CN103031376A

CN103031376A - 一种检测中外不同牛群体的基因诊断方法

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Publication number: CN103031376A
Application number: CN2012105288548A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 黄永震; 王珂忆; 蓝贤勇; 雷初朝; 胡沈荣
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2012-12-10
Filing date: 2012-12-10
Publication date: 2013-04-10

Abstract

本发明公开了一种检测中外不同牛群体的基因诊断试剂盒，属于分子遗传学领域。一种GLI3基因检测中外不同牛群体的方法，包括以引物对P为引物，PCR扩增黄牛GLI3基因；进行DNA测序和SSCP多态性的检测及其不同基因型与经济性状的关联分析。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与中外不同牛群体中特异分子遗传标记，故本发明提供的检测方法可用于区分中外不同牛群体，进而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。本发明的优点是：首次提供了在3个中国黄牛群体中GLI3基因存在一种突变，并且该突变在国外牛品种中不存在多态性。本发明检测方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于中外不同牛群体GLI3基因大规模的筛查和诊断。

Description

一种检测中外不同牛群体的基因诊断方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性的检测，特别涉及一种检测中外不同牛群体的基因诊断方法。

背景技术

遗传标记指可追踪染色体、染色体某一节段、某个位点在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记大致经历了形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记四个发展阶段。1974年，Grodzicker等首次提出用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）作为遗传标记，开创了直接用DNA作为遗传标记的先河，从而揭开了分子标记研究的序幕。经过数十年的发展，尤其是1985年Mullis等[27]发明了PCR技术以后，分子标记研究呈现出“百家争鸣”的景象。分子标记之所以能反映DNA水平的遗传变异情况主要是基于被研究的DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短与重排不一的重复机制而产生多态性。经过大量的研究发现，DNA分子标记有许多特点，如直接以DNA的形式表现；某些标记表现共显性；标记数量多；表现为中性；多态性高等。如今，分子标记在生命科学研究领域中已经被广泛应用，在遗传标记中占主导地位。

单核苷酸多态性(sinTle nucleotide polymorphism，SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander（1996）提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/T）的变化而引起的多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，基因编码区内的SNPs（cSNPs）比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。

标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点（QTL），使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质（酶）标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。分子育种，即分子标记辅助选择（molecularmark-assist selection,MAS），该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在畜禽育种中，人们期望，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等，SSCP它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Takao经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。

Gli3基因属于GLI-Kruppel基因家族中的一员。其参与的Shh信号通路在动物生长发育，尤其是骨骼，神经系统及肢体的发育过程中有重要作用。

本研究采用PCR-SSCP和DNA测序技术，检测了3个中国地方黄牛群体（南阳牛：187头；秦川牛：287头；郏县红牛：139头）和1个国外品种（荷斯坦牛：95头）共708个个体的Gli3基因的遗传变异，分析了其遗传结构和遗传多样性，为中国黄牛的高效选育和分子标记数据库的建立、种质资源保存与利用提供遗传学依据。

本研究在3个中国黄牛群体的Gli3基因外显子1检测到1个SNP（A8143G），这个SNP未引起氨基酸突变（SerTCA→SerTCG）。在荷斯坦牛中没有发现多态。卡方检验显示，四个牛品种均处于Hardy-Weinberg平衡状态。南阳牛、秦川牛、郏县红牛和荷斯坦牛4个群体遗传多态指数He/Ne/PIC分别为0.48/1.91/0.36，0.44/1.78/0.34，0.49/1.97/0.37，0.00/1.00/0.00。

以上研究表明，Gli3基因可以作为检测中外不同牛群体的有效选择标记。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种检测黄牛GLI3基因单核苷酸多态性的方法，寻找与经济性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛GLI3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含GLI3基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛GLI3基因；琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小；用变性剂处理PCR扩增产物之后，再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛GLI3基因第8143位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：5’-CAGGGGAAAAGGATGGG-3’；

下游引物：5’-CGAGGTAAGTGCACATGC-3’；

所述的PCR扩增反应程序为：

95℃预变性4min；94℃变性30s，58.5℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小，所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5%。

