CN103598146B - 一种利用全基因组选择和性控胚胎技术培育优良种公牛的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种采用全基因组选择和性控胚胎技术快速定向培育优良种公牛的方法，是通过运用全基因组选择、DHI测定技术和后裔测定技术选择优秀母牛和公牛分别作为卵母细胞和精液的供体，通过超数排卵、人工授精和胚胎收集过程从而获得大量具有相似遗传背景的优秀胚胎，再通过体外胚胎性别鉴定技术获得胚胎的性别特征，选择雄性胚胎进行胚胎移植、基因组育种值测定、CPI综合育种值测定和性状关联性分析，实现种公牛的快速繁育和定向培育。

Description

一种利用全基因组选择和性控胚胎技术培育优良种公牛的 方法

技术领域

本发明涉及一种采用全基因组选择和性控胚胎技术快速定向培育优良种公牛的方法，属于生物与新医药领域，具体方向是现代农业技术。

背景技术

基因组选择(Genomic Selection，GS)技术是一种基于常规奶牛遗传评估体系验证的资源群体，利用芯片技术采集资源群体高密度基因组SNP标记的分型结果，以性状育种值构建基础数据，估计各个SNP标记活单倍片段基因型的效应值的新的分子育种技术。它与传统的种公牛育种技术相比，优点在于可以测定性成熟前的青年个体，估计青年个体的基因组育种值，实现青年个体遗传素质的早期预测与选择，显著缩短育种年限。

性控胚胎技术是性控技术的重要组成部分。性控技术是指通过人为干预，使动物繁育按照人们所希望的性别繁殖后代的技术，在国内外已经进入商业化阶段，应用于牛、猪、马等哺乳动物。性控技术利用精子分离技术对动物进行受精，人为控制性别。目前，在奶牛的育种和繁殖领域，性控技术的产品主要包括性控精液和性控胚胎。性控精液的生产已完全产业化和商品化，国内外多数奶牛育种单位和奶牛场均实现性控冻精的推广应用。性控胚胎由于自身技术复杂和成本高昂，目前在奶牛场推广应用范围相对较小。但性控胚胎技术若应用于种质奶牛的培育，尤其是种公牛的培育，将具有很大的优越性。一方面，通过超数排卵，可以最大限度地实现对极少数顶级母牛遗传资源的充分利用。另一方面，性控胚胎可实现对后代的性别控制，可以根据育种需要选择优良遗传背景的雌性或雄性胚胎，人为控制扩繁育种核心群或培育优良种公牛。

本发明是将基因组选择技术与性控胚胎技术相结合形成的一套培育优良种公牛的新方法体系。该方法具有以下特点：(1)实现育种的早期性别控制；(2)后代具有可靠的生产性能和遗传基因背景；(3)一次可获得多个同性别的同胞后代，利于提高公牛遗传评估的准确性；(4)与常规的后裔测定技术相比，实现单性状及多性状的定向、精确育种。常规的后裔测定技术评估的是性状基因的表型，由于性状的多基因控制和基因表型易受环境因素影响，常存在表型值高的个体不一定能稳定遗传，表型值低的个体不一定是遗传素质差等问题，很难保证性状选育的稳定性，造成一头世界顶级的优秀种公牛后代伴随代次的增加，优良性状逐渐平庸。本发明致力于在基因型上提高性状的稳定性，理论上只要环境因素适宜，单性状或多性状的遗传素质便能得到稳定表达，相对提高性状的遗传力。(5)实现批量、快速培育种公牛，扩大良种资源的推广应用范围。每次获得的数十枚同胞性控雄性胚胎先进行部分移植，剩余的遗传资源以胚胎的形式可实现长期保存，待移植后代的性能得到肯定时，大量的储备资源可以进行快速推广利用。

发明内容

本发明是一种结合全基因组选择和性控胚胎技术快速定向培育优良种公牛的方法。

该发明提供的方法是通过运用全基因组选择技术、DHI测定技术和后裔测定技术选择优秀亲本，从基因水平和实际生产水平两方面保证供体卵母细胞和精液的遗传潜质，通过超数排卵、选配、胚胎体内发育和胚胎冲洗收集获得大量优质胚胎，再经过单模板PCR法，对胚胎进行性别鉴定，从而获得性控胚胎。根据育种需求移植相应的性控胚胎，用于育种核心群建设或种公牛培育工作。

