CN114027293A - 一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法，包括：对实验室、采精设备、稀释液、稀释精液所用设备进行消毒；同时，给予公羊充足的营养，并采集精液；对采集的精液进行评估，选择符合国标GB 20557‑2006要求的合格精液；对合格精液与稀释液于28‑32℃水浴锅内同温水浴3‑5min，然后将稀释后的精液于室温环境下进行分装，然后放入4‑5℃环境中，平衡2‑3h；对平衡和分装后的精子进行评估，若精子正常，进行液氮熏蒸，得细管冷冻精子。

Description

一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法

技术领域

本发明涉及家畜精子冷冻技术领域，更具体地说是涉及一种利用细管冻精法对绒山羊精子进行冷冻的方法。

背景技术

精液冷冻保存已成为建立遗传资源库的重要策略，不需要大量长时间饲养公羊，大大降低了成本。此外，这项技术有助于人工授精的推广，使人工授精不受操作时间和地点的限制。目前，动物精液冷冻保存已经应用于日常畜牧业当中，建立方便高效的精液冷冻保存方法有利于动物遗传资源的长期保存和人工授精在畜牧业生产中的推广。

绒山羊精液的冷冻保存主要有颗粒冻精和细管冻精两种方式，但颗粒冻精需要解冻液来解冻和复苏，会增加精液污染的风险；另外，颗粒冻精长期保存表面容易剥落，极易造成普遍污染和品种混杂现象，对受胎率造成直接影响。而细管冻精有外包装，可长期保存，不容易造成污染且在生产实践中方便使用。细管冻精机械化生产极为方便，多采用自动细管冻精分装装置，程序化降温冷冻仪，但这些设备贵重，需要专业人员操作，并且很多家畜的养殖环境不适宜使用大型、贵重设备。

因此，如何提供一种操作简便且精液冻融后精子成活率高的绒山羊精子冷冻方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法，详细描述了其操作过程及液氮熏蒸盒，冻精吸管的制作和使用方法，操作方便，不需要贵重的仪器设备，适宜在畜牧业生产中推广应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法，包括下述过程：

1)冷冻前准备：对实验室、采精设备、稀释液、稀释精液所用设备进行消毒；同时，给予公羊充足的营养，并采集精液；

2)鲜精评估：对采集的精液进行评估，选择符合国标GB 20557-2006要求的合格精液；

3)精液稀释：对合格精液与稀释液置于28-32℃水浴锅内同温水浴3-5min，然后以一次稀释法对合格精液进行稀释；

4)分装：将稀释后的精液于室温环境下进行分装，然后放入4-5℃环境中，平衡2-3h；

5)液氮熏蒸：对平衡和分装后的精子进行评估，若精子正常，进行液氮熏蒸，得细管冷冻精子。

作为上述技术方案优选的技术方案，步骤1)中，所述采集精液为至少在采集前两天对公羊排精1-2次，然后以假阴道采集精液。

作为上述技术方案优选的技术方案，步骤1)中，所述稀释液在0-5℃冰箱中保存不超过72h。

作为上述技术方案优选的技术方案，步骤2)中，所述合格精液为色泽乳白色或淡黄色精液、活力≥65％、密度≥6×10⁸个/ml、畸形率≤15％的精液。

作为上述技术方案优选的技术方案，步骤3)中，所述一次稀释法为：将稀释液与合格精液按照1:4的体积分装，并将稀释液的1/4缓慢加入到合格精液中，混合均匀；然后，同温放置5min后，将剩下3/4的稀释液加入到稀释后的精液中，混匀。

作为上述技术方案优选的技术方案，步骤4)中，所述分装为采用冻精吸管进行分装。

作为上述技术方案优选的技术方案，步骤5)中，所述评估为使用相差显微镜400倍和37℃温载玻片对精子活力进行主观评估，如果精子活力正常，进入下一步液氮熏蒸。

作为上述技术方案优选的技术方案，步骤5)中，所述液氮熏蒸为：将液氮注入液氮熏蒸盒中，将平衡后的冻精细管平铺在网面上，距离液氮面4cm处熏蒸8-10min，熏蒸结束后迅速将细管移入液氮中，收集于塑料管与纱布袋中，做好标记，投入液氮罐中保存。

