号基因组DNA。

(2)PCR扩增：利用引物对HBF/HBR扩增上述柑橘品种的基因组DNA。PCR扩增的反应体系为：PCR反应Mix液5μL，正反引物(10mmol/L)各0.5μL，DNA模板(100ng/μL)1μL和ddH₂O3μL。PCR扩增步骤为：94℃变性5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，35个循环；72℃，5min，12℃，30min，4℃保存。

检测结果见图2：原生质体融合杂种后代华柚2号和国庆1号温州蜜柑条带一致为745-749bp，华柚1号条带为443bp，表明华柚2号的线粒体来自国庆1号温州蜜柑。

实施例3

(1)DNA提取：采用CTAB法提取鸡尾葡萄柚、沙田柚、国庆1号温州蜜柑、冰糖橙基因组DNA。

(2)PCR扩增、电泳检测一：利用引物对HBF/HBR扩增鸡尾葡萄柚、沙田柚、冰糖橙、国庆1号温州蜜柑基因组DNA。PCR扩增的反应体系为：PCR反应Mix液5μL，正反引物(10mmol/L)各0.5μL，DNA模板(100ng/μL)1μL和ddH₂O 3μL。PCR扩增步骤为：94℃变性5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，35个循环；72℃，5min，12℃，30min，4℃保存。用2.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，1×TAE缓冲液(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH＝8.0)，电压60V，电泳80min。电泳完毕，使用凝胶成像系统(UVP)对胶进行拍照并保存图片。

检测结果见图3(泳道M1、1-4)：鸡尾葡萄柚条带和沙田柚、冰糖橙一致为745-749bp。

(3)PCR扩增、电泳检测二：利用引物对BTCF/BTCR扩增鸡尾葡萄柚、沙田柚、冰糖橙基因组DNA。PCR扩增的反应体系为：PCR反应Mix液5μL，正反引物(10mmol/L)各0.5μL，DNA模板(100ng/μL)1μL和ddH₂O 3μL。PCR扩增步骤为：94℃变性5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，35个循环；72℃，5min，12℃，30min，4℃保存。用2.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，1×TAE缓冲液(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH＝8.0)，电压60V，电泳80min。电泳完毕，使用凝胶成像系统(UVP)对胶进行拍照并保存图片。

检测结果见图3(泳道M2、5-7)：鸡尾葡萄柚条带与沙田柚一致为168bp，冰糖橙条带为149bp，表明鸡尾葡萄柚的线粒体来源于柚，证明鸡尾葡萄柚的杂交母本为柚。

以上详细说明了本发明的实施方式，但这只是为了便于理解而举的实例，不应被视为是对本发明范围的限制。同样，任何所属技术领域的技术人员均可根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，做出各种可能的等同改变或替换，但所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 柑橘线粒体InDel分子标记及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccgccctta ggagattg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccctcggac tcggaaag 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgctttggt taggcttgg 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggctcgaatg cctttacg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctcgtcgga ttcgttca 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacgggtcat gcctcaat 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggttgcac cgactcaa 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttgctgggc acggtttt 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaagcaccgc tcgctcaa 18

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aatgggtaac tcacgaacta aagaa 25

Claims

1.一种线粒体InDel分子标记引物在鉴定柑橘属、枳属和山金柑种质中的应用，其特征在于：所述的线粒体InDel分子标记引物为下述2对引物：

ZKF：CCTCGTCGGATTCGTTCA，

ZKR：CACGGGTCATGCCTCAAT；

SJGF：GCGGTTGCACCGACTCAA，

SJGR：CTTGCTGGGCACGGTTTT；

引物对ZKF/ZKR以柑橘属的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到266bp的条带；引物对ZKF/ZKR以枳属的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到240bp的条带；引物对ZKF/ZKR以山金柑的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到266bp的条带；用引物对ZKF/ZKR将枳属与柑橘属、山金柑区分开；