其中，所述哺乳动物为奶牛，胚胎为奶牛胚胎。

所述胚胎性别的单模板PCR法鉴定体系和亲本的选种方法也属于本发明的保护范围。

本发明的方法能实现快速、批量培育优秀种公牛，实现单性状及多性状的定向、精确育种，并能显著提高后代公牛阳性率和种公牛育种稳定性和准确度。

附图说明

图1为授精后冲洗收集到的奶牛胚胎。

图2为胚胎性别鉴定电泳图。M：分子量marker(1kb DNA ladder)；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12：检测的胚胎样品编号。

图3为通过性控胚胎培育的优秀种公牛。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。

引物合成和DNA序列测定由invitrogen公司完成。

PG购于上海计划生育研究所。

FSH购于中国科学院动物研究所。

RNA提取试剂盒购于Qiagen公司。

Pfu DNA扩增酶、克隆载体、胶回收试剂盒购于Transgen公司。

克隆载体购于Transgen公司。

全基因选择芯片Illumina，2011a(LD，6909SNP)和Illumina，2011b(50K，54609SNP)购于Illumina公司。

限制性内切酶购于Takara公司。

酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

实施例1，亲本供体选择

按照一定的育种参数要求如综合育种性能在全世界排名前十名，根据父本的CPI／GCPI育种值、TPI／GTPI育种值和LPI／GLPI育种值，选择合适的精液供体。母本的选择根据母牛的DHI测定和线性鉴定结果，选择头胎305天产奶量≥12吨，乳蛋白率≥3.2％，乳脂肪≥3.6％，体型分≥85的高产奶牛，按照育种目标侧重点的异同，进行单性状排名，根据需要选择排名靠前的若干牛只进行全基因组检测，根据基因组检测和实际生产性能选择优秀的个体，作为卵母细胞的供体。

实施例2，制作优良性控胚胎

(一)超数排卵：供体母牛经两次PG同期发情处理，于第二次同期发情后9-13天开始超排，于第二次发情后8-12小时进行人工授精。FSH超排总剂量为8.4-8.8毫克(根据月龄、体重等确定不同剂量)，连续肌注4天，每天早晚各一次，剂量依次递减，超排第三天早晚各肌注PG一次。

(二)发情鉴定：发情鉴定采用外部观察和直肠触摸卵泡相结合，以直肠检查卵泡发良程度为主要依据。直肠触摸子宫、卵巢，判断其长短、粗细、质地。顺序是：手戴乳胶手套，涂以滑润剂，五指并拢伸入肛门，清除宿粪后，手掌伸平，掌心向下，在骨盆底的正中有一长而稍扁的棒状物为子宫颈。顺着子宫颈向前伸进，可摸到子宫角间沟，沟的两旁各有一条向前弯曲的圆筒状物，是左右子宫角，沿着子宫角大弯向下侧面摸，可摸到扁圆、柔软而有弹性的卵巢。用手指触摸卵巢表面的卵泡发育程度，以确定是否输精。

(三)人工输精：

(1)精液解冻：用长柄镊子从贮藏罐中取出细管后，直接放入38℃-40℃温水中解冻，全部融化后取出，擦干水，用专用剪刀剪开细管，套上外套管备用。

(2)人工输精：采用直肠把握输精法。输精前应先将待配母牛保定于配种架中，用温肥皂水将阴门附近的粪便、污物冲洗干净，然后用温水冲洗，用卫生纸擦干。输精员将手指甲剪短磨光，手臂套上乳胶手套，涂上一层润滑剂，五指并拢成锥形，插入直肠，排出粪便。隔着直肠壁握住子宫颈管。左手臂稍微下压，使阴门开张。右手持输精枪，由阴门缓缓插入，开始先稍向上斜插，避开尿道口，然后再向下平插至子宫颈口，将输精管前端深入子宫颈口内3cm-4cm(约2-3个皱壁)，将输精枪稍微后拉即可输精，输精后缓慢拔出输精管(枪)。

