CN111269994B - 一种利用普通牛y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用普通牛(Bos taurus)Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法。本发明利用基因组重测序结果，对主要肉牛和奶牛品种的Y染色体DNA序列进行扫描，发现了荷斯坦牛、红安格斯牛、夏洛来牛、盖普威牛、利木赞牛、西门塔尔牛、韩牛、海福特牛品种特有的Y染色体SNP位点，根据这些SNP位点在DNA水平上鉴别不同品种公牛，能有效用于上述各品种的引种及分子标记辅助育种，为快速建立遗传资源优良的普通牛种群奠定基础。

Description

一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP)鉴定公牛品种的方法，可用于引种和育种的分子标记辅助鉴别。
背景技术
单核苷酸多态(SNP，single nucleotide polymorphism)是同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差别的现象。相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同。人类基因组计划已经鉴别出了许多的SNPs，它是生物体基因组中存在最为广泛的一类变异，是由于单个核苷酸的插入、缺失、转换和颠换而引起的。
哺乳动物Y染色体雄性特异区(Male specific region,Y chromosome；MSY)在减数分裂时不与X染色体发生重组，因此呈典型的父系遗传，仅存在于雄性个体。Y-SNPs标记已广泛用于世界牛群的遗传多样性和起源研究，已有发现普通牛有2种Y染色体单倍型Y1和Y2(
Figure GDA0003688690960000011
et al.2005；Ginja et al.2010)，但由于SNP数目非常有限，不能用于牛品种区分。
发明内容
针对目前已有研究结果在普通牛(Bos taurus)上仅发现了数目有限的SNP位点，仅能将普通牛分为Y1和Y2这2个父系起源，不能精细的区分出各品种的问题，本发明提供一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
(1)从NCBI下载了311头公牛基因组重测序结果(包含海福特牛、夏洛莱牛、荷斯坦牛、瓦图西长角牛、红安格斯牛、安格斯牛、曼安茹牛、西门塔尔牛、盖普威牛、利木赞牛、皮尔蒙特牛、萨尔斯牛、金发阿基塔牛、德温牛、韩牛)，另有30头杂交公牛的基因组重测序结果做验证，以20头母牛序列做对照。
(2)基因组比对。用BWA软件将每一头公牛的重测序结果比对到牛参考基因组Btau5.0.1；
(3)用Samtools软件找出所有的SNP位点，再对位于Y染色体上的SNP位点进行过滤，标准如下：SNP必需只存在于公牛个体，所有母牛个体没有；SNP位点公牛个体均为纯合，保证其位于Y染色体单拷贝区。
(4)筛选各品种特有的单核苷酸突变位点。发现了荷斯坦奶牛、海福特牛、夏洛莱牛、红安格斯牛、盖普威牛、利木赞牛、西门塔尔牛和韩牛等牛品种特有的SNP位点。部分特有SNP在对应品种的频率为100％，在其他品种频率基本为0；部分SNP在对应品种的频率不到100％，但在其他品种频率为0。
(5)提取待鉴定公牛的基因组DNA，利用诸如测序法或SNP芯片方法对该基因组DNA在牛Y染色体参考基因组中各个特征SNP所对应的单核苷酸位点的多态性进行遍历检测，根据检测结果以及对应品种公牛特有的SNP位点，确定待鉴定公牛的品种。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过筛选不同品种公牛Y染色体上特有的SNP位点，利用这些SNP位点可以有效区分不同品种来源的公牛，可以用于种公牛品种(例如，利木赞牛、西门塔尔牛)鉴定、引种及分子标记辅助育种，为快速建立遗传资源优良的普通牛种群奠定基础。
附图说明
图1为本发明鉴定公牛品种的技术流程图(测序法)；
图2为本发明鉴定公牛品种的技术流程图(SNP芯片法)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明提供一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP)鉴定普通牛品种的方法。