引物对SJGF/SJGR以柑橘属的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到154bp的条带；引物对SJGF/SJGR以枳属的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到154bp的条带；引物对SJGF/SJGR以山金柑的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到129bp的条带；用引物对SJGF/SJGR将山金柑与柑橘属、枳属区分开。

2.一种鉴定柑橘原生质体融合后代线粒体来源的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(2)PCR扩增：以步骤(1)中提取的DNA为模板，利用能区分双亲的线粒体InDel分子标记引物中的任一对进行PCR扩增；

(3)电泳检测：用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，得到电泳图，根据样品间条带的一致性来判断待检测样品线粒体来源；

所述的能区分双亲的线粒体InDel分子标记引物为下述5对引物：

HBF：CCCGCCCTTAGGAGATTG，

HBR：TCCCTCGGACTCGGAAAG；

G1F：ACGCTTTGGTTAGGCTTGG，

G1R：GGCTCGAATGCCTTTACG；

ZKF：CCTCGTCGGATTCGTTCA，

ZKR：CACGGGTCATGCCTCAAT；

SJGF：GCGGTTGCACCGACTCAA，

SJGR：CTTGCTGGGCACGGTTTT；

BTCF：AAAGCACCGCTCGCTCAA，

BTCR：AATGGGTAACTCACGAACTAAAGAA；

引物对HBF/HBR以柚、葡萄柚、橙的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到443bp的条带；引物对HBF/HBR以宽皮橘、山金柑、枳的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到745-749bp的条带；引物对HBF/HBR将柚、葡萄柚、橙与宽皮橘、山金柑、枳类区分开；

引物对G1F/G1R以宽皮柑橘类的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到165bp的条带；引物对G1F/G1R以柚、葡萄柚、橙、山金柑、枳的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到196bp的条带；引物对G1F/G1R将宽皮柑橘类与柚、葡萄柚、橙、山金柑、枳区分开；

引物对ZKF/ZKR以枳的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到240bp的条带；引物对ZKF/ZKR以柚、葡萄柚、橙、宽皮柑橘类、山金柑的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到266bp的条带；引物对ZKF/ZKR将枳与柚、葡萄柚、橙、宽皮柑橘类、山金柑区分开；

引物对SJGF/SJGR以山金柑的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到129bp的条带；引物对SJGF/SJGR以柚、葡萄柚、橙、宽皮柑橘类、枳的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到154bp的条带；引物对SJGF/SJGR将山金柑与柚、葡萄柚、橙、宽皮柑橘类、枳区分开；

引物对BTCF/BTCR以柚、葡萄柚的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到168bp的条带；引物对BTCF/BTCR以橙的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到149bp的条带；引物对BTCF/BTCR将柚、葡萄柚与橙区分开。

3.一种分析亲本未知柑橘品种母本来源的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)DNA提取：提取待鉴定柑橘种质的基因组DNA；

b：若检测到745-749bp的条带，则待鉴定品种的母本来源为宽皮橘、枳或山金柑；进一步分别用引物G1F/G1R、ZKF/ZKR、SJGF/SJGR进行PCR扩增、电泳检测，用引物G1F/G1R扩增检测到165bp的条带则待鉴定品种的母本来源为宽皮橘，用引物ZKF/ZKR扩增检测到240bp的条带则待鉴定品种的母本来源为枳，用引物SJGF/SJGR扩增检测到129bp的条带则待鉴定品种的母本来源为山金柑；

各引物序列如下：

HBF：CCCGCCCTTAGGAGATTG，

HBR：TCCCTCGGACTCGGAAAG；

G1F：ACGCTTTGGTTAGGCTTGG，

G1R：GGCTCGAATGCCTTTACG；

ZKF：CCTCGTCGGATTCGTTCA，

ZKR：CACGGGTCATGCCTCAAT；

SJGF：GCGGTTGCACCGACTCAA，

SJGR：CTTGCTGGGCACGGTTTT；

BTCF：AAAGCACCGCTCGCTCAA，

BTCR：AATGGGTAACTCACGAACTAAAGAA。