(四)胚胎收集

对配种或授精后的供体母畜，经过一段时间就要进行胚胎的收集。其具体操作方法是用配制好的冲卵液，借助特制的冲卵装置，把位于子宫或输卵管的胚胎冲洗出来，也称冲卵。之后，再进行胚胎质量检查。冲胚胎的时间一般在配种或授精后6～7天进行，这时的胚胎已发育到32细胞期以上。

冲卵方法为非手术法，先将冲卵管导入子宫角的适当位置，借助冲卵管外层的气球，固定冲卵管的位置并封闭冲卵部位，防止冲卵液流入生殖道。冲洗时，先将冲卵液注入子宫角封闭部位，经冲洗后再导出，反复进行。

实施例3，胚胎性别鉴定与冻存

收集到的优良胚胎(见附图1)，分别在显微操作仪下从胚胎内获取单细胞标本，放入标记好的PCR排管内，加入20微升含蛋白激酶K的裂解液进行细胞裂解，裂解程序为水浴55℃，5min，之后水浴95℃，5min。取好标本后的胚胎进行正常冷冻程序冻存，封存于细管内，最终在液氮里长期保存待用。

在牛的Y染色体上找到一段性别鉴定片段，利用Primer5软件设计性别鉴定引物一对如下：上游引物：5’-ctagctcgagatgttcagagtattgaacgacgatgt-3’，下游引物1：5’-gatcgcggccgcttcaatattgaaaataagcac-3’)，目的片段长度为690bp(附图2)。

PCR扩增条件40个循环，退火温度为65℃，DNA聚合酶为pfu DNA聚合酶，反应体系20微升，扩增程序详见pfu DNA聚合酶说明书。电泳条件为2％的琼脂糖凝胶，80U，35min。通过单细胞PCR扩增法获得的性别鉴定Y染色体阳性率为47.8％，性别鉴定的准确度为95％。(受单细胞样品DNA含量少的条件所限，约有2％的样品由于假阴性误判为雌性胚胎)

通过对目的片段的PCR扩增、电泳分离、克隆载体连接和测序，证实该片段在雄性胚胎细胞中为阳性、雌性胚胎细胞中为阴性。目的片段回收、质粒双酶切、克隆载体构建、PCR扩增和电泳等一系列过程(方法详见《分子克隆(第三版)》)。

实施例4，性控胚胎移植

(一)受体牛处理

使用前列腺素(PGF2α)一次肌注，诱导发情。给处于情期8～15d且直肠检查黄体的受体牛一次注射PGF2α。

(二)发情观察

根据母牛接受爬跨确认为发情、早、晚各观察30min发清情况。对发情牛需做直肠检查，以确认卵泡，次日上午或晚上做直肠检查确定是否排政若在发情后36h以后排卵的牛不能用作受体牛。

(三)胚胎移植

(1)受体牛检查：移植前直检黄体，其直径在11～15mm以上，黄体的手感性好，质地软而充实。

(2)受体牛的准备：将受体牛保定，清除粪便，肌注2％静松灵1ml或用2％的普鲁卡因3ml在1～2尾椎间硬膜外麻醉。清洗外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经酒精棉球消毒。

(3)器械准备：先将移植枪、抢头及金属保护外套消毒。

(4)胚胎解冻：胚胎细管从液氮内环状保护外套内取出后，空气中停留5秒钟，放置在35-38℃温水内水浴20秒。用纸擦干细管以便于抓牢细管从而将插头从细管上拧下。保留标签用于识别胚胎信息。胚胎细管放入移植枪内，戴好外套。

(5)胚胎移植术者用左手扒开外阴，右手持移植器插入阴道，然后左手伸进直肠，移植器到达子宫颈口时，右手用力将移植枪捅破外套填片，插入子宫颈。左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体例子宫角至大弯处，持移植器的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。

(6)妊娠诊断：采用直肠检查法，在移植后2个月开始检查。

实施例5批量定向选育优良种公牛

(一)移植的雄性胚胎，犊牛出生后做好牛号标记和饲养管理。移植性控胚胎58枚，妊娠27头，成活23头，均为雄性，性控胚胎的妊娠率达到46.5％，成活率达到39.6％。

(二)犊牛生长到6月龄时，选择生长发育优良个体，采血获取DNA样品，利用基因组检测芯片Illumina，2011a(LD，6909SNP)或Illumina，2011b(50K，54609SNP)进行基因组检测。