所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳质量浓度为10%。

所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛GLI3基因第8143位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为8143位为核苷酸A纯和；AG基因型表现为8143位为核苷酸A/G杂合；GG基因型表现为8143位为脱氧核苷酸G纯和；其中，单核苷酸多态性GG基因型为突变纯合基因型。

与现有技术相比，本发明具有以下独特的技术效果：

本发明根据已公布牛GLI3基因（GenBank Accession No.NW 001494928）的序列设计引物，分别以3个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的黄牛GLI3基因的部分序列与NCBI公布的序列进行比较，发现在GLI3基因的第8143位存在SNP多态性。

针对上述第8143位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小，用变性剂处理扩增产物后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。

本发明提供的检测方法为GLI3基因的SNP与黄牛部分生长性状进行关联分析，研究表明基因型对南阳牛群体的体重有显著影响（P<0.05）。以上研究表明，GLI3基因结果表明该位点能够作为提高黄牛体重和日增重的分子标记，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择（MAS），快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

本发明还涉及一种用于实施本发明所述方法的专用试剂盒，所述试剂盒内容包括：

一、试剂盒引物成分：

1.1特异引物（上下游）：F:5’-CAGGGGAAAAGGATGGG-3’；

R:5’-CGAGGTAAGTGCACATGC-3’；

二、试剂盒操作说明：

（1）PCR操作说明

1.1PCR扩增反应体系

PCR反应体系见表2。

1.2PCR扩增反应程序

（2）电泳检测与基因型判断

2.1PCR产物的琼脂糖电泳检测

扩增得到长度为452bp的PCR产物，经用1%的琼脂糖电泳检测，表现唯一的452bp的PCR条带，见图2所示。

2.2PCR产物的SSCP分析

对每个个体扩增片段变性处理后，进行10%聚丙稀酰胺凝胶电泳检测，其个体可以出现AA,或AG，或GG带型，见图4所示。

（3）待检个体的选择与淘汰

①中国牛群体选择：AA；GA和AA型；（有3基因型基因型，有多态性）。

②国外牛群体选择：AA型；（有1种基因型，无多态性）。

（4）注意事项

1.DNA的提取可以按照以上提供的步骤操作，也可以依据不同厂家的全血DNA提取试剂盒的要求来提取，但是要保证DNA的纯度，若提取效果不佳，需要纯化后再进行后续的试验。

2.反应体系和反应程序可以依据不同的厂家产品的要求来操作，但要保证扩增的特异性和扩增产物的浓度，以免影响后续的试验结果。

附图说明

图1是本发明的技术流程示意图。

图2是本发明用来检测PCR产物片段大小的琼脂糖凝胶电泳（泳道1-7分别代表不同黄牛个体的PCR扩增产物;M为Marker I，条带分别为100，200，300，400，500，600bp；）。

图3是本发明用来检测各样本突变情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳（自左至右泳道分别代表基因型AG、GG和AA的电泳带型）。

图4是本发明中PCR产物混合测序筛查到的黄牛GLI3基因序列8143位A-G突变测序结果图（黑色方框所指处为单核苷酸突变位置，自上至下分别为AA、AG和GG基因型的测序结果图）。

具体实施方式

本发明首先根据NCBI公布的GLI3基因序列（GenBankAccession No.NW 001494928）设计引物，分别以3个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析，筛选出与黄牛生长性状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

I地方黄牛品种GLI3基因部分DNA序列的克隆

1、黄牛样本采集

本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：河南南阳牛（175），陕西秦川牛（287），河南郏县红牛（140）；

表1黄牛样本的采集

2、基因组DNA的提取

参考文献Sambrock et al（2002）方法。

3、扩增引物设计

以NCBI数据库（hGGp://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的牛GLI3基因序列（GenBankAccessionNo.NW 001494928）为参考序列，利用Primer 5.0设计PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物：5’-CAGGGGAAAAGGATGGG-3’；