作为上述技术方案优选的技术方案，还包括：

6)保存：细管冻精在使用之前要完全浸入液氮中，根据液氮罐的消耗情况及时补充液氮，并放置在阴凉、通风、干燥的室内。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明科学合理，流程清晰，自制设备简单耐用，经济适用，无需贵重精密仪器，且制作的绒山羊细管冻精符合国标要求，很适合在牧区以进行推广使用。利用此发明制作的绒山羊细管冻精，可以长期保存，进行异地人工授精，大大减少养殖成本，同时得到了很好的保存效果，在实际生产具有很好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的冻精吸管的结构示意图；

图2附图为本发明提供的液氮熏蒸盒的结构示意图；

图3附图为本发明提供的平衡后的冻精细管放置于液氮熏蒸盒网面上，熏蒸8-10min过程中的降温曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

试验动物

选择了8只种质优良的绒山羊种公羊(年龄2～4岁)作为试验对象，膘情适中且无疾病史。采精前(>2d)对所有公羊排精1次，体积约在0.5ml～1.5ml，鲜精符合国标要求且无配种能力低的公羊。

材料与方法

本次所用试验试剂均购自Sigma-Aldrich，冻精细管和细管封口粉购自IMVTechnologies。

设备

自制冻精吸管，如图1；自制熏蒸盒，如图2；

稀释液为市售

清洗与消毒

对所有采精设备、稀释液以及稀释精液所用器具进行严格清洗消毒。

冷冻技术程序

(1)采集精液：首先将发情母羊固定，让公羊空爬1～2次，然后用假阴道(内胎温度38℃～40℃)采集精液。

(2)鲜精评估：选择乳白色或淡黄色精液(体积大于0.8ml，活力≥75％，密度≥1×10⁹个/ml，畸形率≤15％)，将其混合处理，以消除个体差异，并取一滴(20μL)检测精液品质；取一定量的混合精液和稀释液同时置于34℃水浴锅内短暂同温处理，按1:4进行稀释。

(3)精液稀释：将稀释液与合格精液按照1:4的体积分装，并将稀释液的1/4缓慢加入到合格精液中，混合均匀；然后，同温放置5min后，将剩下3/4的稀释液加入到稀释后的精液中，混匀。

(4)细管精液分装：用0.25ml冻精细管在室温环境下进行分装，分装的精液量≥0.2ml，然后用封口粉将无海绵塞一端封口。

(5)降温平衡：将分装后的冻精细管用8层纱布包裹平放入冰箱中(避光)，逐渐降温至4℃～5℃，并在此环境下继续平衡3h。

(6)平衡后精子活力评估：平衡后使用相差显微镜(400倍)和温载玻片(37℃)对精子活力进行主观评估。

(7)液氮熏蒸：将液氮注入自制液氮熏蒸盒的刻度线，冻精细管平铺在网面上，距离液氮面4cm处熏蒸8min，熏蒸结束后迅速将细管移入液氮中，收集于塑料管与纱布袋中，做好标记，投入液氮罐中保存。

(8)冻精评估：随机取冻精细管1～2支，放入37℃水浴锅中解冻15s，然后进行精液品质检测。

精液评估方法如下：

精液评估方法

精子体积

用带有刻度的集精杯直接读取精液体积。

色泽

山羊的精液正常呈乳白色或浅乳黄色，如果颜色异常，应该弃掉。

精子密度

用血细胞计数法测定每毫升中精子数量，将20μL原精液用3％NaCl溶液稀释100倍。在200倍镜下计数计数室5个大方格(四个角和中间处)内精子总数N，将该数乘以500万，最终精子数＝5×10⁶N个/ml。

