CN109258621A - 一种羊冻精生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及精液保存的技术领域，特别是涉及一种羊冻精生产工艺，其可以规范生产流程，减少其他因素的影响，提高冷冻效果，使生产出的羊冻精在解冻后活性较高，提高母羊的受孕率，同时可以提高生产出的羊羔的品质；包括以下步骤：(1)选择种公羊；(2)种公羊前处理；(3)器械消毒；(4)采精；(5)精液检测；(6)配制稀释液；(7)精液稀释；(8)细管包装；(9)降温平衡和冷冻；(10)封装；(11)冷冻后活力检测；(12)冷冻精液的保存；(13)定期抽检。

Description

一种羊冻精生产工艺
技术领域
本发明涉及精液保存的技术领域，特别是涉及一种羊冻精生产工艺。
背景技术
全国养羊大致分为南方和北方两个区域，近几年来，随着市场经济的发展和人民生活水平的日益提高，南方养羊发展速度日益加快，养羊生产逐步迈入规模化，科学化和产业化，养羊生产周期短，繁殖快、效益较好，备受广大农牧民的青睐，发展态势良好，羊肉比起其他肉类的人均消费量还存在着巨大的潜力，因此，养羊生产有着美好的广阔前景。
羊的配种方法常用的有两种，即自然配种和人工授精，人工授精是在羊的自然交配的基础上，为了提高种公羊的利用率，加速品种改良而建立起来的人工繁殖技术，人工授精就是利用适当的器械采集种公羊的精液，经过质量检查、稀释和保存，将合格的精液再用器械适时地输入发情母羊的生殖道内，以代替公母羊直接交配而使其受孕的方法，在羊的繁殖上具有多方面的优越性，一是人工授精能最大限度的发挥公羊的利用价值，提高公羊的配种效能；而是能对配种种公羊进行严格的选择，加速动物品种的改良；三是避免了公母畜的直接接触，可以防止各种疾病，特别是生殖道传染病的传播；四是可以提高母羊的受胎率；五是可以减少公羊的饲养头数，节约费用，降低饲养成本；六是公母羊配种可以不受时间和地点的限制；七是可以促进其他繁殖技术诸如同期发情、超数排卵、体外受精、胚胎移植、精子性别鉴定和基因导入等技术的发展。
现有的人工授精技术所使用的羊冻精在生产过程中，由于生产流程不规范，极易受到其他因素的影响，出现冷冻效果不好，并且生产出的羊冻精在解冻后明显活性较低，使母羊的受孕率极低，生产出的羊羔品质较差等情况。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种可以规范生产流程，减少其他因素的影响，提高冷冻效果，使生产出的羊冻精在解冻后活性较高，提高母羊的受孕率，同时可以提高生产出的羊羔的品质的羊冻精生产工艺。
本发明的一种羊冻精生产工艺，包括以下步骤：
(1)选择种公羊：选择营养合理、体质健康、性欲旺盛和精液品质良好的公羊作为种公羊；
(2)种公羊前处理：保持种公羊羊体清洁，并用温水冲洗阴茎和包皮，剪掉过长的阴毛，再用生理盐水冲洗干净；
(3)器械消毒：对整个过程中所使用的所有器械进行充分的消毒备用；
(4)采精：采精人员使用假阴道对前处理后的种公羊进行采精，并将采集的精液送检；
(5)精液检测：对采集的精液进行外观评定和活力及前向运动评定；
(6)配制稀释液：选择Egg yolk-free concentrated medium for bull semen作为稀释原液，并将稀释原液与蒸馏水按照体积比1:4混合得到稀释液，并将配制后的稀释液放入30℃的恒温箱内进行预热；
(7)精液稀释：采用精子密度仪测定精液密度，并计算稀释倍数，使用稀释液对精液进行稀释，摇匀后，再次测定精液的活力及前向运动数值并记录；
(8)细管包装：将精液摇匀后在4℃的恒温箱采用0.25ml的细管进行灌装，灌装完成后挑出空管或没吸满的细管；