(三)按照检测结果对公牛进行排序，在18-24月龄选择GCPI育种值达到国家良种补贴标准的公牛进行精液生产，一方面可以提前2-3年实现冻精的提前销售，另一方面取少数冻精进行后裔测定工作，30月龄时完成体型鉴定工作，5岁时通过后裔测定值，计算出常规育种方法获得的CPI综合育种值。

(四)通过对公牛基因组育种值和CPI育种值的关联性分析，确定两个育种值之间各性状变量之间的相关性，选择获取优良种公牛(附图3)。

(五)根据育种需要，选择育种需求性状变量相关系数最高的胚胎后代组合做为育种突破口，移植大量的备用胚胎资源，同时引进和更新基因型库，从而在5-10年的短时间内形成种公牛稳定和定向的选育体系。

Claims (3)

1.一种采用全基因组选择和性控胚胎技术快速定向培育优良种公牛的方法，是通过运用全基因组选择、DHI测定技术和后裔测定技术选择优秀母牛和公牛分别作为卵母细胞和精液的供体，通过超数排卵、人工授精和胚胎收集过程从而获得大量具有相似遗传背景的优秀胚胎，再通过体外胚胎性别鉴定技术获得胚胎的性别特征，选择雄性胚胎进行胚胎移植、基因组育种值测定、CPI综合育种值测定和性状关联性分析，实现种公牛的快速繁育和定向培育；

其中，根据父本的CPI/GCPI育种值、TPI/GTPI育种值和LPI/GLPI育种值，选择合适的精液供体；母本的选择根据母牛的DHI测定和线性鉴定结果，选择头胎305天产奶量≥12吨，乳蛋白率≥3.2％，乳脂肪≥3.6％，体型分≥85的高产奶牛，按照育种目标侧重点的异同，进行单性状排名，根据需要选择排名靠前的若干牛只进行全基因组检测，根据基因组检测和实际生产性能选择优秀的个体，作为卵母细胞的供体；

体外胚胎性别鉴定具体包括：

在显微操作仪下从收集到的优良胚胎内获取单细胞标本，放入标记好的PCR排管内，加入20微升含蛋白激酶K的裂解液进行细胞裂解，裂解程序为水浴55℃，5min，之后水浴95℃，5min；取好标本后的胚胎进行正常冷冻程序冻存，封存于细管内，最终在液氮里长期保存待用；

在牛的Y染色体上找到一段性别鉴定片段，利用Primer5软件设计性别鉴定引物一对如下：上游引物：5’--ctagctcgagatgttcagagtattgaacgacgatgt-3’，下游引物：5’-gatcgcggccgcttcaatattgaaaataagcac-3’，目的片段长度为690bp；

PCR扩增条件40个循环，退火温度为65℃，DNA聚合酶为pfu DNA聚合酶，反应体系20微升；电泳条件为2％的琼脂糖凝胶，80U，35min，通过单细胞PCR扩增法获得的性别鉴定Y染色体阳性率为47.8％，性别鉴定的准确度为95％；通过对目的片段的PCR扩增、电泳分离、克隆载体连接和测序，证实该片段在雄性胚胎细胞中为阳性、雌性胚胎细胞中为阴性。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于实现种公牛早期培育的性别控制，采用细胞生物学和分子生物方法对早期胚胎进行性别控制，具体方法为：人工受精6-7天后，在体内发育到32细胞期(桑椹胚)和64细胞期(囊胚)的胚胎，通过体内冲洗获得含有大量胚胎的悬液，在无菌条件下通过体视显微镜收集发育良好的胚胎，再通过显微操作仪从胚胎的胚团细胞内吸取1个细胞用做分子生物学检测胚胎性别的原料，对应的胚胎编号后进行胚胎的细管分装和冻存工作，运用单模板PCR法对胚胎进行性别鉴定。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于胚胎后代具有来自生产和遗传两方面可靠的遗传潜质，胚胎的父本和母本通过全基因组检测、生产性能测定、后裔测定和线性鉴定，实现了对亲本自身遗传素质和生产性能的双重肯定，保证胚胎后代具有较高的选育起点。