精子活力

用稀释液将原精液加以稀释，取一滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于37℃显微镜恒温台上，在200～400倍下观察每个精液样本3视野下的运动状态，主观评估范围为0％至100％。

精子畸形率

精液中畸形精子数占精子总数的百分比，将精液样本用稀释液稀释100倍，取一滴制成抹片。自然干燥后，用95％的酒精固定3min，然后用伊红染色5min，再经水洗，自然风干后用相差显微镜观察，计数200个精子计算出精子畸形率。

精子活率

精子活率检测用伊红-苯胺黑法检测，简单来说，取20μL精液与等量伊红-苯胺黑(2:3)混合，然后制成涂片，重复至少两次，风干后直接观察，在1000倍油镜下计数200个精子计算出精子活率，白色的精子(没有被染色)归为活精子，那些显示出任何粉色或红色的精子被归为死精子。

本发明实例中所有精液在以下3个时间点进行评估：采精后、平衡后及解冻后。在整个制作过程中由同一名研究人员进行操作。评估结果如下：

表1本发明实施实例中所用公羊精液品质

注：2、7、8号公羊精液不合格。

表2本发明所述细管冻精制作效果分析

本发明的方法解冻后的精子参数均高于国标要求，可用于人工授精和种质资源保存。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法，其特征在于，包括下述过程：

1)冷冻前准备：对实验室、采精设备、稀释液、稀释精液所用设备进行消毒；同时，给予公羊充足的营养，并采集精液；

2)鲜精评估：对采集的精液进行评估，选择符合国标GB 20557-2006要求的合格精液；

3)精液稀释：对合格精液与稀释液置于28-32℃水浴锅内同温水浴3-5min，然后以一次稀释法对合格精液进行稀释；

4)分装：将稀释后的精液于室温环境下进行分装，然后放入4-5℃环境中，平衡2-3h；

5)液氮熏蒸：对平衡和分装后的精子进行评估，若精子正常，进行液氮熏蒸，得细管冷冻精子。

2.根据权利要求1所述的一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法，其特征在于，步骤1)中，所述采集精液为至少在采集前两天对雄性动物排精1-2次，然后以假阴道采集精液。

3.根据权利要求2所述的一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法，其特征在于，步骤1)中，所述稀释液在0-5℃冰箱中保存不超过72h。

4.根据权利要求3所述的一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法，其特征在于，步骤2)中，所述合格精液为色泽乳白色或淡黄色精液、活力≥65％、密度≥6×10⁸个/ml、畸形率≤15％的精液。

5.根据权利要求4所述的一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法，其特征在于，步骤3)中，所述一次稀释法为：将稀释液与合格精液按照1:4的体积分装，并将稀释液的1/4缓慢加入到合格精液中，混合均匀；然后，同温放置5min后，将剩下3/4的稀释液加入到稀释后的精液中，混匀。

6.根据权利要求5所述的一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法，其特征在于，步骤4)中，所述分装为采用冻精吸管进行分装。

7.根据权利要求6所述的，其特征在于，步骤5)中，所述评估为使用相差显微镜400倍和37℃温载玻片对精子活力进行主观评估，如果精子活力正常，进入下一步液氮熏蒸。

8.根据权利要求7所述的一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法，其特征在于，步骤5)中，所述液氮熏蒸为：将液氮注入液氮熏蒸盒中，将平衡后的冻精细管平铺在网面上，距离液氮面4cm处熏蒸8-10min，熏蒸结束后迅速将细管移入液氮中，收集于塑料管与纱布袋中，做好标记，投入液氮罐中保存。

9.根据权利要求1-8任一所述的一种绒山羊细管冻精简易冷冻方法，其特征在于，还包括：

6)保存：细管冻精在使用之前要完全浸入液氮中，根据液氮罐的消耗情况及时补充液氮，并放置在阴凉、通风、干燥的室内。

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