首先，本发明利用DNA测序技术及生物信息学分析方法，结合311头公牛基因组重测序结果(包含海福特牛、夏洛莱牛、荷斯坦牛、瓦图西长角牛、红安格斯牛、安格斯牛、曼安茹牛、西门塔尔牛、盖普威牛、利木赞牛、皮尔蒙特牛、萨尔斯牛、金发阿基塔牛、德温牛、韩牛)，另有30头杂交公牛的基因组重测序结果做验证，以20头母牛序列做对照。用BWA软件将每一头公牛的重测序结果比对到牛参考基因组Btau5.0.1(NCBI版本号GCF_000003205.7)；用Samtools软件找出所有的SNP位点，再对位于Y染色体上的SNP位点进行过滤，标准如下：1)SNP必需只存在于公牛个体，所有母牛个体没有；2)SNP位点公牛个体均为纯合，保证其位于Y染色体单拷贝区。筛选各品种特有的单核苷酸突变位点(即特征SNP)。发现了荷斯坦奶牛、海福特牛、夏洛莱牛、红安格斯牛、盖普威牛、利木赞牛、西门塔尔牛和韩牛特有的SNP位点(即特征SNP)，参见表1。部分特征SNP在对应品种的频率为100％，在其他品种频率基本为0；部分特征SNP在对应品种的频率不到100％，但在其他品种频率为0。
表1不同公牛品种SNPs位点及其频率统计
Figure GDA0003688690960000031
表1中：
荷斯坦牛：有3个特有的SNP位点(即SNP1、SNP2、SNP3)，在荷斯坦牛中频率均为100％(46/46)，在其他牛品种频率基本为0。(除了1头(1/265)非洲的瓦图西长角牛中也存在)
红安格斯牛：有1个特有的SNP位点(即SNP4)，在红安格斯牛中的频率为97％(28/29)，在其他牛品种频率为0。
夏洛来牛：有2个特有的SNP位点(即SNP5、SNP6)，在夏洛来牛中频率为100％(26/26)，在其他牛品种频率基本为0。(除了1头(1/285)非洲的瓦图西长角牛中也存在)
盖普威牛：有2个特有的SNP位点(即SNP7、SNP8)，在盖普威牛中频率为100％(28/28)，在其他牛品种频率基本为0。(除了1头(1/283)非洲的瓦图西长角牛中也存在)
利木赞牛：有1个特有的SNP位点(即SNP9)，在利木赞牛中频率为100％(25/25)，在其他牛品中频率为0。
西门塔尔牛：有1个特有的SNP位点(即SNP10)，在西门塔尔牛中频率为100％(31/31)，在其他牛品种频率为0。
韩牛：有5个特有的SNP位点(即SNP11、SNP12、SNP13、SNP14、SNP15)，在韩牛中频率均为100％(30/30)，在其他牛品种频率均为0。
海福特牛：有1个特有的SNP位点(即SNP16)，在海福特牛频率为100％(27/27)，在其他牛品种频率均为0。
根据以上研究结果，可以利用表1中所列SNP位点区分不同品种来源的公牛，以下举例说明(血样采集自陕西杨凌西北农林科技大学畜牧教学试验基地、陕西杨凌秦宝牧业有限公司，2013年5月-2015年12月)。
例1、利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP)鉴定公牛品种的方法：DNA测序法
以鉴定荷斯坦公牛为例，利用牛Y染色体参考基因组序列，选择SNP1、SNP2和SNP3的一个或多个，两侧各延伸一定长度，以此为模板设计PCR扩增引物。以待测公牛基因组DNA为模板，母牛DNA为隐性对照，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序。然后利用DNASTAR软件将测序结果与参考基因组序列比对确认选择的SNP位点是参考碱基还是突变碱基，若为突变碱基则该牛为荷斯坦公牛，否则不是荷斯坦公牛，具体步骤如下，参见图1：
1)提取待测牛的基因组DNA；
2)扩增引物设计
利用牛Y染色体参考基因组序列，选择SNP1、SNP2和SNP3的一个或多个，两侧各延伸一定长度，以此为模板，使用Primer5.0等软件设计PCR扩增引物。
3)PCR扩增
以待测牛的基因组DNA为模板，母牛DNA为隐性对照，进行PCR扩增。母牛应不出现扩增条带，公牛有一条明亮的扩增条带。
4)PCR产物纯化
PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。
5)测序与分析
把以上待测牛PCR扩增产物送测序公司进行DNA测序。将测序结果与参考序列进行比对，若SNP的对应位点为突变碱基则该牛为荷斯坦公牛，否则不是荷斯坦公牛，从而实现鉴定该公牛的品种。
实验结果表明，该方法鉴定的准确性或一致性达到97％。