下游引物：5’-CGAGGTAAGTGCACATGC-3’；

该引物扩增了黄牛GLI3基因第1外显子区域。

4、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

灭菌超纯水（H₂0）	10.8μL
		2×Buffer(内含MT²⁺、dNTPs等)	12.5μL
引物P上游引物（10pmol/L）	0.5μL
		引物P下游引物（10pmol/L）	0.5μL
Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）	0.25μL
		DNA模板（50nT/μL）	0.45μL
总体积	25μL

PCR反应程序：

95℃预变性4min；

72℃延伸10min；

5、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

把以上3个品种PCR扩增产物混合送南京金斯瑞生物科技有限公司进行双向测序。对测序峰图进行分析发现如图3中的GA双峰，筛查到了黄牛GLI3基因的1个SNP多态性，位于黄牛GLI3基因第8143位。

II、黄牛GLI3基因多态性的PCR-SSCP检测

1、PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如前所述，PCR扩增产物的1.5%琼脂糖凝胶电泳图谱如图1所示，可以清晰的看到452bp的条带。

2、PCR-SSCP检测

对于PCR扩增后的产物首先分别用变性剂进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定其多态性。

300V电压电泳5min，200V电压电泳2.5h，银染检测电泳结果，用Bio-RAD凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型。

由于黄牛为二倍体动物，当发生突变时，可形成不同的基因型，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图来进行判别，如图4所示，将三种基因型区分开，根据条带的带型结合测序结果能够将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

III、本发明制备的分子标记在不同黄牛群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对187南阳牛、287份秦川牛、139份郏县红牛DNA样品分别进行丙烯酰胺凝胶电泳判定基因型。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝（2N_AA＋N_AA1＋N_AA2＋…＋N_AAi…＋N_AAn）/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_AAi表示群体中具有AAi基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。

统计结果见表4。表4列出了Gli3基因有三种基因型AA、GA和GG。4个群体中，该基因座都处于Hardy-Weinberg平衡状态，其中，中国3个黄牛群体的Gli3基因遗传多态性比较丰富，荷斯坦群体中未检测到多态个体。

表4中外不同牛品种Gli3基因不同基因型和等位基因频率

3、群体评判标准

②国外牛群体选择：AA型；（有1种基因型，无多态性）。

Claims

1.一种检测黄牛GLI3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，

(1)以包含GLI3基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛GLI3基因，

所述的引物对P为：

上游引物：5’-CAGGGGAAAAGGATGGG-3’；

下游引物：5’-CGAGGTAAGTGCACATGC-3’；

(2)用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(1)中PCR扩增产物片段大小；

(3)用变性剂处理步骤(1)中PCR扩增产物之后，再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛GLI3基因第8143位的单核苷酸多态性。

2.如权利要求1所述的检测黄牛GLI3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤(1)所述的PCR扩增反应程序为：

3.如权利要求1所述的检测黄牛GLI3基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

4.如权利要求1所述的检测黄牛GLI3基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5.如权利要求1所述的检测黄牛GLI3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛GLI3基因第8143位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为8143位为核苷酸A纯合；AG基因型表现为8143位为核苷酸A/G杂合；GG基因型表现为8143位为核苷酸G纯和；其中，单核苷酸多态性GG基因型为突变纯合基因型。

6.权利要求1-5中任意一权利要求所述的检测黄牛GLI3基因单核苷酸多态性的方法在鉴定不同黄牛群体多态性中的诊断应用。

7.权利要求6所述的应用，其特征在于用于中国黄牛肉用和生长性状的分子标记辅助选择中的应用。

8.一种检测中外不同牛群体的基因诊断试剂盒包括:

（1）特异引物，所述特性性引物包括

上游引物：5’-CAGGGGAAAAGGATGGG-3’；

下游引物：5’-CGAGGTAAGTGCACATGC-3’；

（2）生化试剂，所述生化试剂为

（3）操作说明书，所述操作说明书包括

PCR操作说明;

电泳检测与基因型判断；

待检个体的选择与淘汰；

注意事项。