(9)降温平衡和冷冻：待细管温度降至4℃后，将其放入4℃的恒温容器内平衡2-4h，平衡后将细管上架，并迅速放入4℃的冷冻仪，冷冻仪按电脑预先设定好的冷冻曲线程序自动完成冷冻过程；
(10)封装：当细管温度降至-140℃时，将冻制好的细管冻精取出迅速放入液氮中待检，符合检测标准后将检测合格后的以25支包装单位装入特制的塑料拇指管内；
(11)冷冻后活力检测：将冻制好的细管精液抽样在38℃下解冻10s，并将细管擦干，取细管中间部分精液滴在载玻片上进行镜检，检测其精子活力，当其直线运动精子数≥800万个时，即为合格，合格入库保存；
(12)冷冻精液的保存：抽样检测合格后，将拇指管置于棉布袋内，并贴上标签，转移至液氮管中保存，每周定时添加液氮，每年更换液氮；
(13)定期抽检：定期抽查精液品质，每次取冻精时，冻精脱离液氮的时间要＜10s。
本发明的一种羊冻精生产工艺，所述步骤(5)中的外观评定包括射精量评定、云雾运动评定、pH评定、色泽评定、精液的气味评定和畸形率评定。
本发明的一种羊冻精生产工艺，所述射精量评定只需将精液倒入有刻度的玻璃管中观察即可，所述云雾运动评定是用肉眼观察新采的种公羊精液，精子的密度越大，活力越强者，其云雾状越明显，所述pH评定为测定羊精液的pH，正常情况下羊精液的pH呈弱酸性，一般为6.5-6.9，所述色泽评定和气味评定是对羊的精液颜色和气味进行评定，羊的正常精液呈乳白色或乳黄色，若有异常的颜色和气味时，则应弃去，所述畸形率评定为将精液做成抹片并染色后在显微镜下观察，计数畸形精子数并计算精子畸形率，当畸形率＜14％为合格。
本发明的一种羊冻精生产工艺，所述步骤(5)中的活力及前向运动评定包括以下步骤：
a、取10μl精液置于样品管中，加入390μl稀释液，混合均匀；
b、在显微镜下观察，利用CEROSII计算机辅助精子分析系统初步测定精液的活力值及前向运动；
c、留取精液活力大于0.7，前向运动大于0.5的精液备用。
本发明的一种羊冻精生产工艺，所述步骤(7)中的使用稀释液对精液进行稀释包括以下步骤：
a、控制稀释处理室内温度为25℃-30℃；
b、调整稀释液和精液的温度均为25℃-30℃；
c、按照1:1的比例将稀释液沿精液瓶壁缓慢倒入精液内，稀释后将盛放精液的容器轻轻转动，使其混合均匀；
d、稀释后立即镜检存活率。
本发明的一种羊冻精生产工艺，所述步骤(9)中的冷冻曲线包括以下部分：4℃，5min；4至-20℃，10，min；-20至-100℃，60min；-100至140℃，30min。
本发明的一种羊冻精生产工艺，所述步骤(10)中的检测标准为：活力大于0.6，前向运动大于0.45。
与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明的一种羊冻精生产工艺在生产过程中可以规范生产流程，减少其他因素的影响，采用冷冻仪冷冻曲线逐渐冷冻的方法可以提高冷冻效果，经检测使生产出的羊冻精在解冻后活性较高，同时由于其解冻后活性较高，相比于现有的技术来说，可以提高母羊的受孕率，同时其生产处的羔羊与正常受孕产出的羔羊相比无明显差异，与现有的羊冻精受孕后生产处的羔羊相比，可以提高生产出的羊羔的品质。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
选择营养合理、体质健康、性欲旺盛和精液品质良好的公羊作为种公羊，保持种公羊羊体清洁，并用温水冲洗阴茎和包皮，剪掉过长的阴毛，再用生理盐水冲洗干净，对整个过程中所使用的所有器械进行充分的消毒备用，采精人员使用假阴道对前处理后的种公羊进行采精，并将采集的精液送检；
对采集的精液进行外观评定和活力及前向运动评定：外观评定包括射精量评定、云雾运动评定、pH评定、色泽评定、精液的气味评定和畸形率评定。