例2、利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP)鉴定公牛品种的方法：SNP芯片法
参见图2，具体步骤如下：
1)根据表1中每个SNP位点分别设计一段50bp的单链探针引物。
2)将这些引物按一定次序固定在芯片上。
3)将待测牛样本基因组DNA进行全基因组扩增。
4)将扩增产物用随机内切酶酶切片段化。
5)将DNA片段与芯片进行杂交，使基因组DNA酶切产物与探针特异性结合。
6)加入两种荧光标记的双脱氧三磷酸核苷酸(ddATP，ddGTP)进行单碱基延伸，只有与gDNA互补结合的探针才能得到延伸。
7)芯片清洗后进行扫描。
8)检测每个位点的荧光强度和波长，判定SNP分型结果。
实验结果表明，该方法鉴定的准确性或一致性达到95％，且利用该方法，可一次性检测多个待测样本，鉴定是否属于荷斯坦牛、红安格斯牛、夏洛莱牛、盖普威牛、利木赞牛、西门塔尔牛、韩牛或海福特牛。
总之，本发明是一种在DNA水平上鉴别不同品种公牛的方法，适用于快速鉴定荷斯坦牛、红安格斯牛、夏洛来牛、盖普威牛、利木赞牛、西门塔尔牛、韩牛、海福特牛等品种的公牛，能有效用于上述各品种的引种及分子标记辅助育种，也可用于上述牛品种的父系起源标记，为快速建立遗传资源优良的普通牛种群奠定基础。

Claims (8)

1.一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法，其特征在于：包括以下步骤：
提取待鉴定公牛的基因组DNA，对该基因组DNA在牛Y染色体参考基因组序列中各个与品种鉴定关联的特征SNP所对应的单核苷酸位点的多态性进行遍历检测，若检测到突变等位基因，则根据检出突变等位基因的位点确定待鉴定公牛的品种；
其中，所述公牛的品种为利木赞牛及西门塔尔牛；
所述利木赞牛的特征SNP定位在牛Y染色体参考基因组第9053955位，突变等位基因为碱基A；
所述西门塔尔牛的特征SNP定位在牛Y染色体参考基因组第7966557位，突变等位基因为碱基G；
所述牛Y染色体参考基因组选自Btau5.0.1，版本号GCF_000003205.7。
2.根据权利要求1所述一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法，其特征在于：利用牛Y染色体的遗传变异信息可以准确区分普通牛品种来源信息。
3.根据权利要求1所述一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法，其特征在于：根据对不同品种公牛的个体Y染色体重测序结果，确定对应品种公牛的特征SNP在牛Y染色体参考基因组序列中的位点信息。
4.根据权利要求1所述一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法，其特征在于：所述特征SNP的确定标准如下：SNP位点必需雄性特异；同时，公牛个体在SNP位点的基因型均为纯合，不存在杂合状态。
5.根据权利要求1所述一种利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法，其特征在于：所述遍历检测采用基于测序的基因分型方法或基于探针芯片的基因分型方法。
6.一种如权利要求1-5中任意一项所述的利用普通牛Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法在公牛引种分子标记辅助育种中的应用。
7.检测公牛的特征SNP的试剂在公牛引种分子标记辅助育种中的应用，其特征在于：所述公牛的品种为利木赞牛及西门塔尔牛；
所述利木赞牛的特征SNP定位在牛Y染色体参考基因组第9053955位，突变等位基因为碱基A；
所述西门塔尔牛的特征SNP定位在牛Y染色体参考基因组第7966557位，突变等位基因为碱基G；
所述牛Y染色体参考基因组选自Btau5.0.1，版本号GCF_000003205.7。
8.检测公牛的特征SNP的试剂在公牛父系起源标记中的应用，其特征在于：所述公牛的品种为利木赞牛及西门塔尔牛；
所述利木赞牛的特征SNP定位在牛Y染色体参考基因组第9053955位，突变等位基因为碱基A；
所述西门塔尔牛的特征SNP定位在牛Y染色体参考基因组第7966557位，突变等位基因为碱基G；
所述牛Y染色体参考基因组选自Btau5.0.1，版本号GCF_000003205.7。
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