射精量评定只需将精液倒入有刻度的玻璃管中观察即可；
云雾运动评定是用肉眼观察新采的种公羊精液，精子的密度越大，活力越强者，其云雾状越明显；
pH评定为测定羊精液的pH，正常情况下羊精液的pH呈弱酸性，一般为6.5-6.9；
色泽评定和气味评定是对羊的精液颜色和气味进行评定，羊的正常精液呈乳白色或乳黄色，若有异常的颜色和气味时，则应弃去；
畸形率评定为将精液做成抹片并染色后在显微镜下观察，计数畸形精子数并计算精子畸形率，当畸形率＜14％为合格。
取10μl精液置于样品管中，加入390μl稀释液，混合均匀，在显微镜下观察，利用CEROSII计算机辅助精子分析系统初步测定精液的活力值及前向运动，留取精液活力大于0.7，前向运动大于0.5的精液备用。
选择Egg yolk-free concentrated medium for bull semen作为稀释原液，并将稀释原液与蒸馏水按照体积比1:4混合得到稀释液，并将配制后的稀释液放入30℃的恒温箱内进行预热，采用精子密度仪测定精液密度，并计算稀释倍数，控制稀释处理室内温度为25℃-30℃，调整稀释液和精液的温度均为25℃-30℃，按照1:1的比例将稀释液沿精液瓶壁缓慢倒入精液内，稀释后将盛放精液的容器轻轻转动，使其混合均匀，稀释后立即镜检存活率。
将精液摇匀后在4℃的恒温箱采用0.25ml的细管进行灌装，灌装完成后挑出空管或没吸满的细管，待细管温度降至4℃后，将其放入4℃的恒温容器内平衡2-4h，平衡后将细管上架，并迅速放入4℃的冷冻仪，冷冻仪按4℃，5min；4至-20℃，10，min；-20至-100℃，60min；-100至140℃，30min自动完成冷冻过程，当细管温度降至-140℃时，将冻制好的细管冻精取出迅速放入液氮中待检，符合活力大于0.6，前向运动大于0.45的以25支包装单位装入特制的塑料拇指管内；
将冻制好的细管精液抽样在38℃下解冻10s，并将细管擦干，取细管中间部分精液滴在载玻片上进行镜检，检测其精子活力，当其直线运动精子数≥800万个时，即为合格，合格入库保存，抽样检测合格后，将拇指管置于棉布袋内，并贴上标签，转移至液氮管中保存，每周定时添加液氮，每年更换液氮，定期抽查精液品质，每次取冻精时，冻精脱离液氮的时间要＜10s。
本发明制作的羊冻精的各项指标如下：
采精羊编号 1 2 3
采精量 5ml 3.6ml 4,2ml
原精液活力 0.92 0.9 0.94
原精液前向运动 0.65 0.67 0.62
原精液畸形率 10.5％ 9.2％ 9.9％
解冻后活力 0.69 0.71 0.72
解冻后前向运动 0.43 0.49 0.45
解冻后畸形率 12.9％ 13.1％ 12.9％
取100只身体健康状况良好的受体母羊作为样本，在其发情后12-24h内将本发明生产处的羊冻精解冻后，采用输精器插入子宫颈口内1-2cm后将解冻后的精液输入受体母羊体内，输精完成后把母羊臀部抬高，或在母羊背部轻拍几下，刺激平滑肌收缩，使精液快速流入子宫深部。
经过一段时间后检测100只受体母羊的妊娠反应，测得受精率＞80％，并且产得的羔羊与种公羊和受体母羊直接交配生产处的羔羊相比无明显差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种羊冻精生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择种公羊：选择营养合理、体质健康、性欲旺盛和精液品质良好的公羊作为种公羊；
(2)种公羊前处理：保持种公羊羊体清洁，并用温水冲洗阴茎和包皮，剪掉过长的阴毛，再用生理盐水冲洗干净；
(3)器械消毒：对整个过程中所使用的所有器械进行充分的消毒备用；
(4)采精：采精人员使用假阴道对前处理后的种公羊进行采精，并将采集的精液送检；
(5)精液检测：对采集的精液进行外观评定和活力及前向运动评定；
(6)配制稀释液：选择Egg yolk-free concentrated medium for bull semen作为稀释原液，并将稀释原液与蒸馏水按照体积比1:4混合得到稀释液，并将配制后的稀释液放入30℃的恒温箱内进行预热；
(7)精液稀释：采用精子密度仪测定精液密度，并计算稀释倍数，使用稀释液对精液进行稀释，摇匀后，再次测定精液的活力及前向运动数值并记录；
(8)细管包装：将精液摇匀后在4℃的恒温箱采用0.25ml的细管进行灌装，灌装完成后挑出空管或没吸满的细管；
(9)降温平衡和冷冻：待细管温度降至4℃后，将其放入4℃的恒温容器内平衡2-4h，平衡后将细管上架，并迅速放入4℃的冷冻仪，冷冻仪按电脑预先设定好的冷冻曲线程序自动完成冷冻过程；
(10)封装：当细管温度降至-140℃时，将冻制好的细管冻精取出迅速放入液氮中待检，符合检测标准后将检测合格后的以25支包装单位装入特制的塑料拇指管内；
(11)冷冻后活力检测：将冻制好的细管精液抽样在38℃下解冻10s，并将细管擦干，取细管中间部分精液滴在载玻片上进行镜检，检测其精子活力，当其直线运动精子数≥800万个时，即为合格，合格入库保存；
(12)冷冻精液的保存：抽样检测合格后，将拇指管置于棉布袋内，并贴上标签，转移至液氮管中保存，每周定时添加液氮，每年更换液氮；
(13)定期抽检：定期抽查精液品质，每次取冻精时，冻精脱离液氮的时间要＜10s。
2.如权利要求1所述的一种羊冻精生产工艺，其特征在于，所述步骤(5)中的外观评定包括射精量评定、云雾运动评定、pH评定、色泽评定、精液的气味评定和畸形率评定。
3.如权利要求2所述的一种羊冻精生产工艺，其特征在于，所述射精量评定只需将精液倒入有刻度的玻璃管中观察即可，所述云雾运动评定是用肉眼观察新采的种公羊精液，精子的密度越大，活力越强者，其云雾状越明显，所述pH评定为测定羊精液的pH，正常情况下羊精液的pH呈弱酸性，一般为6.5-6.9，所述色泽评定和气味评定是对羊的精液颜色和气味进行评定，羊的正常精液呈乳白色或乳黄色，若有异常的颜色和气味时，则应弃去，所述畸形率评定为将精液做成抹片并染色后在显微镜下观察，计数畸形精子数并计算精子畸形率，当畸形率＜14％为合格。
4.如权利要求1所述的一种羊冻精生产工艺，其特征在于，所述步骤(5)中的活力及前向运动评定包括以下步骤：
a、取10μl精液置于样品管中，加入390μl稀释液，混合均匀；
b、在显微镜下观察，利用CEROSII计算机辅助精子分析系统初步测定精液的活力值及前向运动；
c、留取精液活力大于0.7，前向运动大于0.5的精液备用。
5.如权利要求1所述的一种羊冻精生产工艺，其特征在于，所述步骤(7)中的使用稀释液对精液进行稀释包括以下步骤：
a、控制稀释处理室内温度为25℃-30℃；
b、调整稀释液和精液的温度均为25℃-30℃；
c、按照1:1的比例将稀释液沿精液瓶壁缓慢倒入精液内，稀释后将盛放精液的容器轻轻转动，使其混合均匀；
d、稀释后立即镜检存活率。
6.如权利要求1所述的一种羊冻精生产工艺，其特征在于，所述步骤(9)中的冷冻曲线包括以下部分：4℃，5min；4至-20℃，10，min；-20至-100℃，60min；-100至140℃，30min。
7.如权利要求1所述的一种羊冻精生产工艺，其特征在于，所述步骤(10)中的检测标准为：活力大于0.6，前向运动大于0.45。
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